Detekce a identifikace pomocí PCR Clostridium chauvoei v klinických izolátů bovinní stolici a substráty z bioplynu

Vzorcích z podezřelé případy černání

Pro svalové vzorky z podezřelých případů černání, výsledky z kultury na FAA desky následuje PCR z kolonie materiálu byly v souladu s, nebo provést dokonce lépe, než biochemické identifikační metody (Tabulka 2). Tyto výsledky jsou v souladu s Uzal et al. . Tato studie prokázala, že příprava DNA z kultury před PCR poskytla lepší výsledky než PCR aplikovaná přímo na biomasu.

Kultura následuje biochemické identifikační metody je komplikované ve vzorcích s vysokým obsahem kontaminující flóru, protože je třeba pro čisté kultury a citlivost byla podstatně nižší než pro kulturu a PCR. V osmi případech nebylo možné detekovat C. chauvoei kulturou a biochemickou identifikací, ale organismus byl detekován pomocí PCR (Tabulka 2). Pro stanovení diagnózy černání, svalové tkáně je přijata na pitvu, protože množství C. chauvoei je pravděpodobně vyšší ve svalové tkáni než v krvi. Jeden vzorek krve byl nesprávně odebrán, ale otázka byla blackleg.

podobně v předchozí studii ohniska blackleg poskytla kultura a detekce pomocí PCR lepší výsledky než biochemická analýza . V jednom z případů, primární kultury jeden sval na krevním agarem byla zarostlá C. septicum, ale dal jasně pozitivní výsledky pro C. chauvoei v PCR.

ve většině klinických případů blackleg množství C. chauvoei v infikované tkáni je vysoká a lze ji snadno detekovat metodou PCR nezávislou na kontaminující flóře. Metoda PCR je navíc mnohem rychlejší než tradiční metoda biochemické detekce, která trvá nejméně pět dní, a je důležité mít čistou kulturu kmene, což může vyžadovat více času na kulturu. Aby se zabránilo kontaminaci flóry, svalová tkáň by neměla být příliš malá; přibližně 100-200 g by bylo dostatečné. Bez čisté kultury nemohou být v budoucnu žádné kmeny pro následné studie, což je nevýhodou použití detekce PCR jako jediné metody.

U skotu experimentálně infikovaných s. C. chauvoei, PCR analýzy byly provedeny na mleté svalů a dalších orgánů a C. chauvoei byl zjištěn ve všech orgánech testovány . Mleté svalové kusy z podezřelých případů blackleg byly přímo testovány pomocí PCR a porovnány s kulturou. Detekce pomocí PCR dal lepší výsledky než kultura a biochemická identifikace , která je v nesouhlasu s výsledky v této studii, kde je pouze 12% (3 z 24) z krve nebo svalové kusy byly nad práh detekce PCR, zatímco 9% masové šťávy vzorky byly nad práh detekce (Tabulka 2). Inhibiční látky jsou pravděpodobně přítomny ve svalových tkáních. Inhibitory enzymatické reakce amplifikace PCR byly identifikovány v játrech, slezině a ledvinách a ve svalové tkáni mohou být přítomny podobné inhibitory. Výsledky ze svalových kusů macerovaných ve sterilních fyziologických vzorcích fyziologického roztoku (26%) neodpovídaly dobře výsledkům biochemického testu. Přímá PCR na svalové tkáni nebo jiných podobných vzorcích pravděpodobně není vhodná pro nahrazení kultivačních kroků následovaných biochemickými testy nebo PCR.

Svalových vzorcích odebraných podle tampony

, Aby prošetřila, zda je nutné poslat svalové tkáně pro analýzu. C. chauvoei, nebo zda je dostačující použít tampony pro sběr vzorků, poštovní služba byla simulována. Z 22 zkoumaných svalových tkání bylo 64% nad detekčním prahem PCR. U výtěrů ze stejných vzorků po simulaci poštovních služeb bylo 36% až 47% výtěrů nad prahem detekce (Tabulka 3). Bylo by praktičtější odebrat vzorky tampony místo svalových tkání, pokud jsou výtěry dostatečné pro analýzu C. chauvoei. Svalové tkáně však poskytly více pozitivních vzorků než výtěry, pokud byly oba analyzovány kulturou a PCR (Tabulka 3). Výskyt C. chauvoei na výtěrech z pozitivních případů svalové tkáně se zdál být náhodný. Zdálo se však, že je malý nebo žádný rozdíl, zda byly tampony uchovávány po dobu 1, 3 nebo 6 dnů.

Vzorky ze zařízení na výrobu bioplynu

Clostridium chauvoei byl zjištěn u 3 vzorků z 11 v bioplynu substrát před pasterizací, ale to nemůže být detekován po pasterizaci nebo po trávení (Tabulka 4). Bakterie v těchto druzích vzorků by mohly pocházet z hnoje nebo z vedlejších produktů živočišného původu z jatek, protože oba tyto zdroje se používají k výrobě bioplynu. Žádná z farem zařazených do vzorku v této studii posílat své hnůj do bioplynových stanic vzhledem k zeměpisné vzdálenosti, ale zvířata jsou odeslány na místní jatka. Případy blacklegu byly hlášeny také ve spádové oblasti bioplynové stanice.

po zpracování bioplynu se štěpené zbytky používají jako hnojivo. Bakterie tvořící spory mohou přežít pasterizaci a trávení v bioplynových stanicích a trávené zbytky z bioplynových stanic mohou být proto schopny šířit blackleg do nových oblastí. Nicméně, žádný C. chauvoei byl zjištěn ve zpracovaném produktu, tak snad na prostředí ve fermentoru, není vhodná pro C. chauvoei, nebo flóry ve fermentoru vyroste C. chauvoei. Klostridiální spory mohou přežít po dlouhou dobu v půdě, což je třeba vzít v úvahu při dalších studiích na C.chauvoei v digestoru.

