Alfa CETSA Knowledgebase

• CETSA®
• Cíl/Typy Vzorků
• CETSA® Assay Podmínky
• Alfa CETSA® Imunotesty
• CETSA® Analýza Dat a Interpretace

Upozornění: pouze Pro výzkumné účely. Cetsa® je registrovaná ochranná známka společnosti Pelago Bioscience AB. Vezměte prosím na vědomí, že pro použití sady je vyžadováno platné předplatné CETSA®.

samotná metoda CETSA®

otázka: Co je CETSA®?

A : Mobilní Thermal Shift Assay je metoda, která umožňuje kvantifikaci sloučeniny je Cíl Zapojení (TE) v živých buňkách nebo v narušení buněk. Princip testu CETSA® je založen na změně profilu tepelné denaturace cílového proteinu, ke kterému dochází po vazbě sloučeniny. Test CETSA® se provádí inkubací buněk s testovanou sloučeninou, následovaným zahříváním buněk ošetřených sloučeninou a poté měřením zbývajícího rozpustného cílového proteinu.

Q: Co je tepelný posun

A: Po zahřátí se protein setká s teplotou, při které denaturuje (někdy označovaný jako bod tání). Tato teplota tání je fyzikální vlastností a konstantou pro danou sadu podmínek (pH, tlak, soli). Sloučeniny, které interagují s proteinem, změní teplotu tání (tepelný posun). Pro dané vazebné místo uvnitř proteinu velikost tepelné posun může být měřena v různých sloučenina koncentrace (dávka-odpověď), a hodnoty EC50 získané z takové křivky mohou být použity ke stanovení pořadí potence z řady sloučenin, které přímo koreluje pořadí afinity sloučenin . Existuje několik variací na test tepelného posunu in vitro, ale klíčová technika byla poprvé popsána Semisotnovem et al. (1991). Při této metodě tavící a rozkládající se protein vystavuje hydrofobní povrchy, které umožňují vazbu SYPRO orange. Tato barviva je fluorescence je kalené ve vodě, takže vazba na tyto hydrofobní povrchy obrátí to a způsobuje fluorescence na vrcholu, když protein je plně rozvinula. Tento typ testu tepelného posunu lze použít pouze na vysoce purifikované proteiny a u druhů s nízkou hojností to může znamenat, že k vytvoření dostatečného množství je nutný systém nadměrné exprese.

Thermofluor – citlivý na teplotu barvivo systém (pomocí Sypro Orange)

Diferenční skenovací fluorimetrie (DSF) – alternativní barvící metody založené na

Kvantitativní PCR systémy (např. Roche Light cycler) : ty se používají k dodání události ohřevu a mohou měřit změny fluorescence

Nanotemper-je společnost vyrábějící specializovaný nástroj, který ohřívá vzorek a měří fluorescenci. Nabízí lepší výkon než upravené PCR systémy.

otázka: proč je měření cílového zapojení důležité?

A : při absenci potvrzení, že sloučenina skutečně interaguje s požadovaným cílem, mohou vývojáři drog ztratit drahocenný čas a zdroje pohybující se špatným směrem. Z tohoto důvodu je potvrzení cílového zapojení sloučeniny již dlouho považováno za nezbytné při objevování drog. Takové testy umožňují přímé srovnání složeného afinitu pro svůj cíl, jako takový je základním měřítkem pro výběr, které sloučenin postupovat ve všech fázích vést generace a optimalizace. Protože cílová angažovanost může být korelována s afinitou, umožňuje vědcům vybrat sloučeniny, které mají nejvyšší hodnoty afinity. Jako takové je mimořádně užitečným opatřením k zajištění správné prioritizace sloučenin v každé fázi procesu objevování léčiv.

otázka: jak se CETSA® liší od ostatních technologií stanovení tepelného posunu?

