Gap junction protein Connexin-43 je přímou transkripční regulátor z N-cadherin in vivo

Embryo manipulace

Adult X. laevis byly udržovány při teplotě 17 °C a použity v souladu s předpisy o Biologické Servisní Jednotka na University College v Londýně, v souladu s UK Home Office pokyny stanovenými v Zvířata Act 1986 jako described45. Embrya x. laevise byla získána a představena, jak bylo dříve popsáno46, 47. Konkrétně se zaměřit na neurální lišty embrya byly injikovány do zvířat ventrální blastomer v osm-mobilní fáze na jedné straně pro všechny pokusy, kromě případů, kdy embryonální lyzáty byly použity. V tomto případě byla embrya injikována do obou zvířecích stran dvoubuněčných embryí. Mikroinjekce embryí byly provedeny podle48. V případě potřeby byly jako stopovací látky použity fluorescein-dextran (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) nebo rhodamin-dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng). Oligomorfoliny proti X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′ – TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′ – AAAAATGGTTTTCTTGTGGGTCGA-3′) a BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′ – AACGGACCGGGTTTAAAGGCTTTCCT-3′) byly syntetizovány a poskytnuty společností Gene Tools LLC. Byly použity ekvimolární koncentrace standardního kontrolního morfolina (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5′). Množství morfolinů odpovídá částkám injikovaným na jedné straně embryí s osmi buňkami, zatímco druhá strana byla použita jako vnitřní kontrola. Když byla embrya použita pro odběr embryonálních lyzátů, byly injikovány ve dvoubuněčném stádiu do obou zvířecích blastomer a byly použity dvojnásobné dávky. Pro testování účinnosti Cx43MOs na endogenní mRNA cx43 jsme provedli analýzu western blot. Oba Cx43MOs účinně snižovaly hladiny proteinu endogenních Cx43FL a Cx43iso (obr. 3a, b). Za účelem ověření BTF3MO účinnost, jsme testovány immunostaining buněk neurální lišty v BTF3 exprese proteinů, které prokázaly snížení hladiny BTF3 v BTF3MO buněk ve srovnání s CTLMO (Doplňkový Obr. 3a).

in situ hybridizace byla provedena, jak bylo dříve popsáno49, 50. Krátce, embryí byla stanovena v MEMPFA, následuje přes noc hybridizace s digoxigenin-značené sondy, inkubovány s AP protilátek a AP aktivita byla vyvinuta pomocí NBT/BCP substráty. Digoxigenin-značené RNA sondy byly připraveny pro foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22), a sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (o 0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) a twist (o 0,7 µg/ml) byly použity k posouzení neurální indukce, twist (0.7 µg / ml) pro migraci neurálního hřebenu, n-kadherin (1 µg / mL) k posouzení hladin exprese a vzor exprese btf3 (0, 7 µg/mL). Celoplošné imunostainování bylo provedeno tak, jak bylo dříve popsáno55 za použití protilátky Cx43 (1: 1000, Sigma, C6219). Krátce byla embrya fixována v MEPMFA a inkubována přes noc s protilátkou při popsaném ředění.

Zvířecí čepice explantáty byly vyjmuty z Xenopus blastulas (fáze 8) pomocí standardního technique48,56 a připraveny pro in situ hybridizaci, jak je popsáno výše. Pro zvířecí čepice testy, 500 pg mRNA byl vstříknut do zvířete straně dvou blastomer dvou-mobilní fáze embrya. Analýza ISH byla provedena na 20-25 embryích na podmínku pro každý nezávislý experiment.

Neurální manipulace a zobrazování

Neurální transplantace byly provedeny jako dříve reported57. Krátce, neurální převzaty z jeviště 18 fluorescenčně značené embryí byly členité s obočí nože a roubované do neznačeného hostitele embryí. Pro in vitro experimenty, kraniální neurální explantáty byly vyjmuty ve fázi 18 pomocí standardního technique58,59 a, á na fibronektin (Sigma, F1141) potažené nádobí jako dříve described53. Pro jednobuněčné testy byly neurální hřebenové buňky krátce disociovány v médiu Ca2+/Mg2+-free Danilchick53. Pro každý stav bylo analyzováno deset embryí transplantovaných fluorescenčně značeným NC na experiment.

