Cistron

Biogeneze PTX

pět PTX podjednotky jsou kódovány pomocí souvislé cistrons v rámci jednoho polycistronic operon , jejichž exprese je regulována BvgA/S systému. Prostřednictvím tohoto dvousložkového systému může být produkce toxinu modulována přítomností MgSO4 nebo kyseliny nikotinové nebo během růstu při nízkých teplotách (pro přehled viz). BvgS je protein s vnitřní membránou, který exprimuje více kinázových aktivit. V aktivním stavu aktivuje bvga fosforylací. Fosforylovaný BvgA, cytoplazmatický transkripční regulátor, pak se váže na operátor stránky PTX genu promotor oblast, kde interaguje s RNA polymeráza a aktivuje transkripci. Přestože byly identifikovány modulátory interferující se signalizací BvgS, není znám žádný ligand BvgS potřebný ke spuštění signalizace, což naznačuje, že BvgS je ve výchozím nastavení aktivován .

po transkripci jsou jednotlivé podjednotky produkovány jako preproteiny obsahující štěpitelné signální peptidy. Při translokaci přes vnitřní membránu (pravděpodobně cestou závislou na sek) jsou signální peptidy odstraněny. Přestože signální peptidy vykazují typické rysy substrátů pro leader peptidázu I, jejich štěpení vedoucí peptidázou i Escherichia coli je velmi neefektivní. Koexprese lep genu B. pertussis v E. coli podstatně zvyšuje zrání PTX podjednotek . V rámci periplasmic prostor, uvnitř podjednotky seleničitého dluhopisy jsou tvořeny, a holotoxin je pak sestaven před sekreci přes vnější membránu. PTX obsahuje celkem 11 disulfidových vazeb uvnitř podjednotky, jednu v S1, dvě v každé S4 a S5 a tři v každé S2 a S3 . Všechny cysteiny přítomné v PTX jsou zapojeny do intra-řetězcových disulfidových vazeb . Tvorba disulfidů je důležitá pro biogenezi toxinu, protože změna cysteinu v S1 brání této podjednotce ve spojení s B oligomerem . Správná tvorba disulfidů závisí na systému DsbA/DsbC, který byl shledán nezbytným pro montáž a sekreci PTX . Nicméně, mutace v dsbC, kódování pro jeden ze tří seleničitého isomerázy, nemá zřejmě žádný vliv na shromáždění toxin, ačkoli oni narušit jeho sekreci, což naznačuje, že DsbC působí na součást, která je specificky potřebné pro PTX sekrece.

Sekrece není nutné pro biologické činnosti PTX, ale kompletní montáž holotoxin je důležité pro efektivní sekreci, jako kmeny navržen tak, aby produkovat pouze S1 nebo pouze B oligomer show defekt v sekreci . Plně funkční B oligomer však může být do určité míry vylučován v nepřítomnosti S1, což naznačuje, že přítomnost S1 není absolutním požadavkem pro sekreci B oligomeru. V kontrastu, S1 sám nemůže být vylučován v nepřítomnosti B oligomer, což naznačuje, že sekrece determinanty jsou umístěny v B oligomer, i když přítomnost S1 může jistě zvýšit sekreci účinnosti. Některé mutace v genu S1 mají silný škodlivý účinek na sekreci, zejména v oblasti kolem Arg-57, což naznačuje, že tato oblast S1 hraje roli v sekreci PTX. V nepřítomnosti B oligomeru se S1 s největší pravděpodobností rozdělí na vnější membránu, možná přes její C-terminál, hydrofobní doména. Toto může být místo shromáždění s B oligomerem před sekrecí přes vnější membránu .

molekulární kroky v sestavě holotoxinů jsou stále špatně pochopeny. Jednotlivé podjednotky v mutantních kmenech, které neprodukují ostatní podjednotky, jsou rychle degradovány. Zdá se, že určité kombinace podjednotek se navzájem stabilizují . Například, stabilitu S2 podjednotka je výrazně posílena přítomností S4 a naopak, což je v souladu s S2–S4 dimer formace odhalila krystalové struktury holotoxin. Je také možné, že podskupiny dimeru S2–S4 s podjednotkou S1 jsou vytvořeny v nepřítomnosti S3 a S5. Dimer S2-S4 nebyl nalezen v B. pertussis, zatímco přidání S1 k tomuto dimeru může mít za následek určitou úroveň sekrece.

