cis–trans izomeráza nenasycené mastné kyseliny u Pseudomonas a Vibrio: biochemie, molekulární biologie, a fyziologická funkce unikátní stresu adaptivní mechanismus,

Abstrakt

Izomerace cis na trans-nenasycených mastných kyselin je mechanismus, který umožňuje Gram-negativní bakterie rodů Pseudomonas a Vibrio přizpůsobit se několik forem životního stresu. Rozsah izomerace zřejmě koreluje s tekutost vlivy, tj. zvýšením teploty nebo hromadění membrána-toxické organické sloučeniny. Trans mastné kyseliny jsou generovány přímou izomerací příslušné konfigurace CIS dvojné vazby bez posunu její polohy. Konverze cis nenasycených mastných kyselin na trans je zjevně nápomocná při adaptaci tekutosti membrány na měnící se chemické nebo fyzikální parametry buněčného prostředí. Takový adaptivní mechanismus se jeví jako alternativní způsob regulace tekutosti membrány při inhibici růstu, např. vysokými koncentracemi toxických látek. Cis–trans izomeráza (Čoi) činnost je constitutively přítomný a je umístěn v periplasma, vyžaduje to ani ATP, ani žádné jiné jako kofaktor NAD(P)H nebo glutathion, a to funguje v nepřítomnosti de novo syntézu lipidů. Jeho nezávislost na ATP je v souladu s negativní volnou energií reakce. cti kóduje polypeptid s N-terminální hydrofobní signální sekvence, která se štěpí během nebo krátce po enzymu je transportován přes cytoplazmatickou membránu do periplasmic prostor. Funkční hem-vazebné místo pro cytochrom c-typ byl identifikován v předpokládané Cti polypeptid a velmi nedávno, přímý důkaz byl získán, že izomerace neobsahuje přechodné nasycení dvojné vazby.

1 úvod-historie

ve všech živých buňkách ovlivňuje stres způsobený přísnými změnami prostředí membrány. V důsledku toho dochází k narušení integrity membrány, a proto je narušena funkce jako bariéra, jako matrice pro enzymy a jako převodník energie . Pokud nejsou přijata protiopatření, může dojít k inhibici růstu nebo dokonce ke smrti buněk. Hlavní adaptivní odpovědí buněk je udržet tekutost jejich membrán na konstantní hodnotě bez ohledu na skutečné podmínky prostředí. Takové stabilizaci membrány tekutosti známý jako ‘homeoviscous adaptace’ je přinesla změny ve složení mastných kyselin membránových lipidů, představuje převládající odpověď bakterií na membrány aktivní látky nebo měnících se podmínkách prostředí . Tento základní mechanismus byl zkoumán a popsán ve slavné práci Ingram na konci 70. let minulého století . Nicméně, až do konce 80. let, cis konfigurace dvojné vazby byl stále považován za jediný vyskytující se přirozeně v bakteriálních mastných kyselin. Zlepšení analytických technik dělení zejména zavedením kapilárních kolon v plynové chromatografii usnadnilo jasnou diferenciaci příbuzných methylesterů mastných kyselin a u některých prokaryot byla zjištěna nová třída mastných kyselin, tj. První zprávy o trans izomerech nenasycených mastných kyselin byly pro Vibrio a Pseudomonas teprve před 10 lety. To může být prokázáno tak, že trans nenasycené mastné kyseliny jsou syntetizovány in vivo z acetátu u Pseudomonas atlantica, i když, na základě známých biosyntetické cesty nenasycených mastných kyselin, tam byl žádné vysvětlení, je to možné, jak tyto mastné kyseliny by mohly být vytvořeny.

krátce poté, co bylo prokázáno, že přeměna cis na trans nenasycené mastné kyseliny představuje nový adaptivní mechanismus umožňující bakteriím měnit jejich membránovou tekutost u dvou druhů, tj. v psychrofilní bakterii Vibrio sp. kmen ABE-1 v reakci na zvýšení teploty a Pseudomonas putida P8 jako adaptace na toxické organické sloučeniny, jako jsou fenoly .

Naše minireview shrnuje současné znalosti a pokroky, jak se stav objektu s důrazem na poměrně efektivní a elegantní mechanismus umožňující bakterií přizpůsobit se změnám životního prostředí, které ovlivňují plynulost membrány.

