celogenomová analýza condensin závazné v Caenorhabditis elegans

Condensins i a II sdílejí dva SMC podjednotky MIX-1 a SMC-4, a jsou rozlišeny tři non-SMC podjednotek (Obrázek 1A). Kondenzin IDC se liší od kondenzinu I pouze jednou podjednotkou, variantou SMC-4 DPY-27. Použili jsme jednu nebo dvě různé protilátky proti každé podjednotce kondenzinu pro ChIP-seq a identifikovali vazebná místa běžná u více protilátek a biologických replikátů (další soubor 1: tabulka S1). Validace protilátek a očekávané koimunoprecipitační interakce z holokomplexu kondenzinu jsou uvedeny v dalším souboru 2. Párové korelace střední Čip-obohacení skóre clusteru condensin I-IDC a II podjednotky zvlášť, potvrzující rozdělení jednotlivých podjednotek mezi tři condensin typy (Obrázek 1B).

vazebné vzory tří kondenzačních komplexů s vysokým rozlišením jsou podobné

C. elegans kondenzin I a II mají částečně překrývající se, ale různé chromozomální lokalizace v mitóze a meióze, a kondenzin IDC je specificky zaměřen na X . Proto se očekává, že najít jiný ChIP-seq vzory pro condensin jsem, IDC a II. Místo toho, závazné vzory condensin jsem, IDC a II podjednotky byly obecně podobné (Obrázek 1C). Tato podobnost nebyla způsobena protilátka cross-reaktivita, protože HCP-6 protilátek, které nevykazuje žádnou zkříženou reaktivitu a není immunoprecipitate nějaké condensin I-IDC podjednotky , ukázal rozsáhlé ko-lokalizace s condensin I-IDC podjednotek (viz HCP-6 na Obrázku 1C). Kromě toho, pokud by překrytí kondenzinu II bylo způsobeno zkříženou reaktivitou s kondenzinem IDC, očekávali bychom obohacení vazebných míst kondenzinu II na X ,což tomu tak nebylo (obrázek 1D). Ve srovnání s condensin II, condensin IDC podjednotky důsledně měl vyšší Čip skóre na X, což naznačuje rozdíl v chromozomální sdružení dvou condensin komplexy zajat Čip (poznámka: různé váhy na X chromozomu a já na Obrázku 1C). Protože jsme provedli ChIP-seq ve smíšených embryích, většina buněk (více než 95% odhadovaných barvením 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)) byla v mezifázi. Nedostatek podjednotek kondenzinu I na autosomech (obrázek 1C a další soubor 3: Obrázek S1A) a předchozí pozorování, že condensin jsem lokalizuje na mitotické chromozomy po jaderné obálky členění naznačují, že většina ChIP-seq signál je z interfáze. Na podporu toho bylo prokázáno, že kondenzin II je jaderný během interfáze a vykazoval rovnoměrnější distribuci vazebných míst mezi všemi chromozomy (obrázek 1D).

KLE-2, HCP-6 a CAPG-2 jsou specifické pro kondenzin II, takže představují vazbu kondenzinu II. Condensin I a IDC sdílejí všechny tři non-SMC podjednotky, takže dále odkazujeme na signál ChIP-seq od DPY-26, DPY-28 a CAPG-1 od condensin I-IDC. Zaměřit se na místa, která jsou vázána jako komplex, zprůměrovali jsme čipový signál z podjednotek specifických pro kondenzinový Typ CAP. Kromě použití průměrných dat jsme ověřili, že každá analýza platí pro jednotlivé podjednotky, A v doplňkových číslech uvádíme HCP-6 a DPY-28. Identifikovali jsme soubor vysokou důvěru condensin I-IDC a II závazné míst, výběrem pouze těch ChIP-seq vrcholy, které byly konzistentní napříč dvěma nebo více non-SMC podjednotek (Obrázek 1D). Jak bylo uvedeno výše, 97% vazby kondenzinu i-IDC se vyskytlo na chromozomu X . Condensin II byl podobně rozděleny mezi autozomy a X Condensin II vázán na silnější condensin I-IDC míst na chromosomu X (Obrázek 1E a Další soubor 3: Obrázek S1B).