dopravní PTX přes vnější membrány B. pertussis závisí na typu IV sekrece systém (T4SS), která se skládá z devíti různých proteinů, jménem PtlA přes PtlI . Tyto proteiny jsou homologní k těm T4SSs od jiných bakterií, včetně bakterie Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, a Rickettsia prowasekii . Ptl geny leží přímo za pěti strukturálními PTX geny a jsou pod kontrolou ptx promotoru . Zdá se však, že Ptl proteiny jsou produkovány na nižších úrovních než PTX podjednotky, o čemž svědčí translační fúze genu phoA s různými ptx a ptl geny . Produkce určitých PTL proteinů se jeví jako omezující krok v sekreci PTX. Během exponenciální růst, bakterie byly odhadnuty vylučovat tři molekuly toxinu/min/ bakteriální buňky , a podjednotek bylo zjištěno, že se hromadí v periplasmic prostor, a to jak jednotlivých podjednotek a sestaveny do holotoxins. K akumulaci podjednotky dochází během exponenciálního růstu, i když hladiny určitých PTL proteinů se zvyšují na 30 až 1 000 molekul na buňku. Tím pádem, sekrece spíše než produkce nebo montáž toxinů může být omezující. Je zvláštní, že v nepřítomnosti Ptl bílkoviny, některé podjednotky kombinace, jako je S2–S4 dimeru za přítomnosti S1, může být vylučován , i když sekreci holotoxin silně závisí na přítomnosti Ptl proteiny.

Ptl proteiny jsou myslel, že se tvoří komplex zahrnující vnitřní a vnější membrány , a všechny z nich (alespoň PtlA-H) se zdají být nutné pro sekreci toxinu, protože vyšetřovány mutace v jednotlivých ptl gen . Některé z těchto mutací představil v trans do wild-type ptl+ kmenů vyústil v dominantní negativní sekrece fenotypu, což potvrzuje, že alespoň PtlC na PtlH jsou součástí multimeric komplexu. Klíčovým krokem v PTX sekrece je samozřejmě jeho schopnost přejít vrstvou peptidoglykanu, a finanční controller bylo prokázáno, express peptidogycanase činnosti . Tento protein dlouhý 276 reziduí obsahuje podobnosti aktivního místa s jinými glykohydrolázami a bylo prokázáno, že substituce alaninu v tomto místě výrazně snižují aktivitu peptidoglykanázy rekombinantní PtlE. Stejné substituce v přírodních finanční controller také zrušit sekreci PTX B. pertussis, silně naznačuje, že finanční controller je peptidoglycanase potřebné pro toxin přes peptidoglykanové vrstvy.

sekrece PTX také s největší pravděpodobností vyžaduje energii. Dva z PTL proteinů, PtlC a PtlH, obsahují domnělá vazebná místa adenosintrifosfátu (ATP) a mohou tak poskytovat energii nezbytnou pro sekreci toxinu. Ukázalo se, že oba proteiny jsou nezbytné pro sekreci a v obou případech jsou domnělá místa vázající ATP nezbytná pro funkci. U obou je pozorován dominantní negativní fenotyp, když jsou mutantní alely koexpresovány s alelou divokého typu, což naznačuje, že obě fungují jako multimery nebo jsou součástí sekrečního komplexu. Bylo prokázáno, že PtlH je spojen s vnitřní membránou a mutace v místě vazby ATP PtlH ovlivňují jeho buněčnou polohu a ruší jeho interakce s jinými Ptl proteiny. Přesná role PtlC zatím není známa. PtlD je také protein s vnitřní membránou a obsahuje pět transmembránových domén. Je vyžadován pro stabilitu PtlE, PtlF a PtlH prostřednictvím zbytků c-terminálu 72. Tato C-koncová oblast však není dostatečná pro sekreci toxinu . PtlF vykazuje vlastnosti vnějších membránových proteinů (OMPs), ale může být také spojena s vnitřní membránou. V nonreducing podmínky, PtlF a PtlI migraci jako komplexní během sodium dodecyl sulfát-polyakrylamidové gelové elektroforézy, což naznačuje, že PtlI váže na PtlF tím, sirník dluhopisů formace . Správné seleničitého dluhopisů tvorbu mezi PtlI a PtlF může záviset na DsbC, jako mutace v dsbC genu ovlivňují sekreci, aniž by to ovlivnilo toxin shromáždění .