Injekční lidské rekombinantní kolagenu matice omezit nežádoucí přestavby a zlepšení srdeční funkce po infarktu myokardu

Studie

Tady, jsme provedli studii, aby (i) design klinicky relevantní kolagenu hydrogelů pomocí rekombinantní lidský kolagenů typu i a III; (ii) charakterizovat a porovnat fyzikální vlastnosti rHCI a rHCIII materiálů; (iii) vyhodnotit terapeutický potenciál materiálů pro léčbu IM u myší; a (iv)identifikovat mechanismy, které jsou základem pozorovaných terapeutických účinků léčby rHC. Pro experimenty in vivo byla ligace LAD tepny u myší zvolena jako klinicky relevantní a dobře zavedený zvířecí model MI. Pro funkční, histologické a molekulární hodnocení byl počet zvířat na skupinu minimalizován na tři až patnáct myší, jak je uvedeno v legendách obrázku. Myši byly náhodně zařazeny do léčebných skupin a všechny analýzy byly provedeny zaslepeným způsobem.

Příprava a charakterizace rHC matice

1% kolagenu roztok byl připraven rozpuštěním 0,1 g lyofilizovaného kolagenu (rHCI a rHCIII, z Fibrogen) v 10 ml ultra-čistou ddH2O. Chondroitin sulfát (CS; Wako), N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimidu (EDC) a N-hydroxysuccinimide (NHS) byly přidány k výrobě finální směsi s hmotnostní poměr 1:4:0.5:0.3 pro kolagen:CS:NHS:EDC. Materiály byly připraveny na ledu pomocí uzavřeného systému, který umožňuje homogenní míchání bez přidání bublin. Po důkladném promíchání bylo pH upraveno na 7.4 podle NaOH (1,0 N). Matrice bez CS byly připraveny podobně, ale s přidanými PBS, aby se kompenzoval objem CS. Matice označené s Alexa-Fluor®594-NHS byly připraveny přidáním 20 µL barviva v zásobním roztoku (1 mg/mL v DMSO) na gely před přidáním NaOH (25 nmol barviva na hydrogel), následuje míchání 20 stupňů.

Materiál viskozita

Viskozity měření bylo provedeno pomocí Brookfield R/S plus rheometer (Brookfield) při 37 °C. C25–2/30 kuželové vřeteno byl použit ke kompresi materiálu (50 µm posunutí) na regulovanou teplotou podstavci. Viskozita byla měřena rotačním blokem rampy při rychlosti 1 / min jednotky předem nastavené smykovou rychlostí pěti jednotek v čase 30 min.

stupeň zesítění

experimenty diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) byly provedeny za účelem posouzení stupně zesítění. Stručně řečeno, měření byla provedena v q2000 diferenciální skenovací kalorimetr (ta přístroje) v rozmezí 8 až 80 °C pomocí rychlosti skenování 5 °C min-1. Kolagenové matrice (5-20 mg) byly povrchově vysušeny filtračním papírem a hermeticky uzavřeny hliníkovým víkem (Tzero; TA nástroje) v hliníkové vzorkovací pánvi (Tzero; ta nástroje). Teplota denaturace (Td) byla měřena na počátku endotermického vrcholu.

obsah Vody

obsah Vody v materiálu byla měřena vážením mokré váha (W0) vzorku, rovnovážného stavu v PBS po dobu 96 hodin při teplotě 4 °C. materiál byl poté vakuově sušené při teplotě místnosti po dobu 96 h k získání suchá hmotnost (W). Celkový obsah vody v hydrogelech (Wt) byl poté vypočítán podle rovnice:

Degradace

Enzymatické degradace byla měřena pomocí 50-100 mg hydrogel umístěn v 5 ml I. typu kolagenázy (10 U/ml v PBS) při 37 °C. zbývající pevná hmota byla měřena po dobu až 24 h. Míra degradace je vypočtena z počáteční sklon pozemků ze zbývající hmoty v závislosti na čase a uvedeny v mg/min.