Condensin vazebná místa jsou obohaceny na aktivní stimulátorů

K identifikaci oblastí, kde condensins přednostně vázat, jsme analyzovali condensin vazebných míst s ohledem na několik genomické popisy. Vazebná místa kondenzinu byla významně obohacena na promotorech, v blízkosti genů tRNA a nekódujících RNA (obrázek 2A, další soubor 4: Obrázek S2). Aby se vyloučila možnost, že condensin-váže tRNA geny se vyskytují pouze na pořadateli, jsme odstranili tRNA geny, které byly v rámci 1 kb transkripční začátek stránky (TSS) a stanoveno, že přesah tRNA a condensin vazebná místa zůstala signifikantní (23% a 6% tRNAs překrývaly s condensin I-IDC a II místech, v tomto pořadí, P = 0,0002). Vazba kondenzinu v genech tRNA naznačuje, že nábor KONDENZINU zprostředkovaný TFIIIC může být zachován mezi C. elegans a kvasinkami .

Condensin stránky jsou obohaceny na promotéry a tRNAs, a závazné pozitivně koreluje s přepisem. A) obohacení nebo vyčerpání vazebných míst kondenzinu při různých genomických anotacích. Náhodné obohacení a p-hodnoty byly vypočteny permutačním testem náhodně rozdělujícím kondenzinové píky 10 000krát. U kondenzinu i-IDC I II dochází k významnému obohacení vazebných míst na promotorech 1 kb a v blízkosti nekódujících RNA (P = 0.0002), vyčerpání v genu těla (transcription start site (TSS) transkripce konci stránky (TES)) (P = 0,0002), a žádné významné obohacení nebo vyčerpání na 3′ genů (P > 0.05). (B) Condensin Čip signál je zarovnán na TSSs vyjádřené geny (top 25% RNA úrovni, pevné linky) a vyjádřil geny (spodní 25% do RNA úrovni, přerušované čáry). Okolní tečky představují 95% úroveň spolehlivosti. Jako kontrola je čipový signál imunoglobulinu G (IgG) na TSSs vykreslen šedě. (C) Spearman rank korelační koeficient mezi střední Čip skóre na 500 bp organizace a RNA úrovni jednotlivých genů jsou uvedeny za celý genom a X chromozóm. Existuje mírná pozitivní korelace mezi vazbou kondenzinu a transkripcí. (D) střední skóre čipu do 500 bp před TSS je vyneseno proti úrovni RNA každého genu. Condensin promotér-vázané geny (definované překrývání s condensin místě do 1 kb od TSS) se zvýrazní v oranžové barvě (condensin I-IDC) a modré (condensin II). (E) GC obsah 50 bp oken je vynesen přes kondenzin i-IDC a II vazebných vrcholů. Jako kontrola byl obsah GC přes 1500 náhodných souřadnic stanoven a vynesen stejným způsobem jako skutečné summity kondenzinu. Průměrný obsah GC je vysoký kolem vrcholu vazby kondenzinu.

Vazba byla nejvyšší v okruhu 500 bp od TSS (Další soubor 5: Obrázek S3A) a 45% condensin I-IDC a 62% condensin II vrcholy byly umístěny na promotéry. Condensin vazba na promotory pozitivně koreluje s transkripční aktivitou navazující genu (Obrázek 2B,C), ale ne všechny aktivní promotory byly vázány (Obrázek 2D). Genové Ontologie termín analýza vázán pořadatelé vykázaly mírný (1,3 krát), ale významné (P = 3.5 e-17) obohacení pro geny s vývoj embrya funkce (Další soubor 6: Tabulka S2). Přibližně 20% vysoce vyjádřil geny (horní kvartil RNA úrovni) měl condensin II vazebné místo v 1 kb, a asi 70% z X chromozomu geny měl condensin I-IDC vazebné místo do 1 kb. Proto, i když je transkripční aktivita důležitá, nestačí vysvětlit specifičnost vazby kondenzinu u určitých promotorů.

všimli jsme si, že všechna vazebná místa s kondenzinem vykazovala výrazné obohacení obsahu GC ve srovnání s okolními oblastmi a náhodnými souřadnicemi (obrázek 2E). U C .elegans je obsah GC promotorů chromozomu X vyšší než u autosomálních promotorů. Je možné, že vyšší obsah GC je funkcí sekvence DNA pro vazbu kondenzinu a promotory X se vyvinuly tak, aby obsahovaly vyšší obsah GC, aby podporovaly vazbu kondenzinu IDC.