Vzorky z farem

navzdory skutečnosti, že všechny farmy zkoumány hlásil podezřelé případy černání v posledních letech, všechny vzorky výkalů, půdy a siláž jsou negativní na C. chauvoei. Mohlo by to být několik vysvětlení. Spory mohou být stále přítomny v materiálu, ale pod úrovní detekce. Kromě toho mohou být ve vzorcích přítomny inhibitory PCR a PCR může být omezeno . Výkaly skotu obsahují těkavé mastné kyseliny (VFA) a vzorky půdy mohou obsahovat stopy kovu, o nichž je známo, že interferují s PCR reakcí. Kultivační krok před PCR však snižuje vliv inhibičních látek.

Od C. chauvoei je půdní bakterie mohou nastat některé sezónní variace,například silné srážky mohou přispět k šíření spór a množství spór v půdě může být pro dobytek přístupnější. Většina vzorků byla provedena na začátku podzimu, kdy bylo slunečné počasí, a proto se očekává, že koncentrace spór ve vzorcích bude nízká. Počet vzorků mohl být nedostatečný pro detekci kontaminace životního prostředí. Z praktických důvodů je však z terénu zřídka k dispozici velmi vysoký počet vzorků prostředí.

podezřelé případy blackleg na farmách se vyskytly především u telat a jalovic, ale jedna farma hlásila případ u dospělé krávy. Sedm z jedenácti farem A-K mělo v době odběru vzorků zavedené očkovací postupy (Tabulka 1).

Dvě farmy skladovat hnůj, než se šíří a jiné ne, ale nikdo z farmy šíření hnoje na pastvinách. Místní veterináři mají údajně viděl více případů stávkokaz poté, křoví, mýtina na ostrově Öland, a to zejména na Alvaret (pusté vápence prostý, téměř 40 km dlouhý a 10 km široký, s speciální planě rostoucích rostlin v závislosti na tenkou půdu a vysoké pH). Alvaret je obvykle používán jako pastvina sousedními farmami. V roce odběru vzorků nebylo provedeno mnoho čištění keřů.

PCR

Kulturní procedury jsou drahé a časově náročné, a kontaminace s jinými anaerobní bakterie, které vyrostou C. chauvoei často způsobuje problémy . Při použití PCR se amplifikuje DNA životaschopných i neživotaschopných buněk. Pokud mají být detekovány pouze životaschopné buňky, lze použít krok obohacení . V této studii byla použita kultura na destičkách FAA před použitím PCR, aby se zabránilo detekci neživotaschopných bakterií a falešně pozitivních PCR reakcí. DNA se snadno amplifikuje z čistých kultur, ale problémy vznikají u kontaminovaných vzorků, jako jsou vzorky z bioodpadu. Detekci DNA pomocí PCR může bránit řada látek včetně huminových kyselin, VFA, tuků a bílkovin . Kultivační krok před PCR byl však použit jako obohacovací krok, a proto snižuje vliv inhibičních látek. Kvůli rojení flóry nebylo možné provést žádné čištění z desek FAA.

práh Detekce PCR metoda

úroveň detekce byla 200 cfu/g. To se může zdát být špatná detekce úrovni, ale to může být vysvětleno skutečností, že vzorky, jako jsou hnojiva, půdní substrát a bioplyn jsou silně kontaminovány okolní flóry. Sasaki hlásil úroveň detekce 10 cfu / g, zřejmě v čistších vzorcích. Vzhledem k tomu, že úroveň detekce v naší studii byla 200 cfu / g a protože se očekávalo, že tyto vzorky budou obsahovat nízký počet C. chauvoei. Metoda použitá v této studii tedy není prakticky použitelná.

Environmentální aspekty

práh detekce PCR – metoda po preculture je stěží v současné fázi vhodné pro zaručující, že zvířata jsou prosté nákazy nebo pro určení stavu pastviny. Místo toho je třeba použít aktuálně aplikovaná doporučení, protože metodu nelze použít jako základ pro očkovací rutiny. V oblastech, kde je blackleg endemický, se doporučuje roční očkování před pastvou, navzdory nákladům a potřebnému času.

tato studie naznačila, že C. chauvoei neprochází procesem bioplynu. Počet C. chauvoei v bioodpadu možná snížil ve fermentoru pod práh detekce metody a riziko šíření stravitelné zbytky je tedy zanedbatelný. Než lze vyvodit definitivní závěry, je zapotřebí dalších studií o přežití klostridií v procesu bioplynu. Výhody trávených zbytků jako hnojiva však možná převažují nad rizikem šíření blackleg.