COLO 205
Erfolgreiche Zellkultur:
* Bitte lesen Sie die folgenden wichtigen technischen Informationen, bevor Sie mit ECACC-gelieferten Zelllinien* umgehen. Diese Informationen sind auch als PDF in unserem Hauptmenü unter ‘Kundensupport’ verfügbar (hier klicken).
Lagerung von gefrorenen Zellen
Gefrorene Ampullen sollten nach Erhalt unverzüglich direkt in gasförmigen oder flüssigen Stickstoff überführt werden, es sei denn, sie sollen sofort verwendet werden. Verwenden Sie KEINEN Gefrierschrank bei -80 ° C als Alternative, da dies zu einem Verlust der Lebensfähigkeit führt.
Wie man gefrorene Zellen auf Empfang behandelt
Nach Erhalt einer Sendung gefrorener ECACC-gelieferter Zelllinien ist es wichtig, dass der Endbenutzer die Sendung unverzüglich beachtet. Die den Zelllinien beigefügten technischen Ratschläge sollten konsultiert werden, bevor Ampullen aus dem Trockeneis genommen werden. Die korrekte Handhabung unmittelbar nach Erhalt ist entscheidend für die erfolgreiche Etablierung der Zelllinie im Labor des Endbenutzers.
Zum Zeitpunkt der Bestellung einer Zelllinie sollten Endbenutzer auch die Kulturbedingungen für die neue Zelllinie berücksichtigen und sicherstellen, dass das geeignete Medium verfügbar ist, wenn die Zellen eintreffen.
Bedeutung der Zellzählung
Führen Sie eine lebensfähige Zellzahl durch, wenn Sie Zellkulturen wiederbeleben und ernten. Einer der häufigsten Gründe für das Versagen, Zellen in Kultur zu etablieren, ist die Verwendung einer falschen lebensfähigen Zellsaatdichte zum Zeitpunkt der Reanimation, d. H. Zu niedrige oder zu hohe Aussaat von Zellen. Dies kann vermieden werden, indem eine lebensfähige Zellzahl durchgeführt und die empfohlene Aussaatdichte eingehalten wird.
Für die spezifische Zelllinie, mit der Sie arbeiten, lesen Sie die Informationen unter der Registerkarte ‘Beschreibung’ auf unserer Website. Diese Informationen finden Sie auch im Zelllinien-Datenblatt, das Ihnen als Ausdruck mit Ihrer Zelllinien-Sendung zur Verfügung gestellt wird. Die Aussaatdichte wird in den Informationen zur Subkulturroutine angezeigt. Verwenden Sie bei der Aussaat von Zellen unmittelbar nach der Reanimation das mittlere bis obere Ende des angegebenen Aussaatdichtebereichs.
Wiederbelebung gefrorener Zellen
Es ist wichtig, gefrorene Ampullen sorgfältig zu behandeln; Tragen Sie einen Laborkittel, eine Vollschutzmaske und Handschuhe. In seltenen Fällen können Ampullen beim Erwärmen aufgrund der Ausdehnung des eingeschlossenen flüssigen Reststickstoffs explodieren.
1. Halten Sie in einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank ein in 70% igem Alkohol getränktes Taschentuch um die Kappe der gefrorenen Ampulle. Drehen Sie die Kappe um eine Vierteldrehung, um eventuell eingeschlossenen Reststickstoff freizusetzen. Ziehen Sie die Kappe wieder fest. Übertragen Sie die Ampulle schnell in ein 37oC-Wasserbad, bis nur noch ein oder zwei kleine Eiskristalle übrig sind (1-2 Minuten). Es ist wichtig, schnell aufzutauen, um Schäden an den Zellmembranen zu minimieren.
Hinweis: Tauchen Sie die Ampulle nicht vollständig ein, da dies das Kontaminationsrisiko erhöhen kann.
2. Wischen Sie die Ampulle vor dem Öffnen mit einem in 70% igem Alkohol getränkten Tuch ab.
3. Pipettieren Sie den gesamten Inhalt der Ampulle in ein steriles Röhrchen (z. B. 15 ml Fassungsvermögen). Fügen Sie dann langsam 5 ml vorgewärmtes Medium hinzu, das bereits mit den entsprechenden Bestandteilen ergänzt wurde. Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte unter Verwendung der Trypanblaufärbung, eines Hämozytometers und eines umgekehrten Mikroskops, um die Zellen oder eine gleichwertige Zellzählmethode zu zählen. Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension, um die in der Zellliniendateneingabe empfohlene Zellsaatdichte zu erreichen.