Condensin vazebných míst výrazně shodují s podmnožinou transkripční faktory

určit další faktory, které odlišují condensin-vázané pořadatelé, jsme ve srovnání condensin a TF vazebná místa, a našel podmnožinu TFs, které se váže na stejná organizace jako condensins (Obrázek 3A). Předchozí studie ukázaly, že více TFs se váže na sadu vazebných míst s vysokou obsazeností (HOT). Došlo k překrytí 5% a 22% míst kondenzinu I-IDC a kondenzinu II s horkými místy (P = 0,0002). Význam překrytí s TFs zůstal stejný, když byly z analýzy odstraněny horké stránky (Další soubor 5: obrázek S3B). Procento překrytí pro každou TF závisí na počtu vazebných míst, a jsou uvedeny v Další soubor 5: Obrázek S3C. Mezi jednotlivými TFs, jsme zjistili, že 69% condensin II stránek a 53% LIN-13 lokalit se překrývají se navzájem, takže LIN-13 horní TF, které se výrazně překrývaly s condensin II.

Condensin II závazné překrývá s transkripční faktory non-náhodně, a vyjádření analýza naznačuje represivní funkce pro condensin II. (A) Transkripční faktor míst, z modENCODE jsou řazeny podle násobné obohacení překrývají s condensin vazebných míst. Násobné obohacení se stanoví jako poměr procentního překrytí pozorovaných oproti průměru náhodných distribucí kondenzinových míst 10 000krát napříč genomem. Výsledky ukazují, že vazba kondenzinu není náhodná s ohledem na vazebná místa TF. (B) Vennův diagramy znázorňují překrývání condensin II vazebná místa s LIN-13 (modENCODE_3342, embrya) a LIN-35 (modENCODE_3925, pozdě embryí) (top), s LIN-13 (vlevo dole), a s LIN-35 (vpravo dole). Podíl překrytí mezi kondenzinem II a LIN-13 A LIN-35 je vyšší v místech, která jsou obsazena oběma proteiny. Dané překrytí představuje počet vrcholů kondenzinu II překrývajících se s příslušnými místy LIN-13 a LIN-35. C) průměrné obohacení třísek z kondenzinu II, LIN-13 A lin-35 je vyneseno přes vrchol každého vrcholu kondenzinu II. Vazebná místa kondenzinu II jsou rozdělena do čtyř skupin. Horní skupina se skládá z condensin II vazebná místa se překrývají s LIN-13 a LIN-35, druhá se překrývá s LIN-13 pouze, třetí s LIN-35 jediná a poslední skupina se nepřekrývá ani s LIN-13 nebo LIN-35. Vrcholy jsou v sestupném pořadí na základě jejich obohacení čipů. Velké množství míst kondenzinu II vykazuje vysokou vazbu LIN-13, ale ne LIN-35. Vazba kondenzinu II je silnější v místech vázaných LIN-13 I lin-35. (D) diferenciální exprese analýza (RNA-seq) v kle-2 null heterozygote versus homozygotní larvální stadium 2/3 (L2/L3) larvy. Ukazuje se podíl genů vázaných nebo nevázaných KLE-2 se zvýšením nebo snížením hladiny transkriptu v homozygotním mutantu. Hladiny transkriptu proporcionálně více genů se zvyšují u mutantu kle-2. TF, transkripční faktor.