A: kromě CETSA ® existuje řada metod pro hodnocení cílové angažovanosti (např. rezonance povrchového Plasmonu, fluorescenční polarizace a tepelný posun). Nicméně všechny tyto metody se spoléhají na čištěný protein je k dispozici a mohou být použity pouze in vitro, což znamená, že odvozené afinitu hodnoty nemusí být prediktivní skutečné příbuznosti nebo závazné potenciál v živých buňkách. Aby byli schopni provozovat Tepelné Posun testy v příslušné buněčné kontextu, kde protein je v jeho přirozeném prostředí, v přítomnosti svého přirozeného partnera proteiny, s fyziologickou koncentrací jeho kofaktorů a substrátů, přináší mnohem více relevantních údajů, které budou lépe přeložit do zvířecích modelech a v klinických studiích.

Zatímco Mobilní Thermal Shift Assay je metoda založená na stejné biofyzikální princip jako standardní Teplotní posun analýz (tj., které konkrétní proteiny denaturují při nastavené teplotě) to není přímo opatření na konkrétní teplotu rozvíjející, ale místo toho se spoléhá na skutečnost, že přítomnost sloučeniny na bílkoviny bude mít vliv na množství rozpustných proteinů přítomných po zahřívání na nastavenou teplotu. Jako takový je CETSA® v podstatě celkovým testem bílkovin provedeným po určité události ohřevu. Sloučeniny s různou cílovou účinností zapojení změní relativní množství proteinu přežívajícího událost ohřevu. Protože test měří tento zbytkový protein, spíše než skutečnou událost tání, může být aplikován na složitější systémy in vivo, jako jsou buňky a lyzáty (a v některých formátech CETSA® dokonce i pevná tkáň). Kromě toho může CETSA® identifikovat sloučeniny, které destabilizují protein (tj. snižují jeho teplotu tání), což je u ostatních metod tepelného posunu méně přímočaré.

Q: Jak se Alpha CETSA® liší od jiných buněčných tepelných posunů nebo jiných buněčných cílových interakčních testů?

A: jak bylo uvedeno výše, CETSA® je v podstatě celkový proteinový test provedený po tepelném šoku. Alpha CETSA® používá duální systém detekce blízkosti protilátek. Jiné metody, vyhněte se použití na základě protilátek systému změnou cílového proteinu:

• Promega nanoluciferase thermal shift assay (NaLTSA) : Nanoluc Luciferase Pojistkou na cílový protein (recombinantly exprimované bílkoviny); Když se proteinový cíl s nanoluc enzymem tag agreguje, luciferázový signál se sníží.
• Promega NanoBRET Target Engagement Test : Luciferase Fusion Tag v kombinaci s značený tracer sloučeniny, které, když se v těsné blízkosti luciferase povede k Bioluminiscence Resonance Energy Transfer (BRET). Vazba sloučenin ve stejné kapse vytěsní indikátor a Bret signál se sníží. Nejedná se o metodu tepelného šoku.
• DiscoverX Incell Pulse: založené na technologii komplementace fragmentů enzymů (EFC) : cílový protein je fúzován s malým fragmentem donoru enzymu β-galaktosidázy (β-gal). Přidanou reportér bílkoviny se váží na tento fragment k rozpuštění aktivní enzym, který se rozpouštějí substrátem a vytvářet chemiluminiscenční signál umožňující protein množství kvantifikace. Po tepelné denaturaci, protein bude agregovat a omezit přístup z větší luciferase součást svého partnera na cílový protein.

hlavní rozdíl mezi těmito “rekombinantní CETSA®” nebo “rekombinantní cíl zapojení” systémy a Alfa CETSA®, je, že nemohou být použita pro nativní a nemodifikované buňky. To má řadu negativních důsledků:

