Chloramfenikol acetyltransferázu jako selekční marker pro chlamydiové transformace

pGFP::SW2, shuttle vector konstruovány podle Wang et al, obsahovaly β-laktamázy gen jako selekční marker. To také nese kočičí gen, který je fúzován s genem GFP . Zjistili jsme, že E. coli transformovaná plazmidem pGFP:: SW2 byla schopna růst v médiu obsahujícím chloramfenikol (konečná koncentrace: 170 µg / ml), což naznačuje, že kočičí gen může být také použit jako selekční marker pro experimenty s chlamydiovou transformací. Jak varoval Wang et al., nepříznivý účinek chloramfenikolu na hostitelské mitochondrie, jak prokázali Li et al. může ovlivnit užitečnost tohoto antibiotika pro transformaci chlamydií . V Li et al.podle zprávy byla minimální toxická koncentrace chloramfenikolu 10 µg / ml, což způsobilo mírné 20% snížení produkce ATP. Zjistili jsme, že zdánlivá nejnižší koncentrace chloramfenikolu, která zcela inhibovala tvorbu inkluze v plazmidu bez C. kmen trachomatis L2 označený jako L2R byl pouze 0,05 µg / ml (údaje nejsou uvedeny), což bylo hluboko pod koncentracemi toxickými pro hostitelské buňky. Proto jsme usoudili, že toto antibiotikum lze použít k výběru transformátorů exprimujících kočku bez významného namáhání hostitelských buněk.

transformovali jsme L2R pomocí pGFP:: SW2 a vybrali jsme jednu polovinu transformovaných buněk ampicilinem a druhou polovinu chloramfenikolem. Antibiotika (2 µg/ml ampicilinu nebo 0, 1 µg / ml chloramfenikolu) byla přidána do kultur po 10 hodinách po transformaci. Počínaje průchodem 2 byly jejich koncentrace zvýšeny na 5 A 0, 2 µg / ml a byly přidány v době inokulace. Poměr dělení mezi pasážemi zůstal 1: 1 z pasáže 1, i když pasáže 4. I když MIKROFON chloramfenikolu, která byla stanovena na nízké multiplicity infekce (~0.1 zařazení jednotek tvořících na buňku), byla 0,05 µg/ml, některé z untransformed chlamydiae byly čekal, že tvoří inkluze v přítomnosti 0,1 – 0.2 µg/ml antibiotika, protože jsme použili vysoký poměr EB k buňkám pro transformaci a účinnost inhibice růstu chlamydií antibiotiky je ovlivněna množstvím infekce . S výše popsaným výběrovým protokolem bylo v kulturách vybraných ampicilinem pod mikroskopem s fázovým kontrastem zjištěno, že téměř 100% buněk obsahuje inkluzi s aberantními RBs v počátečním průchodu. Aberantní inkluze obsahující RB byly stále přítomny v malém podílu buněk při průchodu 2, ale byly většinou nahrazeny zjevně normálními inkluzemi při průchodu 3. Normální inkluze byly nalezeny v přibližně 20% buňkách a abnormální inkluze byly zřídka pozorovány při průchodu 4. Při průchodu 5, který byl výsledkem inokulace s 10% sklizní z průchodu 4, byly v 80% buňkách nalezeny inkluze; zdá se, že žádná z těchto inkluzí neobsahovala aberantní RBs.

Protože chloramfenikol nezpůsobuje chlamydiae tvoří aberantní RBs, usoudili jsme, rezistence na antibiotika zahrnutím velikost. Inkluze menších než normálních velikostí byly detekovány téměř ve všech buňkách při průchodu 1. Nějaký, ale velmi malé velikosti, inkluze byly nalezeny při průchodu 2, a většina z těchto inkluzí byla nahrazena inkluzemi normální velikosti průchodem 3. Inkluze normální velikosti byly nalezeny ve více než 20% buňkách při průchodu 4. V pasáži 5, získané po očkování s 10% průchod 4 sklizeň a zvýšení chloramfenikol koncentrace (0,2 µg/ml 0,5 µg/ml), normální velikosti inkluze byly nalezeny v téměř 100% buněk 0000000.

