Co je kolonie PCR?

Colony PCR je rychlý, vysoký výkon metodou PCR ke stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti vložené DNA do plasmidu přímo z bakteriální kolonie.

molekulární klonování je jednou z nejpopulárnějších metod transformace DNA již dlouho. Pro určení přítomnosti nebo nepřítomnosti dna vložky však musíme provést transformační experimenty.

kolonie PCR je nová metoda, při které pomocí návrhu vložených DNA specifických primerů můžeme identifikovat, zda je naše DNA zájmu vložena do plazmidu nebo ne.

není to však tak jednoduché, jak diskutujeme.

v tomto článku se zaměříme zejména na PCR kolonie, princip PCR kolonie, její výhody a omezení.

k tomu musíme pochopit několik pojmů a témat. Začneme naše téma od základů. Obsah článku je,

“plasmid je bakteriální kruhové DNA, která se replikuje nezávisle na bakteriálním chromozómu a použity v genové manipulace a genového přenosu.”

genetické klonování je tradiční molekulárně genetický nástroj používaný již dlouho v laboratořích. Stručně řečeno, v klonování genů je gen našeho zájmu vložen do plazmidu umělými prostředky. Tato DNA je replikována nezávisle na bakteriálním chromozomu.

plazmidy se ve skutečnosti používají ke generování mnoha kopií krátkých segmentů DNA. Protože se bakterie replikují rychleji než kterékoli jiné organismy, můžeme vytvořit mnoho kopií genu našeho zájmu vložením do bakteriálního plasmidu.

F-plasmid, Col-plasmid, degradační plasmid a rezistentní plazmid jsou několik běžných typů plazmidů nalezených v bakteriích.

kromě toho může plazmid pracovat jako molekulární nosič, který přenáší krátké segmenty DNA z jedné buňky do druhé buňky.

pokryli jsme úžasný podrobný článek o plazmidové DNA. Přečtěte si to zde: Plazmidová DNA-struktura, funkce, izolace a aplikace.

kromě bakterií obsahuje plazmidovou DNA i několik dalších prokaryot. Hlavní funkcí plazmidu v bakteriích je jejich přežití v drsných podmínkách.

Jako plasmidu převody gen našeho zájmu, je velmi důležité zjistit, zda naše gen je vložen nebo ne do plasmidu.

k tomu můžeme použít několik metod, jako je PCR a mikrobiální kultivace.

Platting kolonií trvá déle a citlivost metody také není dobrá. Šance na kontaminaci je vždy vysoká v metodách bakteriální kultury.

takže výsledky nejsou přesné.

naše PCR pomáhá i zde. Pomocí metody PCR kolonie lze určit nebo identifikovat vložku DNA.

1. jak nastavit laboratoř pro extrakci DNA: komplexní průvodce (chemikálie, nástroje a další nástroje).
2. delece chromozomu 6p: důvod bez bolesti, bez hladu a bez spánku

co je kolonie PCR?

kolonie PCR je modifikace konvenční PCR, ve které jsou bakteriální kolonie přímo použity jako PCR šablona.

plazmidová DNA, která obsahuje DNA našeho zájmu, je amplifikována v podmínkách závislých na cyklické teplotě.

grafické znázornění kolonie PCR je znázorněno na obrázku níže,

princip kolonie PCR:

bakteriální kolonie obsahující plasmid může být přímo amplifikována pomocí dvou sad primerů. Vložit specifické primery, které amplifikují vložení sekvence a vektoru-specifická doprovodná primery, které zesiluje plazmidové DNA jiných než vložené DNA (doprovodná regiony na obou stranách-li vložit).

pomocí vložek lemujících primery (které zesilují zbytek DNA) lze určit velikost naší DNA vložky.

bakteriální kolonie se vybírá a přidává přímo do mastermixu obsahujícího všechna PCR činidla. Navíc, přidáním jedné počáteční topení krokem k PCR, plazmidové DNA z bakterií, buněk a zesílen v reakci.

Toto je základní princip kolonie PCR, nicméně může být upraven v závislosti na požadavcích.

protokol PCR kolonie:

PCR kolonie je jednou z vynikajících modifikací konvenční PCR. Místo templátové DNA se bakteriální kolonie přímo přidávají do reakce. Kromě toho se v PCR reakci přidávají Taq DNA polymeráza, primery, PCR reakční pufr a DD/W.

zde v kolonii PCR je výběr primerů velmi důležitý. Také výběr primerů závisí na cíli našeho experimentu.

jaký typ informací chceme z našeho experimentu colony PCR?