Lin-13 má retinoblastom protein (pRb) interakce motiv a funkce v vulvy vývoj s jedinou pRb homolog LIN-35 v C. elegans . V D. melanogasteru se po mutaci pRb snižuje vazba kondenzinu II na podjednotku dCAPD3 . Pokud v C. elegans, LIN-13 rekrutů condensin II prostřednictvím LIN-35, pak ti, LIN-13 lokalit, které jsou také vázány LIN-35 (576) by měl překrývat s condensin II více než LIN-13 lokalit, které nejsou vázány LIN-35 (1,033). Překrytí LIN-13 a LIN-35 ko-obsazený stránky s condensin II lokalit byl jen mírně vyšší než u LIN-13 míst, bez LIN-35, 60% a 50%, respektive (Obrázek 3B). Naopak, překrytí LIN-35 s condensin II byla vyšší u těch lokalit, které byly také vázány LIN-13 (45%) ve srovnání nevázaných míst (9%). To naznačuje, že potenciální interakce mezi LIN-13 a kondenzinem II je většinou LIN-35 nezávislá. LIN-35 funkce v rámci zachovaných multi-proteinový komplex nazývá DRM v C. elegans (hDREAM u lidí), která obsahuje také EFL-1 a DPL-1 . 555 DRM vazebných míst, které byly vázány LIN-13 ukázal větší překrývají s condensin II (63%) ve srovnání s 787 DRM stránky, které nebyly vázány LIN-13 (13%). Místa kondenzinu II jsme rozdělili do čtyř skupin podle překrytí vazebného místa s LIN-13 A LIN-35 (obrázek 3C). Toto seskupení je uvedeno, že velký počet condensin II lokalit vykazují vysokou LIN-13 závazné, ale ne LIN-35, což naznačuje, že pokud pRb-zprostředkované condensin II nábor je zachována v C. elegans, LIN-35 může záviset na přítomnosti LIN-13 pro condensin II náboru.

mutace Kondenzinu II způsobuje transkripční defekty, které naznačují represivní funkci

u kvasinek a D. melanogaster byl kondenzin zapojen do transkripční represe . Jedna nedávná studie na D. melanogaster ukázala, že podjednotka kondenzinu II CAPD3 je nutná pro transkripční aktivaci shluku antimikrobiálních peptidových genů . Abychom porozuměli úloze kondenzinu II v transkripční regulaci, provedli jsme RNA-seq u larev kle-2 null mutant L2 / L3. Maternálně naložený KLE-2 umožňuje kle-2 null mutant (ok1151 alela) vyrůstat jako sterilní dospělí. Porovnávali jsme genovou expresi u heterozygotních a homozygotních mutantů kle-2 v larvách L2/L3 před proliferací zárodečné linie, tedy obsahující téměř výhradně mezifázová jádra. Diferenciální exprese analýza pomocí DESeq2 identifikovány 356 geny, jejichž exprese byla výrazně odlišná v homozygotní ve srovnání s heterozygot larvy (false-discovery rate < 5%; DESeq2 výsledky jsou prezentovány v Další soubor 7: Tabulka S3). Většina diferenciálně exprimovaných genů se zvýšila (70%) spíše než snížila (30%) exprese. Analýza termínů genové ontologie neodhalila konkrétní skupinu genů, které byly ovlivněny mutací KLE-2. Podobně jako u publikovaných údajů pro kondenzin IDC neexistovala přímá korelace mezi vazbou KLE-2 a změnami genové exprese. Důležitější je, že mezi 46 rozdílně vyjádřil a KLE-2-vázané geny, 83% zvýšení exprese ve srovnání s 67% 310 geny, které nebyly KLE-2 vázané (Obrázek 3D), což naznačuje, že přímý účinek condensin II vazba je do značné míry represivní.