Materiál pórovitost

nízkoteplotní rastrovací elektronová mikroskopie (Kryo-SEM) měření byla provedena na -50 °C pomocí Tescan (Model: Vega II XMU) vybaven studené fázi držák vzorku, zpětný rozptyl elektronů detektor (BSE) a sekundárním elektronovým detektorem (SE). Velikost pórů byla měřena od nejméně 250 jedinců ze 4 až 6 náhodných oblastí vzorku pomocí softwaru ImageJ®. Průměr pórů byl kvantifikován pomocí podélné osy pórů pomocí nástroje přímky. Plocha obrazu byla upravena podle stupnice velikosti získané ze systému Tescan Vega II. 65.

pokusy na Zvířatech

Všechny postupy byly schváleny University of Ottawa Péče o zvířata Výboru, a provádí podle Národní Institut Zdraví Průvodcem pro Péči a Použití Laboratorních Zvířat.

MI model

MI byl vyvolán v 9-týden-staré samice C57BL/6 myší (Charles River; počet myší/skupinu jsou v obrázku legendy) a léčba dodávka byla provedena pomocí zavedeného protocol26,27. Myši byly anestetizovány (2% isofluranu), intubovány a srdce bylo vystaveno čtvrtou interkostální torakotomií. Levá přední sestupná koronární tepna (LAD) byla poté ligována těsně pod jejím vznikem z levé síně. Tento postup má za následek velké MI zahrnující anterolaterální, zadní, a apikální části srdce, která byla potvrzena při operaci po infarktu blanšírování v regionu poskytnutých tepny. Krátkodobě působící buprenorfin byl podán nejméně hodinu před chirurgickým zákrokem a dlouhodobě působící buprenorfin byl podán subkutánně bezprostředně před chirurgickým zákrokem pro perioperační analgezii. V 1. týdnu po-MI (základní), myši byly náhodně zařazeni tak, aby dostávali léčbu PBS (kontroly), rHCI, nebo rHCIII matice, dodávány v pěti equivolumetric intramyocardial injekce (10 µl každém místě, 50 µl celkem) prostřednictvím 27-G jehly pomocí ultrazvukem řízené uzavřené hrudi postup. Injekční stříkačka je zajištěna v mikromanipulátoru (VisualSonics) a před injekčním postupem jsou jehla i sonda RMV scanhead zarovnány podél dlouhé osy srdce. Pomocí ultrazvukového zorného pole se mikromanipulátor používá k umístění hrotu jehly na požadované místo v myokardu pro podání injekcí(viz Doplňkový obr. 1 a doplňující Video 1). Myši byly zabity terminálu anestezii na 2 dny nebo 4 týdny po léčbě a srdce byly shromážděny pro histologii a/nebo měření mechanických vlastností.

Echokardiografie

Transtorakální echokardiografie byla provedena na dlouhé osy zobrazení používání Vevo770 systém v režimu B s 707B série real-time microvisualization scanhead sondy (VisualSonics). Zobrazovací byla provedena na začátku studie před zahájením léčby injekce (7 dní post-MI) a na 28 dnů po injekci k určení ejekční frakce levé komory (LVEF), frakční oblast změny (FAC), end-systolický objem (ESV), end-diastolický objem (EDV), tepový objem a srdeční výdej. Všimněte si, že LVEF, ESV a EDV se používají jako klinické prediktory HF a přežití po MI44.

Ex vivo zobrazování Alexa-Fluor®594-označené matice

chemicky tagged rHC matice (25 nmol barviva na hydrogel) byly injekčně poškozen myši srdce, jak je popsáno výše. Zvířata byla zabita ve 2 h, 2 dny a 7 dní po ošetření, a srdce byly sklizeny a odrážel ex vivo IVIS® Spektra (PerkinElmer) pro vizualizaci rHCI a rHCIII distribuce v srdcích (λexcitation: 570 nm; λemission: 640 nm). Pro histologie, tkáňové řezy byly připraveny v acetonu a pak se obarví s DAPI doplněno zobrazování pomocí Leica Aperio Versa slide skener s konečným zvětšení ×20 a Z-zásobník s osmi kroky na 1,5 µm.