1. 1. 1. informace pouze o přítomnosti nebo nepřítomnosti vložky.
      2. informace o velikosti vložky.
      3. informace o orientaci vložky.

v závislosti na tom jsou pro kolonii PCR navrženy různé PCR primery.

Vložené specifické primery se vážou na konkrétní místo na obou stranách Vložené DNA, které nás zajímá. Pokud je správně přenesen do plazmidu, mohou se na něj tyto primery vázat, jinak se nemohou vázat.

tato sada primerů poskytuje informace o přítomnosti nebo nepřítomnosti vložky.

Orientace-specifické primery jsou jedinečné primery, ve kterém jeden primer se váže uvnitř vložky a další primer se váže na plazmidové DNA sekvence (sekvence jiné než-li vložit DNA).

tento typ sady primerů poskytuje informace o orientaci Vložené DNA našeho zájmu. Pokud naše vložit DNA není správně ligován do vektoru, primer specifický pro tuto stranu sekvence nemůže vázat, a získáme zesílení.

Plazmidové specifické primery jsou také stejně důležité jako orientačně specifické primery. Tato sada primerů je navržena z okrajové oblasti vložky, která se váže na vnější stranu DNA našeho zájmu.

tato sada primeru pomáhá určit velikost vložky. Rozšiřuje jiné oblasti než Vložené DNA.

PCR reakce pro provádění colony PCR je, jak následuje,

Složka	Koncentrace	Množství
Master mix (Speciální pro Colony PCR)	1X	12µL
PCR reakční pufr S 2mM MgCl2*	1X	5 µl
Forward primer	10	1µL
Reverzní primer	10	1µL
Supernatant		3µL
Voda		3µL
Celkem	———	25µL

postup colony PCR:

No, colony PCR nemusí extrahované DNA.

DNA zde neextrahujeme. Místo toho se pro zvýšení citlivosti reakce používá několik dalších metod.

dobře, proč neextrahujeme DNA pro plazmidovou DNA?

protože důvod je jednoduchý, buněčná membrána bakteriální buňky je velmi hladká.

již jsme diskutovali o buněčné membráně bakteriální buňky. Přečtěte si to zde: různé typy metod extrakce DNA

bakterie obsahuje měkkou buněčnou membránu, kterou lze snadno lyzovat zahříváním nebo odstředěním vysokou rychlostí.

také nepotřebujeme bakteriální vlastní DNA. Cirkulující Kruhový plazmid je přítomen v cytoplazmě bakterií, proto nejsou nutné ani další kroky čištění. Prasknutím buněčné membrány je naše templátová DNA připravena k amplifikaci.

Ok, umožňuje rychle projít metodou pro získání dobré plazmidové DNA.

pomocí sterilního sběrače vyberte několik bakteriálních kolonií a přeneste je do Eppendorf trubice.

nyní do něj přidejte vyrovnávací paměť a dobře promíchejte. Můžete také použít D / W.

zahřívejte vzorek ve vroucí vodní lázni po dobu 20 minut.

jemně vrchol.

odstřeďujte vzorek vysokou rychlostí po dobu 2 minut.

přeneste supernatant do jiné zkumavky a použijte jej jako templátovou DNA.

do reakce se přidá 20 µl vzorek.

další informace:

proč supernatant a ne pelety?

DNA je biomolekula života. Plazmidová DNA je dokonce menší než bakteriální jaderná DNA. Obsahuje pouze několik genů až do 1000bp až 20 000 bp.

Tedy pouze odstředění, lehčí plazmidové DNA z buněk a usadil se v supernatantu, zatímco pelety obsahuje bílkoviny a jaderné DNA tak, že ji nevyužíváme.

nyní přichází k věci.

náš plazmid je připraven k amplifikaci.

v jiné metodě

použijte bakteriální kolonii přímo.

tato metoda je kombinací Hotstart PCR a colony PCR.

bakteriální kolonie se sbírají a přidávají do PCR reakční zkumavky.

zkumavky jsou umístěny do PCR stroje. Přidá se jeden další krok ohřevu.

zahřátím 5 až 7 minut vychází plazmidová DNA z buňky.

nyní Vložené primery amplifikují DNA, kterou jsme vložili. A doprovodné primery zesilují zbytek DNA.

amplifikace se provádí po dobu 20 až 25 cyklů. Cyklistické podmínky pro colony PCR je uveden níže,

PCR Kroků	Počáteční Denaturace	Denaturace	Žíhání	Rozšíření	Konečné rozšíření
Teploty	95 C	95 C	55-65 C	72 C	72 C
Čas	3min	10 sec	45 sec	50 sec	5 min
	——-	——-	25 cykly	—–	——-

Přečtěte si zajímavý článek na konvenční PCR: Kompletní Průvodce Polymerázové Řetězové Reakce

Tipy pro zlepšení:

Použít jen několik kolonií, jako mnoho kolonií zvýšit pravděpodobnost nespecifické vazby.

použijte pozitivní kontrolu a negativní contol.