Immunostaining byla provedena na neurální explantáty jako dříve described54 pomocí anti-N-cadherinu (1:50, rat IgG, klon MNCD2, DSHB), anti-E-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Zobrazování migrace neurálních hřebenů in vitro bylo provedeno pomocí časosběrné kinematografie, jak bylo popsáno dříve53, 60. Krátce, neurální buňky byly kultivovány v plastových nebo skleněných petriho misky potažené fibronektinu, a time-lapse microcopy byla zahájena po jedné hodině kultivace in vitro. Pro buněčnou motilitu a migrace, složené mikroskopy (Eclipse 80i mikroskop Nikon s Hamamatsu Digitální fotoaparát nebo DMRXA2 Leica mikroskop s Hamamatsu Digitální kamera ovládaná pomocí Jednoduchých PCI program), vybavené motorizované fázích a 10×/0.30 NA suché čočky byly použity. NC kultury byly připraveny, jak je popsáno výše. Snímky byly pořízeny každých 5 min po dobu 12 h. Pro buněčné morfologie imaging, TCS SP8 mikroskop s 63 × /0.90 NA ponoření do vody objektivy a řízen LAS–AF byl použit software. Pevné buňky byly zobrazovány pomocí objektivu pro ponoření oleje 63 × /1,4 NA a konfokálního mikroskopu Leica TCS SPE řízeného softwarem LAS–AF.

pro lokalizaci konstrukce nebo endogenní hladiny IF bylo analyzováno 10-15 NCC pro každou podmínku na experiment.

migraci Buněk a morfologie buněk analýza

Chemotaxe assay byla provedena následující standardní procedure61 pomocí heparinu akrylové korálky (Sigma, H5263), potažené 1 µg/mL čištěné lidské stromální buňky odvozené faktor-1 (Sigma, SRP3276). Pohyblivost buněk a chemotaxe byly analyzovány pomocí analytických nástrojů ImageJ (https://imagej.nih.gov), jak bylo popsáno předchozí53, 60. Stručně řečeno, každá jednotlivá buňka byla ručně sledována pomocí manuálního sledovacího pluginu ImageJ, data byla shromážděna a analyzována pomocí pluginu Chemotaxis ImageJ. Morfologie buněk byla hodnocena nasazením indexu kruhovitosti (complete circle = 1) a odhadnuta pomocí analytických nástrojů ImageJ. Disperze buněk byla analyzována pomocí Delaunay triangulation algorithm (ImageJ Plugins) a byla vynesena jako průměrná plocha explantátu trojúhelníku, jak je popsáno předtím54. Mobilní protruzní oblast byla analyzována v neurální buňky na okraji explant měření přerůstat oblasti, která vyplývá ze dvou po sobě jdoucích časových rámců s 4 min časový interval; tyto dva po sobě jdoucí snímky byly odečteny generovat nové area12. Pro analýzu buněčné chemotaxe a buněčné disperze bylo analyzováno 10-15 explantátů na podmínku pro každý nezávislý experiment. Pro pohyblivost buněk, morfologii buněk a buněčné výčnělky bylo analyzováno 15-25 NCC na stav na experiment.

Molekulární biologie, plasmidy, a činidla

Pro syntézu cDNA, celková RNA byla izolována z 10-15 embryí fáze 23-24 nebo 10-15 zvířecí čepice fázi 8 z X. laevis za stavu pro každý nezávislý experiment a tři technické repliky byly použity v rámci každé experiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) jako šablona. Plná délka Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 karboxy nevyléčitelně zkrácený konstrukt (Cx43Trunc, aa 1-212) a Cx43-20k construct (Cx43Tail, aa 213-379) byly klonovány do 5’BamHI/3’XhoI z pCS2+ nebo pCS2-EGFP vektorů. Vektor pCS2-EGFP laskavě poskytl Dr. Masa Tada. Indukovatelná konstrukce Cx43tailu byla připravena fúzí cx43-20kTail (aa 219-379) s doménou vázající ligand lidského GR (aa 512-777). Cx43-20k byl klonován do 5’EcoRI/3’SacI a GR do 5’SacI/3’XhoI z pCS2+ a pCS2-EGFP. Konstrukty BTF3 byly syntetizovány pomocí X. laevisova sekvence z klonu cDNA (UniGene ID XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) byl klonován do 5 ‘EcoRI/3’ Xhoi pCS2+ nebo pCS2-EGFP. BTF3 smazání postavit chybí NLS regionu RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) byl klonován do 5’BamHI/3’ClaI z pCS2+. Pro experimenty BiFC (obr. 4B, c), Cx43Tail a Cx43Trunc byly klonovány do 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi pCS2-vc155. BTF3FL byl klonován do 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi pCS2-VN9m. bifc vektory byly laskavě poskytnuty prof. Jamesem C. Smithem. Všechny konstruované sekvence jsou ověřovány automatizovaným sekvenováním DNA (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg / embryo, 63).