1. Zatímco náklady na vývoj nových protilátek, spárování a následné za tak náklady mohou být vyšší než jen transfecting jedné buněčné linie, je pravděpodobné, že každý objev, program bude chtít být testovány s řadou modelových buněčných linií, každou transfekci přichází s jeho vlastní náklady a klonování následné buněčné linie bude trvat další týdny.
2. Generování tagged bílkovin bude vždy mít fyziologické důsledky na buněčné a označené proteiny mohou být (i) nadměrně exprimován (špatně stechiometrie vs. partneři), (ii) nejsou umístěny ve správném buněčném kompartmentu nebo (iii) nejsou spojeny s klíčovými partnerskými proteiny a (iv) mohou mít odlišné chování při tání než nativní protein. To znamená, že zdánlivý účinek sloučeniny nemusí odrážet jeho skutečné chování v tkáni pacienta. Tyto problémy mohou být zvětšeny v jakémkoli dočasném transfekčním systému.
3. inhibitory Luciferázy mohou vést k falešně pozitivním hitům.
4. v pozdějších fázích optimalizace olova, kdy jsou vyžadovány složitější a fyziologicky relevantnější buněčné modely (primární, nativní buněčné linie a tkáň), se přístupy značených proteinů jednoduše nepoužijí.

otázka: jaké informace poskytuje test CETSA®?

A: CETSA® poskytuje jedinečnou míru sloučenin “na cílové přítomnosti” a lze je považovat za cílovou obsazenost. Tato obsazenost bude ovlivněna jak schopností sloučenin zapojit cíl, tak schopností sloučeniny být přítomen na správném místě (tj. má správnou rozpustnost, propustnost, metabolickou stabilitu a dostupnost v pravém buněčném kompartmentu). Non-cellular Cíl Zapojení testy nabídka opatření afinity, které korelují pouze s proteinem chování ve vysoce umělé prostředí, často s použitím čištěného recombinantly vyjádřil cílové proteiny.

otázka: lze CETSA® použít pro studie analýzy SAR?

A: zatím nejsou publikovány žádné příklady, kde byl CETSA® použit pro optimalizaci sloučenin. Nicméně, potenciál a použitelnost CETSA®, které mají být použity pro analýzu SAR a potvrzení hit byly jasně prokázány Shaw et al. porovnáním dat z testu CETSA® s běžně používanými biochemickými a buněčnými daty (Shaw et al . 2018 SLAs Discovery 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). Publikace demonstruje přidanou hodnotu CETSA® pro screening, potvrzení hitů a generování SAR pro dva proteinové cíle: B-Raf a PARP1.

typy Target / Sample

otázka: kolik cílů bylo dosud v CETSA® validováno?

A: V CETSA® HT (většina je Alfa CETSA® , některé pomocí HTRF) více než 30 cíle byly úspěšně ověřen, včetně cílů s jadernou, mitochondriální, cytoplazmy a plazmatické membrány lokalizace.

v cetsa® Classic (Western Blot based detection) bylo dosud ověřeno více než 100 cílů.

CETSA® M / S generuje informace pro 6000 až 7000 cílů najednou.

otázka: Mohou být všechny cílové proteiny testovány v CETSA®?

R: některé cíle jsou v CETSA®” slepé”, tj. vazba sloučenin nezmění jejich tepelnou stabilitu. To se může stát, když protein má více domén, a sloučenina je závazný pro jednu doménu pouze, a pokud stabilizaci této jedné domény není globálně ovlivňuje tepelnou stabilitu celého proteinu. Existuje několik proteinů, které se netají v typickém teplotním rozmezí aplikovaném v experimentech CETSA®.

Pelago má přístup do velké databáze s tepelnou stabilitu data z projektů s hmotnostním spektrometrem odečet (CETSA® MS), a tato informace je vzata v úvahu při Pelago je posuzování “CETSA® nost” proteinu cíl než rozvoj Alfa CETSA® assay. Kontaktujte prosím Pelago a vyžádejte si tyto informace.

otázka: Jsou GPCRs přístupné CETSA® ?

A: několik příkladů GPCRs bylo testováno v CETSA® . V nedávné publikaci Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) byly stanoveny testy Cetsa® Classics pro sadu membránově vázaných proteinů včetně cíle proteinu GPCR. Jednou z potenciálních výzev s CETSA® na GPCRs může být omezená dostupnost protilátek pro detekci. Navíc integrální membránová lokalizace GPRC může vést k nepředvídatelnému chování při tavení.

otázka: jaký typ vzorků lze testovat v CETSA®?