Kmen analýzy

Transtorakální echokardiografie byla provedena na dlouhé osy zobrazení používání Vevo3100 systém v režimu B s MX400 série real-time microvisualization scanhead sondy (VisualSonics). Zobrazovací byla provedena na začátku studie před zahájením léčby injekce (7 dní post-MI) a za 2 dny po aplikaci injekce k určení podélné endokardiální kmen v době uzavření aortální chlopně (což konci systoly). Kmen v segmentu 5 (přední střední segment), odpovídající oblasti hraničního pásma cílené pro injekci léčby, byl analyzován pomocí aplikace Vevostrain softwaru VEVO LAB 3.1.1 (VisualSonics) 41. Reprezentativní příklady provedených měření jsou uvedeny na doplňkovém obr. 10 pro všechny experimentální skupiny plus zdravé (neinfarkované) zvíře.

Elektrokardiografie

Elektrokardiogramy byly vyhotoveny současně s echokardiografie pomocí Vevo3100 systém (VisualSonics) na výchozí hodnoty před zahájením léčby injekce (7 dní po IM) a ve 2 dnech po injekci. Elektrokardiogramy byly vyvezeny z laboratoře VEVO 3.1.1. software (VisualSonics). Délka intervalů PR, QT a QRS byla stanovena pomocí softwaru ImageJ (doplňková Tabulka 1).

mechanické vlastnosti myokardu

myši byly utraceny terminální anestezií 2 nebo 28 dní po léčbě a srdce byla sklizena. Obdélníkové kusy (2,5 × 5 mm) levé komory obsahující jizvu a hraniční zónu byly vyříznuty. K určení pevnosti v tahu pružnost tkáně (youngův modul pružnosti), vzorky byly podrobeny mechanickému testování v Instronu mechanické univerzální tester (Model 3342, Instronu) vybaven Série IX/S software, pomocí vsuňte rychlost 10 mm min−1.

histologie / imunohistochemie

ze podskupiny srdcí, které nebyly použity pro měření mechanických vlastností, byly připraveny snímky řezů myokardiální tkáně. Po 28 dnech po injekci byla srdce sklizena, perfundována PBS, vložena do OCT a zmrazena v kapalném dusíku. Řezy 10 µm byly řezány pomocí kryostatu. Pro posouzení velikosti jizvy byly tkáňové řezy fixovány ve 4% PFA po dobu 1 hodiny a obarveny Massonovým trichromovým postupem (Sigma). Snímky pořízené s Olympus BX50 mikroskopem pomocí 2 × cíle, a osm sekcí na myši byly použity k měření vzdálené stěny tloušťky a určit velikost jizev pomocí mid-line arc metoda s použitím MIQuant software66. Pro imunohistochemii byly tkáňové řezy fixovány v acetonu po dobu 20 minut, permeabilizovány 0,1% Tritonem po dobu 10 minut a poté blokovány v 10% séru po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Primární protilátky byly použity přes noc při 4 °C v 10% séra, a pak snímky byly umyté a ošetřené sekundární protilátky 1 h při pokojové teplotě, než je namontován s fluorescenční montáž střední (Dako). Pro detekci cév a myofibroblastů, PECAM-1 (také známý jako CD31, Santa Cruz 101454, 1:50) a α-SMA (Abcam 5694, 1:200) protilátky byly použity a detekovány s AF594 anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) a AF488 anti-rabbit (Life Technologies A11007, 1:500), resp. M2 makrofágy byly detekovány AF488-konjugovanou anti-CD206 protilátkou (Biolegend 141710, 1: 50). Pro kardiální troponin I barvení, řezy byly inkubovány s AF488-označené wheat germ agglutinin (ThermoFisher, W11261) po dobu 1 h při 37 °C, následuje inkubace s kozím srdeční troponin I primární protilátky (Abcam ab56357, 1:200) a detekovány osel anti-koza AF594 sekundární protilátka (Life Technologies-11058, 1:500). A konečně, pro connexin 43 barvení, řezy byly inkubovány s connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) a srdeční troponin I (Abcam ab188877, 1:200) primární protilátky, následuje detekce s AF488 anti-rabbit (Life Technologies A11007, 1:500) a osel anti-koza AF594 sekundární protilátka (Life Technologies-11058, 1:500), resp. Fluorescenční snímky byly získány pomocí Zeiss Axio Observer mikroskop s ×20 objektivní a pro connexin 43 obarvené řezy Leica Aperio Versa slide skener s 20 × cíle byl použit. Pro všechny skvrny IHC byly analyzovány čtyři sekce na myš a pro každou sekci byly pro analýzu použity 2-4 obrázky v hraniční zóně, infarktu a vzdálených oblastech. Pro barvení H&E byly tkáňové řezy fixovány v 10% formalinu. Řezy byly poté obarveny první v hematoxylin gill je řešení Č. 2 pro 7 min, následuje kyselina alkohol diferenciace, a pak o 0,5% eosinem pro 7 min, následuje dehydratace (všech řešení od Sigma). Snímky byly pořízeny mikroskopem Olympus BX50. Hraniční zóna byla označena jako FOV přímo přiléhající k oběma stranám oblasti infarktu, která začíná, když 50% LV je fibrotická tkáň jizvy (viz Doplňkový obr. 11 pro schematické zobrazení).