2 Fyziologie a funkce cis–trans izomeráza (Čoi) z nenasycených mastných kyselin

Oba, Vibrio sp. kmen ABE-1 a v P. putida P8, jasné zvýšení normálně nízkého množství trans nenasycených mastných kyselin je pozorováno, když jsou buňky vystaveny zvýšeným teplotám nebo toxickým koncentracím fenolu. Pěstování buněk P. putida reagovat na fenolu v závislosti na koncentraci způsobem, tj. zvýšení trans a současně snížení v příslušné cis nenasycených mastných kyselin koreluje s množstvím fenolu nahromaděné v membráně . Taková přeměna není závislá na růstu, protože se vyskytuje také v nerostoucích buňkách, ve kterých poměr mezi nasycenými a nenasycenými mastnými kyselinami a celkovým množstvím nenasycených mastných kyselin nelze změnit kvůli nedostatku biosyntézy lipidů . Důsledně probíhá reakce v buňkách, ve kterých je biosyntéza mastných kyselin inhibována ceruleninem . Konverze Cis-trans má kinetiku podobnou enzymu a dosahuje svého konečného poměru trans k cis 30 minut po přidání membránově toxických látek. Jako míra konverze je ovlivněna chloramfenikolu bylo konstatováno, že systém je constitutively dárek a nevyžaduje de novo biosyntézu bílkovin .

kyselina olejová (C18: 1Δ9cis), která normálně není syntetizována P.putidou P8, je však začleněna do membránových lipidů v doplněných kulturách. Po přidání toxické 4-chlorfenolem koncentrace kyseliny olejové byla převedena do jeho trans-izomer, tj. elaidic kyselina (C18:1Δ9trans). Toto zjištění dokládá, že trans mastné kyseliny jsou syntetizovány přímou izomerace cis na trans nenasycené mastné kyseliny bez posunutí polohy dvojné vazby . Zvýšení trans nenasycených mastných kyselin bylo doprovázeno poklesem příslušné CIS nenasycené mastné kyseliny, zatímco celkové množství obou bylo udržováno konstantní při jakékoli koncentraci přidaných toxinů . Systém nevyžaduje ATP ani žádný jiný kofaktor, jako je NAD (P) H nebo glutathion. Jeho nezávislost na energii poskytující ATP je v souladu s negativní volnou energií cis na trans reakci .

Všechny tyto údaje vedly k tvrzení o cis–trans izomerace je nový adaptivní reakci na bakterie, které jim umožní vypořádat se zvýšením teploty nebo toxické koncentrace membránových rušivých sloučenin, podmínky, které by jinak ovlivnit jejich plynulost membrány .

přínos konverze pochází ze sterických rozdílů zobrazených cis a trans nenasycenými mastnými kyselinami. Vysoký obsah nasycených mastných kyselin v membránách umožňuje acylových řetězců mastných kyselin tvoří optimální hydrofobní interakce mezi sebou navzájem, nakonec vedoucí k zhutnění, tuhé membrány. Nasycené mastné kyseliny mají obecně mnohem vyšší teplotu přechodu nebo teplotu tání ve srovnání s nenasycenými mastnými kyselinami cis. Fosfolipidy obsahující nasycené mastné kyseliny 16: 0 mají přechodovou teplotu, která je o 63°C vyšší než teplota obsahující nenasycené mastné kyseliny 16: 1 cis. Teplota fázového přechodu membrán se zvyšuje se zvyšujícími se poměry nasycených a nenasycených mastných kyselin. Dvojná vazba cis nenasycené mastné kyseliny vyvolává nepohyblivý ohyb s úhlem 30° v acylovém řetězci. Proto, vysoce objednat balíček acylových řetězců v membránách je narušen, což má za následek nižší teploty fázového přechodu těchto membrán . Nenasycené mastné kyseliny v konfiguraci cis s ohnutými sterickými strukturami (tj. V ostrém kontrastu, dlouhý, prodloužený stérické struktura trans konfigurace postrádá zlomu a je schopen chcete-li vložit do membrány podobně jako nasycené mastné kyseliny .