veškerá analýza fluorescenčních konstrukcí byla hodnocena normalizací na fluorescenci pozadí a v případě potřeby na celkovou fluorescenci buněčné oblasti.

byla použita následující činidla: flufenamic kyseliny (50 µM pro NC explant inkubace −100 um pro embryo léčby, Sigma, F9005), meclofenamic kyseliny (50 µM pro NC explant inkubace −100 um pro embryo léčby, Sigma, M4531), aktinomycin D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) a ethanolu rozpustí dexamethazon (10 µM) byl přidán do kultivačního média ve fázích 14-15 a zachována až do neurální migrační embryonální fáze (fáze 23). Pro kontrolu možného úniku indukovatelných chimér byla sourozenecká šarže embryí kultivována bez dexamethasonu a zpracována pro hybridizaci in situ. Pro test spojky (testování aktivity kanálu mezer) bylo analyzováno 10-15 NCC na podmínku na experiment.

Immunoprecipitation, frakcionace, a western blotting

Pro každý stav 10-15 embryí byly použity pro přípravu embryo lyzáty za experiment. Celý embryí byly připraveny pro western blot po homogenizaci v lyzačního pufru (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.01% Triton-X, pH 8.0) s přidanými inhibitory proteáz (Roche, 11836153001) a fosfatázy inhibitory (Roche, 04906837001)54,64. Pro západní bloty byly použity následující protilátky: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); stručně řečeno, buňky byly suspendovány v lysis buffer a centrifugated na 20 000×g po dobu 5 min při 4 °C, supernatant byl obnoven a objem se upraví s ředicím pufrem. Kuličky byly vyrovnány v ředicím pufru a smíchány s resuspendovaným buněčným lyzátem. Směs byla magneticky vyčištěna a připravena pro western blot. Izolace jaderných frakcí embryí X. laevis byla provedena pomocí diferenciálních centrifugačních protokolů s modifikací64, 65. Stručně řečeno, fáze 18 x. lyzáty embrya laevis pomocí 22 g jehly a 20 µL homogenizačního pufru (HB: 250 mM sacharóza, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, inhibitory fosfatázy a proteázy) na embryo. Všechny vzorky byly odstředěny při 250×g po dobu 5 minut, aby se odstranily zbytky embrya. Po odebrání supernatantu byl distribuován do tří různých zkumavek a točil se třemi různými rychlostmi (400×g, 600×g) po dobu 5 minut, aby se izolovala buněčná jádra. Postjaderné supernatanty byly uchovávány pro další zpracování. Jaderné pelety byly opět promyty v pufru HG a odstředěny vhodnou rychlostí (400×g, 600×g). Jaderné pelety byly poté resuspendovány ve 40 µL 10% glycerolu / 0,1% SDS/1% Triton-X v HB. Ke každému vzorku bylo přidáno vhodné množství pufru vzorku, a vzorky byly zpracovány pro elektroforézu akrylamidového gelu a analýzu western blot. Aby se předešlo chybám při nakládání, byla stejná membrána po odizolování blotována proti regulaci nakládání, jak bylo popsáno předtím54, 64.

Western blot data byla analyzována pomocí analytických nástrojů ImageJ. Intenzity obrazu byly normalizovány a poměr sledovaného proteinu k regulaci zatížení (tj., Mapk nebo α-tubulin) byly vypočteny průměrné poměry. Uncropped bloty jsou zahrnuty jako doplňkové údaje (doplňkové obr. 5–7).

Buněčných kultur

HeLa buněk (Leibniz Institute Sbírek Mikroorganismů a Buněčných kultur, DSMZ, Německo) byly kultivovány v DMEM doplněném o 10% fetální telecí sérum (Life Technologies, CA, USA) při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 10% CO2 a transfektovaly, jak je uvedeno použití Rotifect (Carl Roth, Německo) podle pokynů výrobce.