A : Existují příklady CETSA® testy pomocí mnoha různých typů matric včetně imortalizované buněčné linie, primární buňky, iPS buňky, pacient odvozené Pbmc, toroidy, jaderné frakce z kultivovaných buněk, ex-vivo ošetřené tkáně, tkáně z in vivo studií na zvířatech, bakterie, kvasinky, danio pruhované a hmyzu.

otázka: mohou být vzorky zmrazeny po kroku ohřevu?

A: to je možné, nicméně to vyžaduje ověření případ od případu, protože proces zmrazení může denaturovat některé proteiny.

Q: Moje buňky potřebují kultivační destičku potáhnout některými proteiny (např. kolagen nebo Matrigel); je zapotřebí zvláštní péče, aby se zabránilo přípravě vzorku?

A: nesetkali jsme se s žádnými problémy s buňkami kultivovanými na potažených deskách.

podmínky testu CETSA®

otázka: Jaké jsou typické body optimalizace testu Alpha CETSA®?

A: pokud začíná od nuly, musí být imunotest nejprve vyvinut a optimalizován. Je důležité a užitečné investovat do vývoje velmi citlivého alfa testu, protože to umožní snížit počet buněk na jamku potřebnou v testu CETSA®. Protože CETSA® assay je ničí část bílkovin, které potřebuje, aby být detekovány, obvykle více buněk na jamku jsou potřeba v CETSA® assay v porovnání s ostatními na bázi buněk testy. Naleznete v PerkinElmer příručky pro vývoj alfa test pro jak postupovat a pro užitečné rady, a na cetsa® toolbox manuály, pokud používáte toolbox (anti mouse ig X anti rabbit ig beads) přístup.

pak body optimalizace testu CETSA® zahrnují:

• hustota Buněk titrace
• Výběr cell lysis buffer
• doba Inkubace buněk s zkoušená sloučenina
• Teplota pro inkubaci buněk s zkoušená sloučenina
• Založení tát a posun křivky
• Výběr teploty, pro izotermické dávka-odpověď experimenty
• Workflow a automatizace nastavení

Q: Proč jsou různé CETSA® cell lysis nárazníky za předpokladu, a to, co je dopad použití různých lýzu buňky nárazníky?

A: Pufr lýzy je důležitý z hlediska několika aspektů testu. Jeho role je více: lysing buněk a potenciálně zdarma cílový protein z partnerských proteinů, které mohou zasahovat protilátek uznání, aby cíl k dispozici pro detekci protilátek; stabilizace cílový protein, aby se testu stabilní; vyhnout se nebo minimalizovat potenciální epiturbance efekt; poskytování vhodných fyzikálně-chemických podmínek (pH, iontová síla a povaha soli, mycího prostředku typu a koncentrace, … ) pro imunoanalýzy, … Jako různé imunologické testy mohou mít různé optimální podmínky, a jak různé cíle bílkovin, a různé typy buněk mohou mít různé požadavky na optimální výkonnost testu, děláme 5 různých lýze buněk vyrovnávací paměti k dispozici. Ty poskytují různé podmínky lýzy buněk. To však neznamená, že ve specifických případech, jako jsou další typy detergentů, mohou být přidány další složky, aby se zlepšil další výkon testu.

Otázka: Existují inhibitory proteázy v pufrech lýzy buněk CETSA®?

: CETSA® Lýze Buněk vyrovnávací paměti 1, 4 a 5 obsahuje některé dvojmocné kationy cheláty, které se očekává, že inhibují proteázy, které vyžadují např. dvojmocné kationty pro jejich činnost (Matrix Metaloproteinázám, například). Kromě toho nejsou do pufrů lýzy buněk CETSA® zahrnuty žádné další inhibitory proteázy, protože tyto nejsou obecně potřebné pro výkon testů alfa CETSA®. Pro specifické typy buněk nebo vzorky tkání však můžete přidat typické inhibitory proteinázy, jako je leupeptin.

otázka: Jaké jsou typické teploty tání?