Histonů změny spojené s otevřenou chromatinu pozitivně korelují s condensin závazná

pochopit chromatinu kontextu condensin závazné, jsme analyzovali vztah mezi condensin vazebná místa a funkce chromatinu mapována modENCODE . Pozorovali jsme obecnou pozitivní korelaci mezi vazbou kondenzinu a značkami aktivního chromatinu. V kvasinkách počet vazebných míst kondenzinu v průběhu buněčného cyklu přímo koreluje s délkou chromozomu. Počet C. elegans condensin II vazebná místa nebyla přiměřená délka chromozomu (Obrázek 4A), ale pozitivně koreluje s délkou chromozomů spojené s aktivní histonů značky (Obrázek 4B). Chromozom X byl výjimkou, možná kvůli mechanismům kompenzace dávky, které mění jeho chromatin . Condensin I-IDC a II závazné přes genomu koreluje pozitivně s otevřenou chromatinu značky jako H3K27ac a negativně s heterochromatin značky jako H3K27me3 a H3K9me3 (Obrázek 4C a Další soubor 8: Obrázek S4). Tato korelace byla na doménové úrovni (jako analyzovány v 1 kb windows), jelikož jsme neměli vidět konkrétní modifikace histonů, která vyvrcholila na condensin míst v metagene’ typ analýzy (data nejsou zobrazena). V imunofluorescenčních studiích se centromerové proteiny překrývaly s vazbou kondenzinu II v mitotických buňkách . Jsme nepozorovali pozitivní korelace mezi CENP-a condensin II ChIP-seq signály ve smíšené fázi embrya, což naznačuje, že v interfázových jádrech (většina jader ve smíšené fázi embrya buňky), není tam žádný přesah. Alternativně, vzhledem k tomu, že CENP-váže pouze na malou podmnožinu CENP-pozitivní regionů v genomu / buňku , překrytí CENP-s condensin II může být zjevný pouze v jednotlivé buňky. Abychom pochopili, které chromatinové faktory nejlépe předpovídají vazbu kondenzinu, použili jsme přístup strojového učení. V C. elegans je H4K20me1 vysoce obohacen přes chromozom X DCC, a proto byl H4K20me1 nejvíce diskriminačním faktorem pro vazbu kondenzinu IDC (obrázek 4D). Pro kondenzin II jsou vysoce prediktivní vlastnosti chromatinu H3K27ac a CBP, oba markery aktivních zesilovačů, což naznačuje, že vazba kondenzinu je obohacena o aktivní zesilovače . Mezi 201 condensin II vazebných míst, které byly 2 kb od komentovaný TSS, 58 překrývaly s CBP vazebné místo (P = 0,0002).

Chromatin faktory spojené s otevřenou chromatinu a stimulátory pozitivně korelují s condensin závazné. A) počet píků kondenzinu II je vynesen s ohledem na lineární délku každého chromozomu. B) Počet píků kondenzinu II je vynesen proti délce chromozomu, který je pokryt píky H4K8Ac a H4K16Ac. Trendová linie přizpůsobená autosomálním datům naznačuje pozitivní korelaci (R2 = 0,9). (C) Condensin závazných v rámci 1 kb souvislé windows přes chromozom X (vlevo) a autozomy (vpravo) pozitivně korelují s aktivními značkami (například, H3K27ac, H2A.Z) a negativně korelují s represivní značky (například, H3K27me3, H3K9me3). (D) ansámblový klasifikátor (náhodné lesy) byl naučen předpovídat vazbu kondenzinu napříč genomem. Top 20 funkce (mezi 92 celková funkce, Doplňující soubor 1: Tabulka S1) s nejvyšší prediktivní sílu jsou vyneseny pro condensin I-IDC (vlevo) a condensin II (vpravo) s nejdůležitější funkce na vrcholu. Funkce, které jsou hodnoceny na základě průměrné snížení přesnosti, která popisuje rozdíl mezi chyba-rychlost skutečná klasifikace a míra výskytu chyb, po permuting funkce, v průměru za všechny klasifikátory (stromy).

DNA sekvence motivy obohacené na condensin vazebná místa ukázat specifické vlastnosti

i když condensin II vázán na condensin I-IDC stránek na X, condensin I-IDC se neváže na většinu autosomálně condensin II vazebná místa (Obrázek 1D). Abychom porozuměli specifičnosti náboru kondenzinu IDC a II, hledali jsme vlastnosti sekvence DNA, které odlišují vazbu kondenzinu II a kondenzinu IDC. Předchozí studie ukázaly, že kondenzin IDC je nejprve rekrutován na přibližně 100 míst a poté se šíří do dalších chromozomálních míst . 5A) a mutace motivu zrušila nábor kondenzinu IDC na extrachromozomálních polích, což naznačuje, že motiv DNA sekvence kondenzinu IDC hraje důležitou roli při náboru kondenzinu IDC.