Cx3cr1-EGFP myší experimenty

vyhodnotit nábor cirkulujících mononukleárních buněk myokardu po rHC léčby, B6.129P-Cx3cr1 tm1Litt/J myší (Cx3cr1-EGFP), byly zakoupeny v Jackson Laboratory. Tyto myši express enhanced green fluorescent protein monocytů, dendritických buněk, NK buněk a mozku mikroglie, a jsou model hlášeny pro studium mononukleárních buněk nábor do heart67. 1 týden po IM byly myši léčeny 50 µl PBS, rHCI nebo rHCIII, jak je popsáno výše. Zvířata byla usmrcena 2 dny po léčbě a krev byla odebrána do zkumavek EDTA. Také srdce byla perfundována PBS a byla odebrána pravá komora a apikální oblast levé komory. Tkáně byly opláchnuty HBSS a tráveny ve 2.4U/ml dispase I (Roche) a 1 mg/ml Kolagenáza B (Roche) za 40 min při 37 °C. Vzorky byly třikrát promyty PBS, centrifugována po dobu 5 min při 400 g a izolované buňky byly připraveny pro průtokové cytometrie (FACS Aria III; Becton Dickinson). Buňky byly označeny APC anti-myší/lidská CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mouse Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mouse F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-mouse CD38 (Biolegend 102717) a Alexa Fluor® 700 anti-mouse CD206 (Biolegend 141733), po výrobcem doporučené ředění (0.25 µg / L na 1 × 106 buněk pro CD11b, Ly-6G/6C, CD38 a CD206 a 1 µg / L na 1 × 106 buněk pro F4/80). Viz Doplňkový Obr. 12 pro třídění / gating strategie.

Mobilní izolaci a průtokové cytometrie pro monocytů podskupin

Dva dny po ošetření injekční myši byly zabity vdechování CO2 následuje zlomení vazu. Krev byla odebrána od myší přes srdeční punkcí v 50 mM EDTA řešení, a červené Krvinky byly lyžují s červených krvinek (RBC), lysis buffer podle výrobce je protokol (Biolegend 420301). Buňky byly izolovány z sklizené myši srdce pomocí trávení pufr obsahující: Dnázy I (50 U/µL; Sigma D5025), kolagenázy typ II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), kolagenázy D (0.15 U/mL; Sigma 11088866001), a hyaluronidáza (10 U/mL; Sigma H3506). Po hodinovém trávení při 37 °C byly izolované srdeční buňky vedeny filtrem 70 µm. Konečně, sklizené myší sleziny byly kaše a rozetře přes 70 µm filtr, následuje inkubace s červených krvinek (RBC), lysis pufru. Buněčné pelety byly odebrány centrifugací při ×400 g po dobu 5 minut při 4 °C. Izolované buňky všech tkání byly inkubovány s Zombie Aqua opravitelný životaschopnost barvivo (1:500, Biolegend 423101) po dobu 20 min při pokojové teplotě. Dále byly Fc receptory blokovány činidlem TruStain X (1: 100, Biolegend 103319) po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Buňky byly poté inkubovány s protilátkou koktejl po dobu 45 min při teplotě místnosti obsahující průkazu cd45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220-AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) a Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biosciences AL-21). Průtoková cytometrie byla provedena pomocí BD FACS Aria III, a data byla analyzována FlowJo V10.5.2 software (viz. Doplňující Obr. 12 pro strategii třídění / bránění). Celkový počet životaschopných buněk pro každou izolaci tkáně po izolaci byl stanoven vyloučením trypan blue pomocí hemocytometru. Celkový počet buněk v rámci každé populace leukocytů byl stanoven pomocí procento živých buněk pro určité buněčné populace, a celkový počet živých buněk počítá post-izolace, která pak byla normalizována k mg tkáně nebo mL krve odebrané. Vtokové strategii: jednotlivé buňky byly uzavřené na základě FSC-a a FSC-H Live jednotlivé buňky byly bránou na nízké barvení pro Zombie Aqua live/dead barvení. Z této živé jednobuněčné populace byly leukocyty CD45+. Podmnožiny leukocytů byly charakterizovány následovně: neutrofily průkazu cd45+CD11b+Ly6G+, Ly6C nízké monocyty průkazu cd45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C vysoké monocyty průkazu cd45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofágy průkazu cd45+CD11b+Ly6G−F480+, T-buňky průkazu cd45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− a B-buňky průkazu cd45+CD11b−Ly6G−CD3−B220+. Poznámka pro krevní expresi F480 nebyla použita ve strategii bránění. Brány byly nastaveny vzhledem k kontrolám izotypu.