: teplota tání (Tm) je definována jako teplota, při které polovina cílový protein populace byl denaturován (tj. v Alfa CETSA®, při které polovina Alpha signál byl ztracen). V závislosti na cíli, teploty tání se nejčastěji mezi 40°C a 60°C, s průměrnou teplotou tání 52°C. Některé proteiny, jako membránových proteinů, jsou obvykle více stabilní a může mít vyšší teplotu tání. CETSA® assay data pro proteiny s teplotou tavení nad 65°C mohou být ovlivněny ze skutečnosti, že permeability membrány a integritu buněk je narušena, když buňky jsou vyhřívané, čímž ovlivňuje fyziologický význam testu.

podle našich zkušeností je teplota tání specifická pro cíl a závisí na matrici testu a použitém lyzačním pufru.

otázka: Očekává se, že Tm bude stejný při práci s intaktními buňkami a narušenými buňkami?

A: Ne nutně, jako při narušení buněk, protein-protein interakcí, které stabilizují proteiny mohou být ztraceny, což může vést ke změnila teplota tání ve srovnání s intaktní buňky. Pro příklad viz údaje z testu Alpha CETSA® MEK1.

otázka: jakou teplotu ohřevu mám zvolit pro testování sloučenin?

A: Pro stabilizační sloučeniny se doporučuje zvolit nejnižší teplotu s největším testovacím oknem, protože se očekává nejcitlivější test (nižší hodnoty EC50). Pro destabilizující sloučeniny se doporučuje zvolit nejvyšší teplotu s největším testovacím oknem. Teploty nad 65°C mohou mít vliv na propustnost buněk a snížit význam dat.

otázka: mám očekávat stejnou teplotu tání u CETSA® Classic (Western Blot) a Alpha CETSA®?

A: ne nutně: zdánlivá teplota tání se může mezi oběma metodami lišit, protože detekční metody jsou odlišné.

otázka: je důležité mít přísnou kontrolu doby ohřevu vzorku?

A: ano, toto je velmi důležité kontrolovat, protože delší doba zahřívání může vést k správnému posunu křivky odezvy na dávku(viz níže komentáře k době zdržení). Standardní doba ohřevu je 3 minuty.

sloučeniny s krátkou dobou zdržení (tj. vysoká disociační konstanta koff; doba zdržení T je rovna 1 / koff) se při zahřátí rychleji oddělí od cíle ve srovnání se sloučeninami s dlouhou dobou zdržení. Z tohoto důvodu se očekává, že hodnota EC50 nebo ITDRF50 se zvýší se zvyšující se dobou ohřevu. Pro více vysvětlení na CETSA® teorii vidět Pobřeží-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Kvantitativní Interpretace Intracelulární Drog Závazné a Kinetiky Pomocí Mobilní Thermal Shift Assay. Biochemie 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Teoreticky by mohla být možná detekce různých dob setrvání sloučenin v cíli různou dobou zahřívání, ale zatím nejsou k dispozici žádné publikované zprávy o tom, že by to bylo provedeno.

Q: návod přikazuje buď vychladnout na ledu, nebo po dobu 3 minut při teplotě 25°C po tepelném šoku. Je tento krok chlazení důležitý a je důležité mít přísnou kontrolu doby chlazení?

A: chlazení vzorku rychle zajišťuje, že fáze tepelného šoku je dobře řízena. Jednoduše umožňuje teploty v pohodě bez pomoci by jistě vyrábět různé chlazení sazby v různých studní a vliv na výši tepelného šoku dodána do systému. Fáze chlazení není tak kritická jako fáze ohřevu, ale měla by být prováděna rychle a důsledně.

Otázka: Mohu použít soupravy PerkinElmer “Biomarker” a “SureFire” (non-CETSA®) k provedení testu CETSA®?