našli jsme motiv DNA sekvence obsahující GCGC, který byl obohacen vazebnými místy kondenzinu II (obrázek 5A). Je zajímavé, že jak condensin II a condensin IDC motiv zahrnoval GCGC jádro, ale condensin IDC motivem byla prodloužena na jedné straně tím, AGGG, což naznačuje, že X-specifičnost condensin IDC nábor je dosaženo tím, kofaktory, které uznávají AGGG. Genomu-široký, 11% condensin II motivy byly vázány condensin II. Tedy, podobně jako jiné TFs (například ), jen část potenciální DNA sekvence motivy byly vázány condensin II. Další faktory jako přístupnost chromatinu a neznámé vedlejší faktory mohou být zapojeny v závazné specifičnost. Skutečně, pokud bychom vzali ty motivy, které byly v 2 kb okna výrazně obohacený o aktivní histonů označit, jako H4K16ac, procento motivy, které byly vázány zvýšil z 11% na 29%. Kromě toho, podobné condensin IDC motiv, který je více clusterů na vázaný stránek , jsme zjistili, že 1 kb genomické windows, která obsahovala více než jeden condensin II motiv byl asi 2,5-krát více pravděpodobné, že bude vázán condensin II, ve srovnání s těmi s pouze jedním motivem. Proto shlukování motivů a otevřený kontext chromatinu pomáhají určit výběr motivů, které jsou vázány.

Chromozomální nábor condensin IDCand condensin II zahrnuje i společné a odlišné regulátory. (A) jsou zobrazena loga motivů 10 BP dna sekvenčních motivů obohacených na horních místech kondenzinu. B) je znázorněno překrývání vazebných míst kondenzinu i-IDC, kondenzinu II a SCC-2. Čísla pod každým faktorem označují celkový počet vazebných míst. Překrývající se čísla jsou založena na počtu vrcholů SCC-2. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) zobrazení prohlížeče ilustrující signál SCC-2 ChIP-seq, který je většinou omezen na promotéry. D) vazba SCC-2 a kondenzinu II v dobře definovaném místě náboru kondenzinu IDC na X (rex-1). (E) V sdc-2 null mutant (TY1072), condensin I-IDC (DPY-26), condensin II (HCP-6, KLE-2) a SCC-2 závazné je snížena na rex-2 (levý panel), ale zůstává do značné míry podobné na autozomy (pravý panel). (F) Box graf poměru obohacení čipu v sdc-2 mutant versus divoký typ v rámci vazebných vrcholů SCC-2. Vazebná místa jsou klasifikována jako na autozomy, X s nízkými SDC-2 závazné a vysoké SDC-2 závazný. (G) qPCR analýza obohacení čipu DPY-27 u embryí izolovaných od dospělých, kterým byl podáván vektor (kontrola) a PQN-85 RNAi. Obohacení čipu je vyjádřeno jako relativní k zápornému kontrolnímu lokusu. Chybové pruhy jsou standardní odchylky od tří do pěti biologických replik. ChIP, chromatinová imunoprecipitace; DCC, komplex kompenzace dávkování.

ne všechna vazebná místa kondenzinu II mají motiv. Na těchto místech kondenzinu II bez motivu mohou být za vazbu odpovědné jiné faktory. Alternativně lze nízký podíl míst kondenzinu II (27%) obsahujících motiv vysvětlit možným rozšířením kondenzinu II po náboru. Neočekává se, že by místa šíření obsahovala motiv. Například u condensin IDC obsahuje motiv vysoké procento potenciálních náborových míst (56%), nikoli však místa šíření (8%). Systematické analýzy personálních kapacit zjištěných condensin II stránek je potřeba řešit, jestli tam je jakékoli šíření.