Xenopus embryonálních fibroblastů (XTC, druh dar od Ana Losada) byly kultivovány v 67% DMEM/H2O doplněném o 10% fetální telecí sérum na 25 °C ve zvlhčené atmosféře s 5% CO2 a transfektovaly, jak je uvedeno použití Viafect (Promega, USA). Plazmidy pro transfekci byly, jak je uvedeno, a 10-20 hela nebo XTC buňky byly analyzovány pro každý stav na experiment.

pro experimenty siRNA byla transfektována kombinace tří siRNA zaměřených proti BTF3, jak je popsáno výše. Jako ovládací prvek byla použita standardní siRNA (scrambled siRNA od Sigmy). Katalogové číslo pro tyto obchodní siRNA proti BTF3 jsou: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Buňky byly odebrány 48 hodin po transfekci a zpracovány pro experimenty qPCR, western blot nebo Imunohistochemestry. Jak je popsáno v příslušných oddílech.

všechny buněčné linie byly testovány na kontaminaci mykoplazmou.

Immunohistochemestry a phalloidin barvení

detekce bílkovin, savčí buňky nebo neurální explantáty byly fixovány ve 4% formaldehydu ve 0.2% PBS-T (PBS + o 0,2% Triton X-100) pro 10-min a blokovány s 10% NGS po dobu 1 h. Primární protilátky byly inkubovány při 4 °C v 10% NGS. Tyto protilátky byly použity: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml anti-N-cadherinu (MNCD2 Vývojové Studie, Hybridomu, Banky), a 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) v 10% NGS a inkubovány ve 4 °C. Explantáty byly promyty 3 krát v PBS + 0.2% Tween-20 a inkubovány ve 4 °C se sekundární protilátkou, zředěný v 1:350 do 10% NGS. DAPI byl naředěn v poměru 1:1000 a smíchán se sekundárními protilátkami.

Hmotnostní spektrometrie

Pro co-immunoprecipitation FLAG-tagged Cx43Tail pro hmotnostní spektrometrickou analýzu buňky byly roztrhli a lyzáty byly inkubovány přes noc s anti-HA a vyrovnávají vysokou afinitu korálky na 4 °C, immunoprecipitates pak byly umyté a eluted27. Následně po eluci kyseliny s 0,1 M glycinem ph 2,5 se pH eluátů upravilo na pH 8,0 s 0,5 M Tris. Pro štěpení proteinů byly vzorky inkubovány přes noc s 2 µg trypsinu (trypsin Gold, Promega, USA) s následným přidáním 0.1 µg Lys-C (Roche, Německo) a inkubace pro dalších 6 h. Peptidy byly odsolené na C-18 reverzní fázi fázi tipy (Hnízdo Group, USA), vysuší se ve vakuu a uloženy při teplotě -20 °C až do analýzy. Směsi sušených peptidů byly získány v 3 µl 30% kyseliny mravenčí a zředěny vodou na 23 µl. Pět µl digest byl aplikován na Nano-LC systém (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) a peptidy byly odděleny na reverzní fázi chromatografie na C-18 kolony připravené in-house (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 µm, Dr. Maisch, Německo, PicoFrit Sloupce, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) v lineárním gradientu 100% eluentu A (0,1% kyseliny mravenčí) až 55% eluentu B (60% aktenitrilu, 0,1% kyseliny mravenčí) za 120 min. LC-systém byl nastaven tak, jak je odvětráván kolony a vzorek byl zatížení a odsolený při průtoku 400 nl/min a separace byla provedena při průtoku 200 nl/min. Nano-LC systému bylo rozděleno do hmotnostního spektrometru (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Německo), který byl provozován v datových závislé na režimu. Interpretace dat byla provedena s Maskotem V2.2 (Matrixscience, UK) a Progenesis LC–MS V4.1 (Nelineární Dynamika, UK). Interpretace dat byla provedena s MaxQuant V1.6.1.0 a Perseus V1.6.1.3 (MPI Biochemie, Německo).

Tažné assay

Gap junction mezibuněčné komunikace byla testována pomocí barviva tažné testu. Zde bylo použito fluorescenční barvivo Kalcein-AM (Sigma, 17783). Na neurální populace členitý z uninjected embrya byla inkubována s barvivem Kalceinu-AM pro cca 10 min, nebo dokud barvivo byl vložen do všech buněk. Další populace neurálních hřebenů z embryí injikovaných jaderným markerem (injekce mRNA nRFP, viz výše) byla oddělena odděleně. Po dvě populace byly odděleny v nepřítomnosti vápníku a hořčíku, byly promíchány a inkubovány po dobu 1 h při 14 °C ve zkumavce. Po mírné odstředivce byly explantáty neurálního hřebenu rozřezány na kusy podobné velikosti a kultivovány, jak je popsáno výše, a poté natočeny. Pro testování kanálové aktivity mezer byly použity blokátory mezer; kyselina meklofenamová (Sigma, M4531) a kyselina flufenamová (Sigma, F9005). Mobilní komunikace byla hodnocena na základě odhadu poměru počtu buněk, které zobrazují obou stopovacích látek, jaderného markeru a Kalceinu k celkovému počtu buněk, které mají jaderný marker.