Jako pozitivní kontrola použit boční nátěr, i když vložka není přítomen, PCR reakce, dává DNA kapela plasmidu DNA, což naznačuje, že reakce připravili jsme je správná.

jako negativní kontrolu použijte netransformovaný plazmid (plazmid bez vložené DNA), tato plazmidová DNA je amplifikována pouze tehdy, je-li vložka přítomna.

jako vložka použijte krátké sekvence DNA, delší sekvence DNA zvyšují pravděpodobnost nespecifických vazeb a selhání reakce PCR.

dále používejte kratší PCR programy.

hlavní aplikace colony PCR je v určení správné ligace a vložení vložit DNA do bakterií i kvasinek plasmidu.

po dokončení reakce kolonie PCR se produkty PCR spouštějí na 2% agarózovém gelu. Výsledky experimentu jsou uvedeny na následujícím obrázku,

nyní pečlivě sledujte výsledky, M je marker molekulární DNA 3000bp. Předpokládejme, že DNA našeho zájmu, “insert” je fragment 400bp, který je vložen do plazmidu.

viz pruh 2: fragment 400 bp naší vložky.

Navrhli jsme lemovací primery 100bp od obou stran vložky. Pokud doprovodná primer zesiluje DNA spolu s vložte produkt je 600 bp, viz lane 3 (400 bp vložit DNA + 200 bp doprovodná regionu).

nyní, viz pruh 1, je to pozitivní kontrola bez vložky nebo normální plazmid bez transformované DNA. Proto lemující primery zesilují pouze 200 bp DNA.

viz pruh 1, 200bp fragment DNA bez vložky (pozitivní kontrola).

nyní Sledujte pruh 4. Lane 4 je výsledkem orientačních primerů. Základní nátěr specifický pro orientaci je kombinací základního nátěru specifického pro vložku a primeru specifického pro oblast lemování.

pro amplifikaci primeru specifického pro orientaci je vybrán jeden primer z insert DNA a jeden primer z primeru specifického pro oblast lemování.

Proto 100 bp fragment z doprovodných regionu primer a 400bp od vložit DNA je zesílen a 500 bp fragment DNA je pozorován v řadě 4.

Lane 5 je vložka specifická kontrola, která dává 400 bp fragment DNA.

pruh 6 je negativní kontrola bez šablony. Pomocí negativní kontroly lze identifikovat jakoukoli kontaminaci. Reakční zkumavka obsahuje všechny složky kromě šablony. Takže v ideálním případě v tomto pruhu nejsou přítomny žádné pásy DNA.

pokud je pozorován pás DNA, vzorek je kontaminován.

výhody kolonie PCR:

• tato technika je rychlá a nákladově efektivní.
• dále je přesnost a specificita techniky vyšší.
• nastavení je jednoduché, stejně jako konvenční PCR, extrakce DNA a čištění plazmidů, jako jsou náročné kroky, nejsou nutné.
• není potřeba restrikční trávení pro identifikaci Vložené DNA.
• celý experiment může být dokončen během 90 minut.

nevýhody kolonie PCR:

• metoda je nákladově efektivní, rychlá a spolehlivá, nelze však detekovat žádnou mutaci v vložce.
• navíc informace o sekvenci nemohou být získány kolonií PCR. musíme udělat sekvenování pro potvrzení transformace DNA.
• šance na falešně pozitivní výsledky je vysoká.

více;

1. co je multiplexní PCR?

po dokončení experimentu je vzorek odeslán k sekvenování, kde lze určit sekvenci DNA, která nás zajímá.

můžeme dokonce udělat multiplexní PCR kombinací jak vložených specifických primerů, tak plasmidově specifických primerů.

závěr:

ačkoli je PCR kolonie nejlepší volbou pro identifikaci přenosu genů, jediná technika PCR kolonie nestačí k interpretaci výsledků. Je možné, že některé z mutací přítomných do vložky, které nemohou být detekovány PCR.

pro potvrzení výsledků je vyžadováno sekvenování DNA. Po určení pořadí sekvencí můžeme říci, zda je náš Gen zájmu vložen správně nebo ne.