A: teoreticky může být jakýkoliv celkový proteinový test vhodný pro použití v protokolu CETSA®, ačkoli každý systém musí být optimalizován a validován. Metoda CETSA® je však patentována a bude zapotřebí povolení od společnosti Pelago Bioscience. PerkinElmer navíc podporuje pouze použití určených cílových sad. Použití sady nástrojů je podporováno společností Pelago Bioscience a je k dispozici pouze držitelům licencí.

otázka: je možné číst alfa signál přímo z PCR desky používané k ohřevu vzorků?

R: To by poskytnout výhody z hlediska počtu pipetovací kroky, vzorek spotřeby a snadnost automatizace, ale možnost pomocí PCR destičky pro celý proces – od zpracování vzorku pro detekci – není prokázána. PCR desky jsou často velmi flexibilní, což vede k non-jednotné signálu přes desku, nebo nemají správné rozměry, aby mohly být zpracovány deska čtenáři. Dobře-to-dobře cross-talk může být také problém v takových PCR desek.

otázka: lze místo tepla použít chemickou denaturaci (např. močovinu nebo guanidin)?

A: Výhodou použití teploty k dodání tepelného šoku je to, že se provádí vysoce kontrolovaným způsobem, který je pravděpodobně konstantní mezi vzorky, a omezené v dobře kontrolovaném časovém rámci. Chemická denaturace proces může pracovat ve čištěný protein získávaný; ale v komplexu buněčné prostředí, změny objemu buňky, pufrační schopnosti, obsahu lipidů, atd. jsou všechny pravděpodobně znamená, že různé buněčné linie vykazují různé denaturace vlastnosti pro daný protein.

Jako denaturace (doba ohřevu) je kritické, to může být docela obtížné řídit, pokud používáte chemické denaturaci. Kromě toho může být teplo aplikováno bez narušení buněk, což umožňuje testovat v reálném buněčném kontextu. To by nemělo být v případě chemické denaturaci, jako by buňky měly být narušena umožnit cílové přístup k denaturating agent, proto ztrácí intracelulární koncentrace bílkovin sdružení atd.. Proto nedoporučujeme nahrazovat tepelný šok chemickou denaturací.

alfa Cetsa® imunotest

Q: Při vývoji testu CETSA® potřebuji monoklonální protilátky nebo lze použít i polyklonální protilátky?

A: lze použít jak monoklonální, tak polyklonální protilátky, samozřejmě v závislosti na kvalitě protilátek. Monoklonální protilátky představují výhodu, pokud jde o stabilní přísun činidla, jako u jakékoli jiné detekční metody používající protilátky.

otázka: při použití polyklonálních protilátek bude další šarže fungovat stejným způsobem v testu CETSA®?

A: Podle našich zkušeností, jsme se nikdy čelí situaci, kdy další spoustu polyklonální protilátky se choval jinak v CETSA® assay v porovnání s dřívější částí. Test CETSA® však musí být znovu validován s další šarží polyklonální protilátky.

Otázka: Existují další doporučení pro výběr protilátek?

: Pokud je k dispozici, protilátky by měly být vybrány tak, že zahrnují různé epitopy na cílový protein, s cílem maximalizovat šance najít vhodné protilátky pár, který bude pracovat v Alfa CETSA® assay.

páry protilátek, které poskytují strmější křivky (vyšší sklon kopce) a menší pozadí, jsou upřednostňovány, protože obvykle poskytují specifičtější signál. Nízký svah kopce může být známkou schopnosti páru protilátek rozpoznat znovu složený protein.

Q: Jsou Alfa CETSA® protilátky proti endogenní cílový protein pouze nebo endogenní cílový protein plus vázán malé molekuly?

A: na základě dosud vyvinutých souprav jsou protilátky pouze proti cílovému proteinu.

Q: Mohu očekávat, že afinity detekčních protilátek se budou lišit mezi vázanou a nevázanou malou molekulou k cílovému proteinu?

