jak navrhnout gRNA pro úpravu genomu CRISPR?

gRNA vede systém CRIPR Cas9 na správné genomické místo pro provedení dvouřetězcové přestávky.Cílová specificita systému CRISPR Cas9 je určena 20 nukleotidy na 5 ‘ konci gRNA. Báze gRNA se spáruje s komplementárním řetězcem cílové sekvence a nukleáza Cas9 provádí dvouvláknový zlom.

při navrhování gRNA je třeba vzít v úvahu následující věci.

1) obsah GC: Typický rozsah je mezi 40% – 80% . Vyšší obsah GC stabilizuje duplex RNA-DNA, zatímco destabilizuje off-cílové hybridizace

2) Délka: délku lze upravit a pohybovat se v rozmezí od 17-24 párů bází. Kratší sekvence vede k minimalizovaným cílovým efektům. (17 bp je nejnižší mez délky vodící sekvence, jakákoli délka vodící sekvence jakákoli délka kratší než 17 má statistickou šanci zaměřit se na více genomových lokusů.)

3) potenciální účinky mimo cíl: tolerance nesouladu a cílové místo je to, co vede k efektům mimo cíl. To může být sníženo vyhledáváním cílových efektů genomu.

existuje mnoho webových stránek, které pomáhají při navrhování gRNAs. Některé z nich jsou Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgrna designer a Biotools.

jsem vysvětluje, jak používat Chop Chop webové stránky zde,

1) jděte na https://chopchop.cbu.uib.no/

2) Vyberte Druh,

3) Vyberte druh specifický gen id nebo vyjmout a vložit nukleotidů zájmu, a začít analýzu.

jakmile je analýza provedena, zobrazí se grafické znázornění konkrétní gRNA. Každá potenciální gRNA také ukáže možné mimo cílové účinky. Vyberte ty s méně off cílových efektů.