studie novorozeneckých kardiomyocytů

novorozenecké komorové myocyty potkanů (NRVMs)byly čerstvě izolovány pomocí zavedeného protokolu68. Levé komory shromážděné od 2-den-stará Sprague–Dawley potkanů (Harlan) byly štěpeny trypsinem (Amersham Biosciences) a kolagenázu typu II (Worthington Biochemical). Izolované buňky byly znovu suspendovány v M-199 médiu (Life Technologies) s přídavkem 10% FBS, 19.4 mM glukosa, 2 mM l-glutaminu, 2 U/mL penicilin, 0,8 µg/mL vitaminu B12, 10 mM HEPES, 1 × MEM neesenciálních aminokyselin (Sigma-Aldrich). Byly provedeny dvě kola po 60 minutách předběžného pokovování, během nichž se srdeční fibroblasty připevňují ke dnu misky, čímž se obohacuje neadherentní populace pro Nrvm. Neadherentní buňky (NRVMs) byly poté naočkovány na různé kolagenové matrice ve 24 jamkových destičkách (40 000 buněk/cm2). Pro přežití testu, 3-denní kultivované NRVMs byly podrobeny M-199 média obsahující 50 µM peroxidem vodíku po dobu 3 h, po kterém Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) assay byla provedena a mrtvé buňky byly počítány ve třech náhodné pole-of-view.

buněčné kultury

pomocí zavedeného protokolu byly makrofágy odvozené z kostní dřeně izolovány z 8-12 týdnů staré c57bl/6J mice69. Myši byly utraceno tím, vdechování CO2 a cervikální dislokací, a holenní kosti byly shromážděny a propláchnout média izolovat kostní dřeně. Kostní dřeň izolovat byl pipetou opakovaně k získání jednobuněčné suspenze, který byl pak předán přes buněčné sítko. Čerstvě izolované buňky byly kultivovány po dobu 1 týden při doplněno DMEM s 10% FBS, 20% L929-hvězdičkový media, a penicilin–streptomycin, a pak re-á na rHC hydrogely na 3 dny. Buňky byly odebrány z hydrogelů rHC za použití 3 mM CaCl2 Hankova pufrového fyziologického roztoku obsahujícího 250 jednotek kolagenázy I (Gibco). Polarizace makrofágů byla hodnocena pomocí průtokové cytometrie (FACS Aria III; Becton Dickinson) pomocí CD86 a CD206 (Biolegend) identifikovat M1 a M2 makrofágů, resp. Pro izolaci mononukleárních buněk byla odebrána kostní dřeň z kostí holenní kosti, jak je popsáno výše. Mononukleární buňky byly čištěny centrifugací s gradientem hustoty pomocí Histopaque® (Sigma) podle pokynů výrobce. Buňky byly označeny 0.5 µg/ml DAPI (Sigma) po dobu 30 min při 37 °C.