A: malé molekuly ovlivňující skládání proteinů v epitopových místech jsou skutečně vystaveny riziku změny vazby protilátek. Tento jev se nazývá “epiturbance” a může být omezením na bázi protilátek-CETSA® . Epiturbance není obecně pozorována ve formátu testu CETSA® Classic (Western Blotting), protože v tomto případě je protein plně denaturován před krokem detekce protilátek.

otázka: lze se sadami nástrojů cetsa® používat pouze IgG?

A: Protilátky na anti-králících a anti-myších kuličkách jsou specifické pro IgG a nerozpoznaly by jiné třídy protilátek (tj.

otázka: existuje výhoda v používání Alpha CETSA® ve srovnání s CETSA® Classic (Western Blotting)?

: Vedle větší citlivost Alfa CETSA® assay a propustnost a automatizace úvahy, vzhledem k možné potíže v analýze membránových proteinů v CETSA® Classic metoda, Alfa CETSA® může fungovat lépe pro takové cíle, jako to nepotřebuje žádné separační krok.

analýza a interpretace dat CETSA®

otázka: Jaké falešně pozitivní zásahy lze v CETSA®získat?

A: tepelná stabilita některých proteinů může být ovlivněna po ošetření sloučeninou, i když nejsou přímo vázány zkoušenou sloučeninou. Tyto nepřímé účinky mohou být výsledkem například fosforylace bílkovin, náboru bílkovin partnerským proteinem nebo celkové změny redoxního stavu buňky. Běží CETSA® assay paralelně na intaktní buňky a narušení buněk, můžeme rozlišovat mezi přímým a nepřímým účinkům, jako takové nepřímé účinky neočekává se, že když jsou buňky narušeny a metabolické procesy jsou zastaveny.

v Alfa cetsa® se lze setkat s interferencí testu sloučenin, protože sloučeniny jsou přítomny v detekčním kroku při relativně vysoké koncentraci. To může přinést zavádějící výsledky a je důležité provést obrazovku čítače k identifikaci těchto sloučenin.

otázka: jak lze cílovou destabilizaci interpretovat?

A: Destabilizace může být důsledkem narušení vazby proteinového komplexu, který stabilizoval cílový protein. Podle našich zkušeností, membránové proteiny mají obvykle vyšší teplotu tání a jsou spíše destabilizoval, než stabilizován sloučenina závazné. U kináz by to mohlo být také důsledkem přemístění ATP. V takovém případě porovnávání výsledkem CETSA® testy, když se provádí na neporušené buňky (fyziologické koncentrace ATP) a narušení buněk (ztráta ATP), může být užitečné. U některých cílů (viz Příručka ErbB2 Alpha CETSA® kit) jsme pozorovali, že ireverzibilní inhibitory destabilizovaly cíl, zatímco reverzibilní inhibitor stabilizoval cíl.

otázka: Existuje způsob, jak se vyhnout epiturbančnímu efektu?

A: přidání malého množství detergentu, jako je 0.01% SDS, může zabránit fenoménu epiturbance. Vysvětlení by mohlo být, že SDS poskytuje přístup k protilátce i v přítomnosti sloučeniny. Některé pufry pro lýzu buněk cetsa® obsahují malé množství SDS, a proto se mohou vyhnout epiturbanci oproti jiným pufrům pro lýzu. Nemůžeme vyloučit, že v některých případech bude možná nutné přidat další SDS.

je třeba poznamenat, že takové epiturbance účinek není omezen na CETSA® testy, ale může být také setkal se v každém souprava.

Q: Counter-screen / jak zkontrolovat, zda můj cetsa® hit je falešně pozitivní?

A: v CETSA® existuje jednoduchá metoda umožňující určit , zda sloučenina působí na samotnou stabilizaci cílového proteinu (de)nebo interferuje s detekční metodou: srovnání může být provedeno mezi (1) přidáním sloučenin do buněk, poté inkubací a provedením tepelného zpracování a (2)nejprve zahříváním buněk a přidáním sloučeniny až poté. Pokud je sloučenina aktivita nalezena pouze v testu 1, pak je skutečně aktivní v cíli. Pokud sloučenina aktivita je nalézt v 1 a 2, pak to ukazuje, že to se střetává nějak s technologií detekce (viz PerkinElmer Protein-Protein interakce průvodce pro seznam potenciálních alfa interference).

otázka: Jaké falešně negativní zásahy lze v CETSA®získat?