Für adhärente Zelllinien: Passen Sie das Volumen des Mediums und gegebenenfalls die Kolbengröße an, um die auf dem Zellliniendatenblatt empfohlene Zellsaatdichte zu erreichen. Ein Vorzentrifugationsschritt zum Entfernen von Kryoprotektor ist normalerweise nicht erforderlich, da der erste Medienwechsel restliches Kryoprotektor entfernt. Wenn ja, wird dies auf dem Datenblatt angegeben. Wenn die Zellen sofort (z. B. für einen zellbasierten Assay) und nicht subkultiviert verwendet werden sollen, kann es ratsam sein, einen Vorzentrifugationsschritt durchzuführen, um das Kryoprotektivum zu entfernen.
Für Suspensionszelllinien*: Ein Vorzentrifugationsschritt zur Entfernung von Kryoprotektivum wird empfohlen, d.h. pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 150 x g für 5 Minuten und resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem Medium mit dem entsprechenden Volumen, um die richtige Aussaatdichte zu erreichen.
1. Inkubieren Sie die Kolben bei der auf dem Datenblatt empfohlenen Temperatur und CO2-Konzentration. Wenn ein CO2-gefütterter Inkubator verwendet wird, sollte der Kolben eine belüftete Kappe haben, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
Hybridomkulturen aus gefrorenen
Bei der Gewinnung von Hybridomkulturen aus gefrorenen ist es nicht ungewöhnlich, dass das Wachstum anfänglich langsamer als erwartet verläuft und eine Abnahme der Lebensfähigkeit beobachtet werden kann. Die Etablierung einer aktiv proliferierenden Kultur kann bis zu 2 Wochen dauern.
Bei der Reanimation ist ein Zentrifugationsschritt zur Entfernung des Kryoschutzmittels unerlässlich. Die gefrorene Ampulle schnell in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1-2 Minuten auftauen lassen. Übertragen Sie den Inhalt in ein Zentrifugenröhrchen und geben Sie langsam 5-10 ml vorgewärmtes Wachstumsmedium + hinzu. Entfernen Sie eine Probe zum Zählen. Zentrifugieren Sie bei 100 x g für 2-3 Minuten, um Zellen zu pelletieren und mit einer relativ hohen Dichte von 5-7 x 105 Zellen / ml zu säen. Legen Sie den Kulturkolben flach und beobachten Sie ihn regelmäßig, bis lebensfähige proliferierende Zellen zu sehen sind.
+ Oft können Hybridomkulturen von einer Resuspendierung mit Medien profitieren, die mit 20% FBS in der frühen kritischen Phase der Kultur oder unmittelbar nach der Reanimation ergänzt werden.
Verfahren zum Einfrieren von Zellen
ECACC empfiehlt, vorsichtshalber einen Vorrat Ihrer Zelllinie (n) kurz nach Erhalt einzufrieren (zwischen 2 – 4 x 106 Zellen / ml).
Die folgende Anleitung wird für die Vorbereitung und Kryokonservierung von Zelllinien angeboten.
1. Ernten Sie die Zellen in der ersten Wachstumsphase auf die gleiche Weise, wie sie für die routinemäßige Subkultur verwendet werden. Für adhärente Zelllinien, Ernte so nah an 80-90% Konfluenz, wie möglich.
2. Das Standardverfahren besteht darin, 90% Serum + 10% Kryoprotektor für alle Zelllinien zu verwenden, sofern auf dem Datenblatt nichts anderes angegeben ist. Erlauben Sie 1 ml für jede Ampulle. Die meisten Zelllinien können in dem geeigneten Kulturmedium eingefroren werden, das mit 20% Serum und 10% Kryoprotektor ergänzt wird. Dies ist normalerweise DMSO, aber in bestimmten Fällen wird Glycerin empfohlen. Wenn DMSO nicht geeignet ist, wird eine Alternative auf dem Zellliniendatenblatt angegeben.
3. Pelletzellen durch Zentrifugation z.B. 150 x g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellpellets in das geeignete Gefriermedium, um eine endgültige Zellkonzentration zwischen 2 – 4 x 106 Zellen / ml zu erhalten, und pipettieren Sie 1 ml in jede Ampulle.
4. Gefrieren Sie die Zellen mit einer Kühlrate zwischen 1-3oC / min mit einem programmierbaren, ratengesteuerten Gefrierschrank oder einer geeigneten Alternative1. Wenn die Temperatur mindestens -130oC erreicht, übertragen Sie die Ampulle in ein Gasphasen-Flüssigstickstoffspeichergefäß.
