a) sexuální životní cyklus Chlamydomonas reinhardtii spočívá… / Stáhnout Vědecký Diagram

… povaha genetických látek, které odporovaly Mendelově zákonu. Rozsáhlé studie v průběhu minulého století, s použitím mnoha technik, včetně elektronové mikroskopie, genetika, molekulární biologie a biochemie, odhalily, že genetické látky jsou ve skutečnosti genom v chloroplastech a mitochondriích (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Chloroplasty (cp) a mitochondrie (m) jsou si myslel, že vznikly z předků endosymbiotic vztahy mezi buňky s jádrem a volně žijící bakterie – sinice a alfa-fialové bakterie, resp. Obsahují své vlastní genomy, které jsou pravděpodobně pozůstatky jejich předků (šedá 1992). Dnes víme, že cp a mt geny jsou přenášeny na potomstvo výhradně z mateřské rodič v různých taxonů vyšších rostlin, kapradiny, mechy, řasy (Kuroiwa 1991), houby (Mitchell a Mitchell 1952; Kawano et al. 1987) a zvířata (Hutchison et al. 1974), včetně lidí. Uniparentální dědičnost genomů cp / mt byla dlouho považována za pasivní výsledek založený na skutečnosti,že vejce obsahují více čísel organel, zatímco mužské gamety v nejlepším případě přispívají jen několika (Gyllensten et al . 1991). Proces uniparentálního dědictví však bude pravděpodobně dynamičtější. Klasickým a názorným příkladem by mohl být výskyt non-Mendelistická dědičnost v jednobuněčné zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii , které produkuje gamety stejné velikosti (isogamous) (Sager 1954). Životní cyklus C.reinhardtii je nádherně jednoduchý. Existují dva typy páření C. reinhardtii, Typ Páření plus (mt+) a typ Páření mínus (mt), řízené jediným komplexním lokusem typu páření na skupině VI (Ferris et al . 2002). C. reinhardtii prochází sexuálním životním cyklem, který zahrnuje definované fáze diferenciace (Obrázek 1). Vegetativní buňky se diferencují na gamety za podmínek hladovění dusíkem a ozařování světlem (Pan et al . 1996). Během několika minut po smíchání, gamety opačných typů Páření se navzájem drží svými bičíky a fúzí za vzniku zygot. Po povinném období klidu podstoupí zygota meiózu a klíčení, aby vytvořila čtyři haploidní potomstvo. Více než 90% potomstva, které se tvoří, dědí vlastnosti chloroplastu (cp), přednostně od rodiče mt +, což je jev poprvé popsaný před více než 50 lety (Sager 1954). Sager popsal dědičné vzorce dvou UV indukovaných mutací, sr1 a sr2 . Mutace sr1 poskytuje rezistenci na nízké hladiny streptomycinu antibiotika a mutace sr2 poskytuje rezistenci na vysoké hladiny streptomycinu. Když byl sr1 překročen na kmen citlivý na streptomycin, byly zděděny nízké hladiny rezistence na streptomycin podle Mendelova zákona. Naproti tomu, když se mt+ rodič nesoucí sr2 mutace přešel k citlivé mt – rodič, všechny meiotické potomstva byly odolné vůči vysoké úrovně streptomycin. Ve vzájemném kříži byli meiotičtí potomci citliví na streptomycin (Sager 1954). V roce 1962, důkazy pro existenci cpDNA přišel ze světelné a elektronové mikroskopické práce Ris a Plaut (Ris a Plaut 1962). Jen o rok později Sager a Ishida popsali izolaci cpDNA centrifugací s gradientem hustoty chloridu cesného (CsCl) (Sager a Ishida 1963). V roce 1989 bylo prokázáno, že mutace sr2 se lokalizuje v genu rps12 genomu cp (Liu et al . 1989). V roce 1972, jeden biochemické studie ukázaly, že množství mt – cpDNA snížil relativní mt + cpDNA, 6-24 hodin po páření (Sager a Varování 1972). DNA z mt+ a mt – gamety byl označen buď s 14 N – nebo 15 NH 4 Cl, a CsCl gradient hustoty centrifugaci byla použita ke sledování osudu jaderné DNA a cpDNA v 6 – ti a 24-h zygoty. Šest hodin do zygoty rozvoj, signál představující mt – cpDNA byla jasně nižší než mt+ cpDNA, což ukazuje na preferenční snížení mt – cpDNA vzhledem k mt+ cpDNA. V roce 1980 poskytl Grant et al první molekulární důkaz pro preferenční snížení mt – cpDNA. (Grant a kol. 1980). Autoři sledovali chování mt+ a mt – cpDNA, s využitím mnohotvárnost délky fragmentu (RFLPs), v C. reinhardtii mutantní kmen ac-u-g-23, který nese dvě malé delece v jeho chloroplast DNA. Autoři zjistili, že jak delece v cpDNA, tak nefotosyntetický fenotyp byly uniparentálně zděděny. 