adheze Makrofágů assay

Mononukleární buňky byly izolovány splachování holenní a stehenní kosti 6 – až 12-týden-staré myši. Buňky byly čištěny centrifugací s gradientem hustoty pomocí Histopaque® (Sigma) podle pokynů výrobce. Mononukleární buňky byly počítány a označeny DAPI. Buňky byly naneseny na různé biomateriály v koncentraci 50 000 buněk/cm2 za 24 h. Buňky byly fixovány 4% PFA po dobu 5 min, a buňky byly počítány. Údaje byly vyjádřeny ve vztahu ke kontrole (nepotažené jamky, tj., TCP), aby se minimalizoval účinek variability mezi dárcovskými buňkami.

migrace Makrofágů assay

Kostní dřeně mononukleární buňky byly kultivovány v DMEM doplněném 10% FBS, 20% L929-podmíněné střední, a Pen/Strep za 7 dní vytvořit kostní dřeně odvozené makrofágy (BMDMs) a označena DAPI, jak je popsáno výše. BMDMs (2 × 105) byly znovu suspendovány v EBM chybí růstové faktory a sérum, a načten do horní komory Transwell deska (Life Technologies) potažena 100 µL rHCI nebo rHCIII. Spodní komora obsahovala Plná makrofágová média, jak je popsáno výše. Po 24 h, vložky byly odstraněny, a počet Bmdm, které migrovaly biomateriálem, byl kvantifikován zaslepeným způsobem pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss Z1. TCP), aby se minimalizoval účinek variability mezi dárcovskými buňkami.

test polarizace makrofágů

Bmdm byly generovány v DMEM doplněném 10% FBS, 20% l929 podmíněným médiem a Pen / Strep po dobu 7 dnů, jak je popsáno výše. Pro aktivace makrofágů experimenty byly buňky stimulovány na 3 dny s lipopolysacharidem (1 µg/ml; Sigma) a IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) pro M1 aktivace, nebo s IL-4 (20 ng/ml; R&D systems) pro M2 aktivaci. Celková RNA byla extrahována pomocí Tri činidla (Zymo Research) podle protokolu výrobce. První vlákno cDNA bylo syntetizováno pomocí reverzní transkriptázy Smartscribe (Takara Bio USA) a náhodných hexamerových primerů (Fisher Scientific). Hladiny mRNA cílového genu byly hodnoceny kvantitativní RT-PCR pomocí LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) a LightCycler 480 real-Time PCR systém (Roche). Sekvence pro páry primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Relativní změny exprese mRNA byly stanoveny metodou ∆ ∆ ct, vyjádřenou jako hladiny vzhledem k 18s. data byla vyjádřena vzhledem k kontrole (nepotažené jamky, tj.

přežití po expozici H2O2

buňky byly kultivovány po dobu 7 dnů v DMEM doplněném 10% FBS, 20% l929 podmíněným médiem a Pen / Strep. V den 7 bylo médium změněno na dmem obsahující 0,5 mM peroxid vodíku a buňky byly kultivovány po dobu 3 hodin, než byly obarveny 7-AAD pro analýzu průtokovou cytometrií. TCP), aby se minimalizoval účinek variability mezi dárcovskými buňkami.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí Kaleida Graph 4.5®. Všechny údaje jsou uvedeny jako průměr ± SEM. Pro srovnání údajů in vivo mezi léčbami byla použita ANOVA následovaná Holmovou korekcí pro vícenásobná srovnání. Velikost jizev byla analyzována pomocí vícenásobné regrese, včetně léčebné skupiny (rHCI, rHCIII a PBS) a výchozí LVEF. rHCI a rHCIII ve srovnání s PBS byly kromě výchozí LVEF významnými prediktory velikosti infarktu. Korelační koeficient pro model je 0,6 pomocí stata vícenásobné lineární regrese. In vitro NRVM, makrofágů a srdečních fibroblastů údaje byly analyzovány buď pomocí studentova t-test či one-way ANOVA s Holm je korekce pro mnohonásobné porovnávání, jak je uvedeno na obrázku legendy.

souhrn hlášení

další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.