bakterie se přizpůsobují zvýšení tekutosti membrány zvýšením stupně nasycení fosfolipidových mastných kyselin a v některých případech změnou z cis na trans konfigurace jejich nenasycených mastných kyselin. . Jedna hlavní nevýhoda změn stupně nasycení jako stresové reakce pochází z její přísné závislosti na růstu buněk a biosyntéze mastných kyselin. V důsledku toho bakterie používající tento mechanismus nejsou schopny provádět post-biosyntetické modifikace své membránové tekutosti. Ve skutečnosti bylo pozorováno, že rozpouštědla způsobují posun poměru nasycených k nenasyceným mastným kyselinám až do koncentrací, které zcela inhibují růst. V přítomnosti vyšších, tj. toxických koncentrací buňky nemohou reagovat a nejsou tedy schopny se těmto podmínkám přizpůsobit nebo dokonce umírají . Izomerizace cis na trans nenasycené mastné kyseliny se dosud vyskytovala pouze u kmenů rodů Pseudomonas, včetně hlavních zástupců P. putida a P. aeruginosa a Vibrio představuje řešení problému závislosti na růstu, protože funguje také v nerostoucích buňkách. Ačkoli změna z cis na trans nenasycenou dvojnou vazbu nemá stejný klesající účinek na tekutost membrány jako přeměna na nasycené mastné kyseliny, stále způsobuje podstatný účinek na tuhost membrány .

po prvních pozorováních založených hlavně na fenolických sloučeninách byla testována řada organických rozpouštědel na jejich schopnost aktivovat cti, kvalitativně a kvantitativně. V souladu s tím stupeň izomerace zřejmě koreluje s toxicitou a koncentrací organických sloučenin v membráně . Antimikrobiální působení rozpouštědla koreluje s jeho hydrofobicita způsobem vyjádřené logaritmus rozdělovacího koeficientu látky ve směsi n-oktanol a vodu (log pow) . Organická rozpouštědla s log pow mezi 1 a 5 jsou vysoce toxické pro mikroorganismy, protože se oddíl přednostně v membránách, kde způsobí zvýšení membránové fluidity, což by nakonec vedlo k nespecifické permeabilization . Vztah mezi logP hodnotu složeného a jeho toxicity je uveden v Tabulce 1, ve které 11 zkoumány sloučeniny jsou uvedeny podle jejich rostoucí hodnoty logP. Na Obr. 1 logP hodnoty se vynesou naměřené odhadované koncentrace, která způsobí 50% inhibici růstu (ES 50) a, současně, koncentrace sloučenin, které jsou příčinou půl-maximální zvýšení trans/cis (TC 50) poměr bakterií. Existuje tedy přímý vztah mezi toxicitou organických rozpouštědel a jejich aktivačními účinky na Cti, je to však zcela nezávislé na chemických strukturách sloučenin.

Od roku 1989, kdy P. putida kmen byl objeven které rostly v médiu obsahujícím druhé fáze obecně vysoce toxický toluen, styren, nebo xylen, několik dalších P. putida kmeny byly nalezeny s podobnými vlastnostmi , a mnoho výzkumných skupin se snažili odhalit základní mechanismy rozpouštědla tolerance. U většiny těchto bakterií se Cti podílela na toleranci rozpouštědel.

nejen organická rozpouštědla nebo zvýšení teploty, ale i některé další stresové elicitory byly testovány na jejich účinek na Cti. Stručně řečeno, všechny membrány ovlivňující podněty, jako jsou organická rozpouštědla, osmotický stres (způsobený NaCl a sacharózou), těžké kovy, tepelný šok a membránově aktivní antibiotika, aktivují systém . Nicméně, stresové podmínky, jako je osmotický stres způsobený glycerol, studený šok, a vysoké pH, které je známo, nesmí být aktivátory buněčného K+-příjmu — první buněčné reakce na poškození membrány vedoucí ke zvýšení permeabilization — neměl způsobit aktivaci Cti . Taková zjištění jasně ukazují, že poměr cis / trans je pravděpodobně součástí obecného mechanismu stresové reakce mikroorganismů .