Statistická analýza

odhad velikosti vzorku byl proveden na základě dříve publikovaných prací a nebyla použita žádná specifická statistická metoda. Experimenty nebyly randomizovány a vzhledem k povaze experimentů nebyli autoři zaslepeni alokací během obou experimentů a analýzy výsledků. Byly analyzovány pouze životaschopné embrya a explantáty. Nesprávně injikovaná embrya nebyla zahrnuta do hybridizačních experimentů in situ. Správná injekce byla stanovena injekcí lineárních stopovacích látek. Naše experimentální parametry byly měřeny náhodně, jakmile byly vybrány životaschopné a správně injikované embrya.

porovnání procent bylo provedeno pomocí kontingenčních tabulek66. Normálnost datových sad byla testována pomocí kolmogorovova-Smirnovova testu, D ‘ Agostina a Pearsonova testu a Shapiro-Wilkova testu pomocí Prism6 (GraphPad). Soubory dat následující normální distribuce byly porovnány s studentův t – test (two-tailed, nestejné rozptyly), nebo ANOVA s dunnettovým testem je více srovnání post-test pomocí aplikace Excel nebo Prism6 (GraphPad). Soubory dat, které se neřídí normálním rozdělením, byly porovnány pomocí Mann Whitney test nebo neparametrický ANOVA (Kruskal Wallis s dunnovo vícenásobné porovnání post-test) pomocí aplikace Excel nebo Prism6. Křížová srovnání byla provedena pouze v případě, že celková hodnota p ANOVA byla menší než 0,05. Ve všech obrázkových legendách N = Počet nezávislých experimentů; n = celková velikost vzorku.

x. laevis n-cadherin parciální identifikace promotoru

k identifikaci základního promotoru Xenopus n-cad jsme použili následující strategii. Základní promotorové oblasti z kuřecího a savčích n-cadherin geny byly popsány v 5′-UTR oblastech, v rámci pozice -3000 až -1 bp respektovat překlad zahájení site41,67. Použitím zdroje projektu X. laevis Genome Project (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) jsme identifikovali oblast 2800 bp v 5 ‘ – UTR genu X. laevis n-cadherin (Doplňkový obr. 4). Protože naše data naznačují, že Cx43Tail, BTF-3 a pol II tvoří komplex, používáme ElemeNT tool68 k hledání potenciálně aktivních Tata boxů v oblasti, kterou jsme izolovali. Naše analýza in silico odhaluje oblast bohatou na Tata box mezi pozicemi -166 až -618 bp, vzhledem k místu zahájení překladu (Doplňkový obr. 4). Nakonec navrhujeme překrývající se primery pro zesílení fragmentů 200 bp v této oblasti. Sekvence primerů jsou uvedeny v sekci ChIP a jejich vazebné oblasti jsou zvýrazněny na doplňkovém obr. 4.

chromatinová imunoprecipitace (ChIP)

pro chromatinovou imunoprecipitaci (ChiP) jsme postupovali standardním postupem pro embrya X.laevis69, 70. Pro každý nezávislý experiment jsme použili dvě technické repliky a 250-300 embryí Xenopus na podmínku. Krátce, neurula fází X. laevis embryí byla stanovena na 15 min a 3 µg Pol II protilátek (Diagenode, C15100055) nebo GFP Čip třídy protilátky (Abcam, ab290) byly použity. Pro extrakci DNA jsme postupovali podle standardního protokolu69, 70. Pomocí zdroje pro analýzu prvků jsme hledali domnělé Tata boxy v X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′-GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′-GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3′

a jejich relativní vazebná místa jsou uvedeny v Doplňkových Obr. 4b. ChIP experimenty byly vyčísleny takto: normalizovaný poměr kapela intenzity pro každý stav byl v průměru to a násobné zvýšení respektovat IgG kontroly byla vypočtena a vykreslena jako násobné obohacení. Intenzita pásma byla zaregistrována pomocí pluginu ImageJ gels analysis. Neříznuté gely jsou znázorněny na doplňkovém obr. 7c, d.