203-kb chloroplastový genom C. reinhardtii (Maul et al. 2002) je přítomen v ~80-100 kopií na buňku, a je rozdělen do 5-10 DNA–proteinové komplexy, které se nazývají chloroplastu nucleoids (Kuroiwa et al. 1981). V roce 1982 Kuroiwa et al. zjistil, že DAPI (dsDNA specifické fluorochrome, 4′,6-diamidino-2-phenylindole)-barevné mt – cp nucleoids zmizel přednostně v mladé zygoty do 50 min páření (Kuroiwa et al. 1982). V roce 1999, preferenční zmizení mt – cp nucleoids byl pozorován v obývacím zygota, pomocí SYBR Green I (dsDNA specifické fluorochrome, které mohou pronikat do živých buněk) (Obrázek 1) (Nishimura et al. 1999). Výklad tento dramatický jev, nicméně, byl kontroverzní, protože preferenční zmizení fluorescenční mt – cp nucleoids došlo mnohem dříve, než redukce DNA byla detekována biochemické či molekulárně-biologické metody (6-24 hodin po páření) (Sager a Varování 1972). Byly navrženy dvě primární možnosti, jak to vysvětlit. Jedna možnost byla, že rozpad cp nucleoids by mohlo vést k rozptýlení molekul cpDNA, a druhá možnost byla, že rychlému trávení molekul cpDNA by mohlo vést k vymizení cpDNA nucleoids. Jedním z problémů při řešení této otázky je, že páření reakce se provádí pomocí milionů mt+ a mt-gamet (Obrázek 2). Buněčné populace je nevyhnutelně heterogenní směs buněk, jako unmated mt+ a mt – gamety, zygoty, s nebo bez mt – cp nucleoids a výjimečné meitotic zygoty (1~5%), které netvoří meitotic zygoty (Ebersold 1967). Obecně platí, že molekulární a biochemické metody vyžadují velké množství homogenních vzorků pro přesné analýzy, a veškeré heterogenitu vzorky, mohlo by to zmást výsledky. Jinými slovy, “osobnosti” jednotlivých buněk nebo organel v populaci by byly zředěny a pravděpodobně ztraceny v procesu analýz. Na druhé straně mikroskopie může odhalit “osobnosti” na morfologické úrovni, ale ne na molekulární úrovni. Pro studium stavu molekul cpDNA při zmizení mt – cp nucleoids, bylo nutné, aby sbírat zygoty na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti mt – cp nucleoids, a analyzovat jednotlivé zygoty pomocí molekulárně biologických technik. K dosažení tohoto cíle byly použity optické pinzety (obrázek 3). Použití optických pinzet je nová technika pro manipulaci s živými buňkami nebo organely pod přímým mikroskopickým pozorováním (Ashkin et al . 1987). V této studii byla pomocí optické pinzety odebrána jediná zygota s nebo bez CP nukleoidů a přítomnost nebo nepřítomnost molekul mt – cpDNA byla stanovena vnořenou PCR analýzou. Jednotlivé osudy mt+ a mt – zygotic cpDNA byly sledovány odděleně pomocí chloroplastu transformant LO3c , která chová bakteriální gen aadA (aminoglykosidová adenyl transferázy). Jednotlivé zygoty, které byly získány optickou pinzetou, byly podrobeny vysoce citlivé vnořené PCR analýze pro aadA (obrázek 4) (Nishimura et al. 1999). Když byly l03c mt+ gamety zkříženy s mt-gametami divokého typu, byly detekovány genové sekvence Aada ve všech vyšetřovaných zygotách. Naopak, když byly l03c mt-gamety zkříženy s gametami divokého typu, sekvence aadA byly amplifikovány pouze u mladších zygotů (10 a 30 minut po vytvoření zygoty). Po zmizení fluorescenčních nukleoidů mt-cp již nebyly sekvence aadA detekovány v zygotách (90 a 120 minut po vytvoření zygoty). Tyto výsledky naznačují, že mt – cpDNA molekuly jsou zcela absorbován do 10 min, během kterých mt – cp nucleoids zmizí, a také to, že alespoň jeden vysoce efektivní nuclease je aktivován v mt – chloroplast jen po zygota formace. Toto aktivní trávení mt-cpDNA je pravděpodobně základem pro mateřskou dědičnost cpDNA. Nejjednodušší model pro uniparental dědičnost cpDNA je, že proces se skládá ze dvou různých událostí, které mohou nastat v různých fázích životního cyklu: “ochranu” mt+ cpDNA, možná v průběhu gametogeneze, a “destroyer” nechráněného mt – cpDNA během časné zygoty rozvoj. A) Omezení –Methylace hypotéza V roce 1972, Sager a kolegy navrhl, že mt – cpDNA byl štěpen působením restrikční enzymy, vzhledem k tomu, že mt+ cpDNA byla chráněna metylací – model analogický k bakteriální omezení-methylace systém (Sager a Varování 1972). Sager a kolegové rychle nashromáždili přesvědčivé důkazy, které ukazují zvýšení hladiny methylace mt + cpDNA, která byla detekována 7 hodin po páření(Burton et al . 1979; Royer and Sager 1979; Sano et al. 1980). Dále bylo hlášeno čištění metyltransferáz dna specifických pro mt+ gametu s molekulovou hmotností 60 kDa a 20 kDa (Sano et al. 1981). Tato methylační událost specifická pro mt+ gametu byla zjevně reverzibilní, jak by se dalo očekávat pro ochranu (Sano et al . 1984). Gen pro chloroplast-resident DNA methyltransferáza byl nakonec identifikován v roce 2002, a jeho mt+ gamet-specifická exprese a lokalizace chloroplastů byly potvrzeny (Nishiyama et al. 2002). Na druhé straně řada dokumentů od nezávislých skupin následně tvrdila, že methylace mt + cpDNA nemůže dostatečně vysvětlit ochranu. Bolen et al. izoloval jaderný mutant me1, který konstitutivně methyluje cpDNA na vyšší úrovni v mt+ i mt – buňkách (Bolen et al . 1982). Když byly pro kříže použity gamety me1, byly pozorovány normální uniparentální dědičné vzorce, v rozporu s…