A: Pokud sloučenina nedosahuje cíle v buněčném kontextu, může se v biochemických testech jevit jako pozitivní a v CETSA® stále negativní . To není falešně negativní, ale pouze odráží skutečnost, že sloučenina není schopna přistupovat k cíli za reálných buněčných podmínek, což je součástí síly metody.

otázka: jak se hodnoty CETSA® porovnávají s funkčními testy / existuje význam amplitudy thermoshift?

A: Při analýze CETSA® data, jeden musí mít na paměti, že princip testu je zcela odlišný od typických funkčních testů, jako při pohledu na fosforylace proteinů, iontových koncentrací, tábor a další signální transdukce značky, nebo fenotypové analýzy v high content screening, a proto data musí být interpretovány odpovídajícím způsobem.

amplituda termoshiftu není měřítkem afinity sloučeniny.

hodnoty EC50 nebo ITDRF50 jsou specifické pro určité zkušební podmínky (Teplota ,doba ohřevu,…). To se neliší od funkčních testů, kde hodnoty EC50 jsou například specifické pro dobu stimulace.

otázka: je možné rozlišovat antagonisty oproti agonistům v testech CETSA®?

A: obvykle to není Informace, která je extrahována z testů CETSA®, ale publikace od Shaw et al. (2018) Vědecké zprávy / (2018) 8:163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. zprávy, že pouze agonisté byli schopni stabilizovat androgenní receptor v CETSA® assay vyvinuté, zatímco antagonista neměl žádný přímý účinek v CETSA® assay, ale mohl by být detekován jako konkurence účinek agonisty v CETSA® assay. Proto v tomto konkrétním případě byl test CETSA® schopen rozlišovat mezi agonisty androgenních receptorů a antagonisty. To neznamená, že je to možné pro jakýkoli cíl, protože existuje mnoho příkladů, kdy test CETSA® přímo detekuje agonisty i antagonisty.

Q: Lze CETSA® použít k detekci toxicity sloučeniny?

: Sloučeniny projevují některé toxický účinek na buňky jsou očekává, že povede k změně hladiny některých proteinů (prostřednictvím rozkladu a/nebo transkripční účinky) a na změny v termostabilita některých proteinů (přes post-translační modifikace nebo obecné změny Redox stavu buňky). Pelago zkoumá možnost generovat “cetsa® otisky prstů”, které by mohly být spojeny s různými typy toxicity, z údajů CETSA® MS. To by také mohlo generovat znalosti o cílech, které by drogy neměly zasáhnout, aby se zabránilo takové toxicitě. Pokud se zdá, že konkrétní cíl je spojen s toxicitou, může se použití Alpha CETSA® stát metodou volby pro farmaceutický průmysl.

otázka: lze pro normalizaci testů CETSA® použít protein pro domácnost?

A: normalizace obvykle není v testech CETSA® nutná, protože důležitým výstupem testu je hodnota EC50. Nicméně, v některých případech, například při práci se vzorky tkáně, množství materiálu, zapojena na datapoint může lišit poměrně výrazně a normalizace pak může být žádoucí. V CETSA® Classic (Western blotting), SOD1 se běžně používá, protože jeho teplota tání 80°C, je to dobrý neměnné referenční pro jakýkoliv cíl, a jako jeho molekulové hmotnosti 18 kDa usnadňuje detekci na Western blot. Gapdh by se nedoporučoval kvůli nižší teplotě tání (55 °C), což by znemožňovalo kontrolu cílů s vyšší teplotou tání.

Pokud chtějí normalizovat Alfa CETSA® assay, cofilin může být souzen (je AlphaLISA SureFire ultra kit pro celkem cofilin, s předběžné CETSA® data, ale ne plně ověřené kit zatím)