3 Biochemie a molekulární biologie Cti

Následující fyziologické popis celkové funkce Cti bakterií přizpůsobit se různým stresům, molekulární biologické a biochemické vyšetřování byly provedeny charakterizovat tento jedinečný adaptivní odezvy systému.

na Základě testů Čoi aktivity v buňce oddělení cytoplazmatické membrány byl považován za místo enzymu, kde také jeho substráty, fosfolipidové mastné kyseliny, jsou přítomny. Překvapivě však byla cti poté vyčištěna z periplazmatické frakce Pseudomonas oleovorans a Pseudomonas sp. kmen E-3 . Klonování enzymu umožnilo jeho izolaci jako his značený protein P. putida P8 heterologně exprimovaný v Escherichia coli. Cti je neutrální protein 87 kDa a bylo prokázáno, že je monocistronicky transkribován a konstitutivně exprimován. Nukleotidová sekvence genu cti z P. putida P8, P. putida DOT-T1E a P. oleovorans Gpo12 konečně zřejmé, že izomeráza má N-terminální hydrofobní signální sekvence, které jsou odštěpeny a po zaměření enzymu periplasmic prostor.

byl zkonstruován cti knockout mutant P. putida DOT-T1E, který není schopen isomerizovat cis nenasycené mastné kyseliny. Tento mutant má míru přežití, když je šokován 0.08% (obj./obj.) toluen nižší než wild-type napětí, a to se zobrazí i delší lag fázi, než rodičovský kmen, když dospělý s toluenu dodávané v plynné fázi , výsledky, které jasně ukazovat Cti v toluenu reakce na tento kmen. Nicméně, cis–trans izomerace je nepravděpodobné, že by být pouze nutné adaptační mechanismus organických rozpouštědel, protože kmeny jsou známé, které mohou provádět izomerace a jsou stále citlivé na rozpouštědla .

Holtwick et al. poskytl důkaz, že enzym je protein typu cytochromu c, protože by mohl najít místo vázající hem v předpokládaném polypeptidu Cti. Pro enzymový přípravek z Pseudomonas sp. kmen E-3, který je pravděpodobně homologní s produktem genu cti P. putida P8, bylo navrženo, že železo (pravděpodobně Fe3+) hraje klíčovou roli v katalytické reakci . Bylo zjištěno, že isomerace Cis–trans je nezávislá na kardiolipin syntáze, enzymu usnadňujícím dlouhodobou adaptaci membrány zvýšenou syntézou kardiolipinu .

velmi nedávno byl objasněn molekulární mechanismus izomerizační reakce. V doplnění experimenty s manželskou deuterované kyseliny olejové bylo prokázáno, že kyselina olejová byla převedena výhradně do double deuterovaný elaidic kyseliny po aktivaci Cti. Musí být vyloučena přechodná saturace dvojné vazby během izomerace, stejně jako spojená reakce hydratace a dehydratace . Proto je navržen enzymatický mechanismus: komplex enzym–substrát je tvořen ve kterém elektrofilní železa (pravděpodobně Fe3+), poskytována hemové doméně přítomen v enzymu, odstraňuje elektron z cis dvojná vazba, přenos sp2 propojení do sp3. Dvojná vazba se pak po rotaci rekonstituuje do trans konfigurace. Schéma tohoto navrhovaného enzymatického mechanismu je uvedeno na obr. 2. Takový mechanismus je v souladu s místně řízená mutageneze experimenty prováděné zničit heme-binding motif v Cti P. putida P8 . Tyto mutace vedou ke ztrátě funkce enzymu, a tak poskytují důkaz o přítomnosti cytochromu c a hemu v katalytickém centru enzymu. Vzhledem k tomu, že reakce enzymu nezávisí na kofaktoru, aktivita Cti se liší od všech ostatních známých enzymů obsahujících hem působících na mastné kyseliny jako substráty. Kofaktor však není potřeba, protože není spotřebována žádná čistá energie elektronů.

