COLO 205

Úspěšné Kultury Buněk:

*Prosím, přečtěte si důležité technické informace, které následuje před manipulací ECACC-dodávané buněčné linie*. Tyto informace jsou také k dispozici ve formátu PDF z našeho hlavního menu v části ” zákaznická podpora “(klikněte zde).

Skladování Zmrazených Buněk

Po obdržení, zmrazené ampule by měly být převedeny přímo do plynné fázi kapalného dusíku bez prodlení, pokud mají být použity přímo. Nepoužívejte jako alternativu mrazničku s teplotou -80°C, což by vedlo ke ztrátě životaschopnosti.

Jak Zvládnout Zmrazené Buňky na Přijetí

Po obdržení zásilky mražených ECACC-dodávané buněčných linií je důležité, aby koncový uživatel dává zásilku pozornost bez zpoždění. Před vyjmutím ampulí ze suchého ledu je třeba konzultovat technické rady doprovázející buněčné linie. Správná manipulace ihned po přijetí je rozhodující pro úspěšné vytvoření buněčné linie v laboratoři koncového uživatele.

v době objednání buněčné linie by koncoví uživatelé měli také zvážit kultivační podmínky pro novou buněčnou linii a ujistit se, že po příjezdu buněk bude k dispozici vhodné médium.

význam počítání buněk

při resuscitaci a sklizni buněčných kultur proveďte počet životaschopných buněk. Jedním z nejčastějších důvodů, proč se nepodařilo vytvořit buňky v kultuře, je použití nesprávné hustoty setí životaschopných buněk v době resuscitace, tj. Tomu lze zabránit provedením počtu životaschopných buněk a dodržováním doporučené hustoty setí.

pro konkrétní buňku, se kterou pracujete, si přečtěte informace uvedené v záložce “popis” na naší webové stránce. Tyto informace naleznete také v datovém listu buněčné linky, který vám bude poskytnut jako tištěná kopie s vaší zásilkou mobilní linky. Hustota osiva je uvedena v rutinních informacích subkultury. Při očkování buněk okamžitě po resuscitaci použijte střední až horní konec daného rozsahu hustoty očkování.

Resuscitace Zmrazené Buňky

je důležité, aby zpracovat zmrazené ampule s péčí; nosit laboratorní plášť, kompletní ochrannou masku a rukavice. Ve vzácných případech mohou ampule explodovat při zahřívání v důsledku expanze zachyceného zbytkového kapalného dusíku.

1. V mikrobiologické bezpečnostní skříňce držte tkáň namočenou v 70% alkoholu kolem víčka zmrazené ampule. Otočte víčkem o čtvrtinu otáčky, abyste uvolnili veškerý zbytkový kapalný dusík, který může být zachycen. Utáhněte víčko. Ampulku rychle přeneste do 37oC vodní lázně, dokud nezůstane pouze jedna nebo dvě malé ledové krystaly, pokud existují (1-2 minuty). Je důležité rychle rozmrazit, aby se minimalizovalo poškození buněčných membrán.
Poznámka: ampulku zcela neponořujte, protože by to mohlo zvýšit riziko kontaminace.

2. Před otevřením otřete ampulku tkání namočenou v 70% alkoholu.

3. Celý obsah ampule pipetujte do sterilní zkumavky (např. objem 15 ml). Poté pomalu přidejte 5 ml předehřátého média, které již bylo doplněno příslušnými složkami. Stanovte životaschopnou hustotu buněk pomocí trypanově modré skvrny, haemocytometru a obráceného mikroskopu pro počítání buněk nebo ekvivalentní metody počítání buněk. Přeneste příslušný objem buněčné suspenze, abyste dosáhli hustoty buněčného setí doporučené při zadávání údajů o buněčné linii.

u adherentních buněčných linií: upravte objem média a v případě potřeby velikost baňky, abyste dosáhli hustoty setí buněk doporučené v datovém listu buněčné linie. Krok před odstřeďováním k odstranění kryoprotektantu není obvykle nutný, protože první změna média odstraní zbytkový kryoprotektant. Pokud ano, bude to uvedeno v datovém listu. Pokud mají být buňky použity okamžitě (např. pro test založený na buňkách), spíše než subkulturované, může být vhodné provést krok před centrifugací k odstranění kryoprotektantu.

u buněčných linií suspenze*: doporučuje se před centrifugační krok k odstranění kryoprotektantu, tj. pelety buněk centrifugací při 150 x g po dobu 5 minut a resuspendujte buněčné pelety v čerstvém médiu pomocí vhodného objemu k dosažení správné setí hustoty.

1. Inkubujte baňky při teplotě a hladině CO2 doporučené na datovém listu. Pokud se používá inkubátor s obsahem CO2, baňka by měla mít odvzdušňovací uzávěr, který umožní výměnu plynů.

Hybridomu Ze Zmrazených Kultur

Při obnově hybridomu ze zmrazených kultur není neobvyklé, že se pro růst zpočátku pomaleji, než se očekávalo, a tam může být pozorován pokles životaschopnosti. Vytvoření aktivně se množící kultury může trvat až 2 týdny.

při resuscitaci je nezbytný centrifugační krok k odstranění kryoprotektantu. Zmrazenou ampulku rychle rozmrazte ve vodní lázni při 37°C po dobu 1-2 minut. Přeneste obsah do odstředivkové zkumavky a pomalu přidejte 5-10 ml předehřátého růstového média+. Odeberte vzorek pro počítání. Odstřeďujte při 100 x g po dobu 2-3 minut na peletové buňky a osivo při relativně vysoké hustotě 5-7 x 105 buněk / ml. Umístěte kultivační baňku naplocho a pravidelně ji sledujte, dokud nejsou vidět životaschopné proliferující buňky.

+Často hybridomu kultur může těžit z toho, že jej média doplněného o 20% FBS na počátku kritické fáze kultury zřízení bezprostředně po resuscitaci.

Postup pro Zmrazení Buněk

ECACC doporučuje zmrazení akcií své buněčné linie(s) brzy po přijetí (mezi 2 – 4 x 106 buněk/ml) jako preventivní opatření.

následující průvodce je nabízen pro přípravu a kryokonzervaci buněčných linií.

1. Sklízejte buňky ve fázi log růstu stejným způsobem, jaký se používá pro rutinní subkulturu. U adherentních buněčných linií sklízejte co nejblíže 80-90% soutoku.

2. Standardním postupem je použití 90% séra + 10% kryoprotektantu pro všechny buněčné linie, pokud není v datovém listu uvedeno jinak. Pro každou ampulku povolte 1 ml. Většina buněčných linií může být zmrazena ve vhodném kultivačním médiu doplněném 20% sérem a 10% kryoprotektantem. To je obvykle DMSO, ale v některých případech se doporučuje glycerol. Pokud DMSO není vhodné, bude v datovém listu buněčné linie uvedena alternativa.

3. Peletové buňky centrifugací např. 150 x g po dobu 5 minut. Resuspendujte buněčné pelety v příslušném zmrazit média tak, aby konečná koncentrace buněk mezi 2 – 4 x 106 buněk/ml a napipetujte 1 ml do každé ampule.

4. Zmrazte buňky rychlostí chlazení mezi 1-3oC / min pomocí Programovatelné mrazničky s řízenou rychlostí nebo vhodné alternativy1. Když teplota dosáhne alespoň-130oC, přeneste ampulku do zásobníku kapalného dusíku v plynné fázi.