kromě zjevného odporu k výběru agentů, použili jsme GFP exprese a obnova glykogenu jako další markery pro úspěšnou transformaci . EBs sklizené z chodby 5, byly použity infikovat McCoy buněk na 1:100 ředění sazba (číslo rovnocennosti) pro experimenty stanovení GFP exprese a syntézy glykogenu (Obrázek 2). Jak se dalo očekávat, ani wild-type plazmid-plné C. trachomatis L2 (434/bu) (Obrázek 2A), ani untransformed plazmid-zdarma L2R (Obrázek 2B) vyjádřil GFP. V souladu se zjištěními, že syntéza glykogenu v C. trachomatis vyžaduje jeho plasmidu , jód skvrny ukázal, že glykogen bylo nahromaděné v vměstků typu wild-type L2 (Obrázek 2A), ale ne ty, L2R (Obrázek 2B). V přítomnosti 5 µg/ml ampicilinu, který inhibuje RB divize, non-transformované L2R (Obrázek 2C) tvoří inkluze obsahující obří RBs bez produkujících glykogen; vzhledem k tomu, že chloramfenikol (výsledná koncentrace: 0,5 µg/ml) inhiboval tvorbu viditelných inkluzí v L2R infikovaných buněk (Obrázek 2D). V souladu s údaji zveřejněnými Wangem a kol. , pGFP::SW2-transformovaný L2R vybrán s ampicilinem tvořil GFP-pozitivní inkluze s glykogenem (obrázek 2E). pGFP:: SW2-transformovaný L2R vybraný chloramfenikolem také vytvořil GFP-pozitivní inkluze obsahující glykogen (obrázek 2F). Jak se dalo očekávat, ampicilin-vybrané transformanty byly schopné tvořit normální velikosti, GFP-pozitivní, glykogen-obsahující inkluze v přítomnosti chloramfenikolu (Obrázek 2G); podobně, chloramfenikol-vybrané transformanty byly zcela odolné vůči ampicilinu, vyjádřil GFP a vyrábí glykogenu (Obrázek 2H). Tyto výsledky naznačují, že kočičí gen v pGFP::Plazmid SW2 je funkční u chlamydií a rezistence vůči chloramfenikolu může být použita jako selekční marker pro chlamydiovou transformaci.

Zařazení GFP exprese a syntéza glykogenu z pGFP::SW2 transformanty C . trachomatis L2. Untransformed plazmid-plný kmen 434/bu (A), untranformed plazmid-zdarma kmen L2R (B-D), a proměnil L2R vybrané buď s ampicilin (E, G) nebo chloramfenikol (F, H) byly kultivovány buď s médiem obsahujícím uvedené antibiotiky nebo antibiotiky-free médiu. Obrazy inkluzí v nenatřených a jodem obarvených kulturách byly získány fázovou kontrastní mikroskopií nebo fluorescenční mikroskopií 48 h po inokulaci. Ve všech panelech jsou fázový kontrast a obrázky GFP překrývatelné.

dále jsme odstranili Gen β-laktamázy z pGFP::SW2 plasmidu, jak je popsáno v “Metody” sekce, a použít výsledné pGFP-CAT::SW2 plazmidu pro transformaci L2R. Transformované chlamydiae byly podrobeny výběru s chloramfenikolu pomocí stejném režimu, jak je popsáno výše. Inkluze rezistentní na chloramfenikol se objevily v přibližně 20% infikovaných buněk v kultuře průchodu 4. Fluorescenční mikroskopie a jódu skvrn odhalil ONZP – a glykogen-pozitivní inkluze v buňkách, které byly infikovány EBs sklizené z chodby 5, a kultivovány v přítomnosti chloramfenikolu (Obrázek 3, horní panel). Nicméně, v důsledku nedostatku β-laktamázy v pGFP-CAT::SW2 plasmidu, transformanty nebyli schopni normální formě inkluzí v přítomnosti ampicilinu; místo toho, jejich inkluze byly naplněny nenormální RBs. Zatímco nepravidelné inkluze byly pro GFP stále pozitivní, byly z velké části bez glykogenu (obrázek 3, dolní panel). Po průchodu 5 byly transformanty PGFP-CAT::SW2 kultivovány 0,5 µg / ml chloramfenikolu pro další čtyři průchody v poměru 1: 100 pro každý průchod. Všechny inkluze na průchod 9 měl stejný vzhled jako inkluze plazmid-plná chlamydiae a ne, že plasmidu-zdarma L2R, a všechny byly nalezeny vyjádřit GFP (údaje nejsou uvedeny). Tyto výsledky dokazují, že gen CAT v plazmidu pGFP-CAT:: SW2, podobně jako plazmid pGFP:: SW2, funguje jako selekční marker pro transformaci C. trachomatis.

Zařazení GFP exprese a syntéza glykogenu v L2R transformována s pGFP-CAT::SW2. Buňky infikované transformátory vybranými chloramfenikolem byly vystaveny buď chloramfenikolu nebo ampicilinu. Obrazy inkluzí v nenatřených a jodem obarvených kulturách byly získány fázovou kontrastní mikroskopií nebo fluorescenční mikroskopií 48 h po inokulaci. Fázový kontrast a obrázky GFP jsou překrývatelné.

je třeba poznamenat, že Tam et al. již dříve se pokusil vyvinout transformační systém s genem CAT jako selektivním markerem . V této studii, raketoplánový vektor obsahující kočičí gen byl elektroporátován do EBs C. trachomatis E (kmen UW-5/CX) a L2 (kmen 434 / Bu). Ačkoli jak kočičí mRNA, tak enzymová aktivita byly detekovatelné v počátečních kulturách transformovaných chlamydií, autoři nedokázali získat stabilní transformanty po selekci chloramfenikolem pro 4 pasáže. Je důležité poznamenat, že oba kmeny elektroporované obsahují nativní plazmid, který sdílí stejný původ replikace s rekombinantním plazmidem použitým pro transformaci . Od Wang et al. byli schopni získat stabilní transformanty rezistentní na penicilin pouze z L2R, plazmidu bez C. trachomatis L2 varianta, ale ne divoký typ, plasmid-replete 434 / Bu, za jinak identických experimentálních nastavení, není zpětně překvapující, že Tam et al. nepodařilo se odvodit stabilní chlamydie rezistentní na chloramfenikol.