Další indikací pro jeho jedinečnost pramení z podobnosti hledání: Cti ukázal žádné významné podobnosti s homologní peptidy při předpokládané sekvence aminokyselin byla ve srovnání s jinými proteiny. Není však divu, že srovnání aminokyselinových sekvencí sedmi až po současné známé proteiny cti je všechny identifikovalo jako polypeptidy cytochromu C-typu obsahující hem . Bez ohledu na taxonu, hemové skupině cytochromu c-druh je přítomen jako vysoce konzervovaným motivem a jako funkční domény ve všech enzymů , zejména ve srovnání heme-binding site v Cyt c proteiny se nachází mezi hemu-vinylové skupiny a dva cysteines nalézt v zachovaných heme-binding motif CXXCH.

ve všech sekvencích Cti šesti dosud zkoumaných kmenů Pseudomonas je přítomna N-terminální signální sekvence, což svědčí o periplazmatické lokalizaci Cti. Taková lokalizace již byla prokázána u p. oleovorans a P. putida DOT-T1E . Signální peptid charakteristický pro sekreci závislou na Sec však není přítomen v proteinu cti v. cholerae. Vícenásobné sekvenční zarovnání sedmi známých proteinů cti odhalilo, že proteiny z kmenů Pseudomonas a Vibrio tvoří fylogenetický strom složený ze tří hlavních větví, což naznačuje společného předka enzymu. Zajímavé je, že předpověděl polypeptid od V. cholerae samozřejmě netvoří samostatnou skupinu, ale spíše vychází z různorodé skupiny proteinů z P. aeruginosa a P. sp. E-3 . Velmi nedávno, srovnávací studie odhalily, že geny známé cti mohou být také přítomny v genomech bakterií patřících do rodů Methylococcus a Nitrosomonas. Je také známo, že tyto organismy obsahují trans nenasycené mastné kyseliny . Přímé fyziologické nebo biochemické důkazy o přítomnosti Cti v těchto bakteriích však stále chybí.

4 Nařízení Cti

Jedním z hlavních otevřených otázek ohledně Cti nenasycených mastných kyselin je to, jak činnost této konstitutivně exprimovaných periplasmic enzymu je regulována. Jednou z možností by byl komplexní model, ve kterém jsou substráty enzymu, cis nenasycené mastné kyseliny, odštěpeny z periplazmatické fáze membránových fosfolipidů. Výsledný zdarma nenasycené mastné kyseliny by pak být izomerizovaný Cti akci a následně znovu připojit k lysophospholipid, což má za následek fosfolipidu obsahující trans-nenasycené mastné kyseliny . Ještě, že tak složitý model není ve shodě s údaji, které potvrzují Cti aktivity v buňkách v klidovém stavu a při úplné absenci zdrojů energie , jako alespoň znovupřipojení modifikované mastné kyseliny na membránu bude potřebovat energii.

Regulace enzymové aktivity však může být dosaženo tím, že prostě dává na aktivní centrum enzymu schopnost dosáhnout svého substrátu, dvojná vazba, která zase závisí na plynulost stavu membrány. V souladu s tím pozorovaná regio-specificita enzymu odráží pronikání aktivního místa izomerázy do specifické hloubky v membráně . Hydrofilní struktura Cti a její periplazmatické umístění podporují předpoklad, že enzym může dosáhnout pouze svého cíle, tj. na dvojné vazby nenasycených mastných kyselin, které jsou umístěny v určité hloubce membrány, kdy membrána je ‘otevřen’ do podmínek životního prostředí, které způsobují rozpad membrány . Již dříve bylo prokázáno, že snížení pořadí acylového řetězce může vést ke zvýšené penetraci a translokaci proteinů v membránách . Obdobně na některých phospholipases, je možné, že Čoi zobrazuje hlubší proniknutí do membrány při uspořádání acylových řetězců je snížená a rozteč fosfolipidu hlavu skupiny, je zvýšené. To je také jasně představit, že zmenšování balení membrán umožní dvojné vazby, aby přístup membránové povrchy častěji , nakonec usnadnění interakce s izomeráza . Jako acyl řetězce balení je zvýšena o cis-trans izomerace z nenasycených mastných kyselin , průnik bílkovin by být neutralizována a, současně, cis-trans izomerace inhibována, nakonec vede v těsné nařízení acyl řetězce balení bez zapojení nepřímého signalizační mechanismy nebo cesty. Po odstranění membrány aktivní látky, oživení pravidelně nízké trans-a cis-poměr největší pravděpodobností se vyskytuje v normálním de novo syntézu all-cis-mastných kyselin, protože reverzní (trans, cis) proces bude vyžadovat vstupní energie.