SDC-2 je nutná pro vazbu condensin I-IDC, condensin II a cohesin nakladač X chromozomální DCC stránky náboru

V metazoans, proteiny, které jsou zapojeny v condensin náboru chromozomy nejsou dobře rozuměl. V kvasinkách se vazba kondenzinu překrývá s vazbou kohezinového komplexu Scc2 / 4, což zvyšuje asociaci kondenzinu s chromozomy . Otestovat, zda je překrytí s Scc2 / 4 zachováno mezi kvasinkami a C. elegans, jsme provedli ChIP-seq analýza SCC-2 (také známý jako PQN-85) a zjistil, že pozoruhodný 95% SCC-2 stránky překrývaly s condensin I-IDC na X, a 60% s condensin II genomu-široký (Obrázek 5B). Překrývání zůstalo podobné, když byly vyloučeny horké oblasti (další soubor 9: obrázek S5A). Ne všechna místa kondenzinu se překrývají s SCC-2, což naznačuje, že na rozdíl od kvasinek kondenzin nezávisí na vazbě SCC-2 . Vazba SCC-2 byla vyšší u promotorů a pozitivně korelovala s transkripcí (další soubor 9: obrázek S5B). Motiv DNA sekvence obsahující GAGA byl přítomen v 58% vazebných míst SCC-2 (Další soubor 9: obrázek S5C). Na rozdíl od Drosophila Udusila-B , a podobný S. cerevisiae Scc2 , SCC-2 závazné není vysoká v transkribovaných oblastech, ale zůstal intergenic (Obrázek 5C).

téměř úplné překrytí (96%) vazebných míst kondenzinu II s kondenzinem i-IDC na chromozomu X podporuje existenci společných mechanismů pro chromozomální vazbu různých kondenzinů. Vzhledem k tomu, že condensin II a SCC-2 jsou vázány na náborová místa condensin IDC na X (obrázek 5D a další soubor 9: Obrázek S5D), předpokládali jsme, že náboráři kondenzinu IDC také rekrutují kondenzin II a SCC-2. Hermafroditově specifický nábor kondenzinu IDC do chromozomu X se provádí pomocí SDC-2, SDC-3 a DPY-30 . Provedli jsme HCP-6 a KLE-2 (condensin II), DPY-26 (condensin I-IDC) a SCC-2 ChIP-seq v embryích sdc-2 null mutant. V mutantu sdc-2 byla vazba DPY-26, HCP-6, KLE-2 a SCC-2 zrušena v místě náboru kondenzinu IDC specifickém pro X (rex-2) (Obrázek 5E). To je jasné, proč HCP-6 a KLE-2 vazba na rex-2 byla snížena místo připomínající autosomálně condensin stránky. Vazba SCC-2 na autozomy a místa chromozomu X, která jsou nezávislá na SDC-2, zůstala u mutantu sdc-2 podobná ve srovnání s místy, která byla vázána SDC-2 (Obrázek 5F). Naše výsledky naznačují, že SDC-2, hermafrodit-specifické TF, že rekruti condensin IDC na X chromozomu, také rekrutuje condensin II a cohesin načítání komplexu podjednotky SCC-2 na stejná místa (Další soubor 10: Obrázek S6). Předchozí genetické studie zjistí, že sdc-2 null mutace nezpůsobuje embryonální letalita u mužů, tak funkci condensin II a SCC-2 náboru SDC-2 není nezbytný pro obecné chromozomů kondenzaci a segregaci . Je možné, že nábor SCC-2 a kondenzinu II pomocí SDC-2 má regulační funkci genu specifickou pro hermafrodit.

otestovat, jestli SCC-2 má vliv na chromozomální asociace condensin IDC na místě náboru, jsme provedli kvantitativní PCR analýzu DPY-27 Čip v řízení proti SCC-2 povalení embryí. Krmením RNAi jsme byli schopni srazit hladiny SCC-2 přibližně o 80% (další soubor 9: obrázek S5E). Po SCC-2 knockdown jsme nezaznamenali významnou změnu vazby DPY-27 na rex-1 nebo rex-2 (Obrázek 5G). Důsledně imunofluorescenční analýza vazby kondenzinu I a II na meiotických chromozomech neprokázala významný rozdíl mezi mutanty divokého typu a scc-2 .