Takový model pro regulaci Cti činnost také dostatečně vysvětluje často uvádí vztah mezi mírou cis–trans izomerace a toxicity způsobené určité koncentraci environmentální stresový faktor . Jako další výsledek reakce katalyzované enzymem snížení membránové fluidity dochází a stejně jako enzym nemůže dosáhnout svého cíle, když membránové fluidity dosáhl své normální úrovni enzymu je nucen z dvojvrstvy .

5 Závěrečné poznámky

i když cis–trans izomerace nenasycených mastných kyselin, nebylo zcela zřejmé, bylo jasné, že to je součástí obecné stresové reakce systému v Pseudomonas a Vibrio buněk. Další indikací pro obecnou funkci Cti je také často popisovaná závislost na indukci/aktivaci dalších mechanismů stresové reakce .

je zřejmé, že představuje naléhavý adaptivní mechanismus umožňující rychlé modifikace membrán, aby se vyrovnaly s vznikajícím environmentálním stresem. Taková rychlá reakce, působící v minutách, poskytuje čas pro další mechanismy v závislosti na růstu buněk, aby se usnadnila jejich role v adaptivní reakci, protože okamžitá reakce zaručuje přežití za různých stresových podmínek. Ohledně rozpouštědla tolerance, druh kaskády rychle (naléhavé), střednědobé a dlouhodobé mechanismy zřejmě společně pracovat na dosažení plné adaptace na environmentální stres. Cti nepochybně představuje jeden z hlavních naléhavých systémy, které pomáhají buňkám odolávat první toluen šok, nakonec umožňuje aktivaci a indukci další adaptivní mechanismy, které nakonec vyvolat úplné přizpůsobení .

Protože jeho jednoduché funkce a účinnost, a proto to funguje bez složitých předpisů, je úžasné, že takový cis k trans izomerace mechanismus není všude přítomen u Gram-negativních bakterií. Možné vysvětlení může pocházet z rozšířeného výskytu dvou rodů Pseudomonas a Vibrio. Mezi nespecializovanými bakteriemi jsou členové rodu Pseudomonas známí jako vysoce adaptabilní mikroorganismy, které dobyly všechny výklenky velkého počtu ekosystémů zahrnujících půdu, lidskou kůži a mořskou vodu. Členové rodu Vibrio také dobyli širokou škálu ekosystémů, včetně půd a hlubokého moře. Aby bylo možné kolonizovat všechny tyto výklenky, musí být extrémně flexibilní a přizpůsobivé měnícím se podmínkám prostředí. Cti poskytuje buňkám účinný mechanismus k dosažení takové adaptability. To se nevyžaduje u jiných gramnegativních bakterií, jako je E. coli, které se specializují na život v gastrointestinálním traktu savců, kde mohou žít šťastně bez takového naléhavého mechanismu adaptace membrány.

membránové lipidy nabízejí slibný nástroj jako biomarkery pro analýzu změn mikrobiální populace. Ve skutečnosti, Guckert et al. navrhli použít poměr trans / cis větší než 0,1 (normální index hlášený pro většinu vzorků životního prostředí) jako index hladovění nebo stresu. Jako měření profilů mastných kyselin se stala rutinní metody v mnoha laboratořích, to zní jako slibný přístup k posuzování toxických účinků. Stanovení indexu trans / cis tedy může být cennou možností při studiu toxicity přírodních vzorků, zejména pokud nelze provádět testy závislé na růstu, např. v přírodních stanovištích. Hlavní oblasti použití tohoto indikátoru se zdá být měření toxicity a environmentální stres v průběhu in situ bioremediační procesy, kde profilů mastných kyselin mají význam jako značka pro ekologické šetření půdní mikroflóru. Například během bioremediace znečištěných míst může být hladina trans nenasycených mastných kyselin použita jako marker pro celkové snížení stresu a stresu pro sledování procesu biodegradace . Aplikace cis-trans izomerace jako hodnotícího nástroje pro obecnou toxicitu organických sloučenin již byla popsána pro aromatické karbonylové sloučeniny . Další studie zaměřené na a zlepšení využití isomerace cis na trans nenasycené mastné kyseliny jako indikátor stresu jsou životně důležité a mohou nakonec vést k použitelné technice monitorování životního prostředí.