Klothianidin semen-léčba nemá žádný zjistitelný negativní dopad na včelstva a jejich patogenů

Studie

V roce 2013, celkem 16 oborů (8.9 ± 5.4 ha; průměr ± s.d.) v jižním Švédsku, určené pro jaro-zaseté řepky olejné (Brassica napus L.) byly spárovány podle geografické blízkosti (ale odděleny >4 km) a využití půdy (Obr. 1, viz výše). Okolní krajina byla zkontrolována na nepřítomnost kvetoucích plodin. V roce 2013 však ve studii zůstaly dva obory, i když se poblíž nacházelo další pole řepky olejné, aby se zachovalo co nejvíce zemědělských párů. V každé farmě dvojice, jedno pole je náhodně přiřazena být zaseta s klothianidin-ošetřené řepky olejné, zatímco ostatní pole bylo oseté semena nejsou léčeni klothianidin (ošetřené: 8; ovládání: 8). Stejné spárované farmy byly použity v roce 2014, ale s ošetření obrácené, tj. místa s léčených oblastech v roce 2013 měl kontrolu polí v roce 2014 a naopak (ošetřené: 6; ovládání: 4). V důsledku střídání plodin byla v letech 2013 a 2014 použita různá pole v každé farmě (obr. 1, viz výše). Za účelem vytvoření obr. 1, stáhli jsme mapu z databáze světových hranic (ke stažení zde: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

informace o proměnných okolní krajiny pro různé zemědělské podniky v roce 2014 jsou uvedeny v doplňkové tabulce 7. V roce 2014 měla polovina ohniskových polí další jarní oseté řepky olejné (1-13 ha) v okruhu 2 km. Semena ošetřená klothianidinem pro ohnisková pole byla potažena elado, směs dvou účinných látek označená ochrannou známkou: klothianidin (400 g l−1) a β-cyfluthrin (+80 g l−1), zvolené pro tuto studii, protože to bylo převládající osiva, ošetření insekticidy ve řepky olejné ve Švédsku a v jiných částech Europe63. Klothianidin je převzat rostlinou a systémově distribuován do všech jeho částí pro ochranu proti hmyzu64. β-Cyfluthrin není považován za systémový a ve vzorcích odebraných v této studii nebyly zjištěny žádné rezidua 34. Semena ošetřená klothianidinem i kontrolní semena byla v roce 2013 potažena fungicidem thiram.

zúčastněných zemědělci byli poučeni, aby použít jiné neonikotinoidů v oblastech, v průběhu studie, i když jiný insekticid foliární spreje; především Pléna (pymetrozin), Vpřed/Steward (indoxakarb) a Mavrik (tau-fluvalinátu; také se používá jako varroacide ve včelařství) byly použity pro boj proti škůdcům (Doplňující Tabulka 8). Nicméně, Biscaya, obchodním názvem pro sprej formulace obsahující neonikotinoid thiacloprid, byl aplikován na jeden ovládací prvek pole v roce 2013, následovaný Mavrik sprej 1 týden později, a jeden ošetřené oblasti v roce 2014, v obou případech na 0,3 L ha−1. Thiakloprid má výrazně nižší akutní toxicitu pro včely než klothianidin65 a ve vzorcích pylu, nektaru a včel byla v roce 2013 zjištěna pouze stopová množství thiaklopridu a v roce 2014 žádná. Zatímco Rundlöf et al.34 nepozorovali jsme žádnou změnu ve výsledcích, když byla pole, kde byla aplikována Biscaya, vyloučena z analýz, zjistili jsme některé kvalitativní změny (doplňková Tabulka 9). Tyto změny by mohly být v důsledku vyšší thiacloprid zbytků zjištěných v roce 2014, ale může stejně dobře, ne vztahují k Biscaya, ale spíše rozdíl mezi Biscaya/Mavrik a alternativní insekticid sprej kombinace used34 nebo být v důsledku snížení statistické síly.

včelstva

sto šestnáct včelstva byly připraveny na konci Května 2013 profesionální včelař v jediném plné velikosti Langstroth úlů obsahující dva plásty s převážně uzavřené plodu (včely), dvě plné voštiny (včely), jeden táhlý prázdné hřeben, pět plástů s vosk základ, včely otřesená z toho, dva hřebeny a buď 1-rok-starý (84 experimentální kolonie) nebo 2-letý (12 experimentální kolonie plus 20 rezerva kolonie) královna známý sestup k produkci relativně malé, stejně velké (3418 ± 123 dospělých včel; průměr ± s.e.m.; n = 96 kolonií) kolonie s dostatkem prostoru pro růst, které by mohly být dostatečně silné, aby přežily nadcházející zimu, ale během léta nevyrostly svůj prostor. Šest pokusných kolonií bylo umístěno podél okraje pole v každém z 16 polí řepky olejné (celkem 96 kolonií) mezi 14. a 28. červnem 2013 na počátku kvetení řepky olejné (Doplňkový obr. 1). Linie královny a věk byly porovnávány mezi farmářskými páry, ale kolonie byly jinak distribuovány náhodně. Kolonie byly udržovány na 60 ha organicky obhospodařované zimní řepkové pole v plném květu před umístěním na 16 experimentálních polích (Doplňkový obr. 1) aby bylo zajištěno, že růst kolonií před experimentem byl co nejvíce založen na hledání potravy bez pesticidů.

Když řepky kvetou v experimentální pole přestal, kolonie byly přesunuty mezi 2 a 31. července (Doplňkový Obr. 1) ke společnému včelínu k přezimování. Na 10. srpna, kolonie dostali mravenčí par ošetření proti roztoči Varroa, který se skládá z 20 ml 60% kyseliny mravenčí namočené do bytu domácnosti houba umístěna pod vnitřní kryt na horní části snímků. Kolonie byly krmeny celkem 20 kg cukru na kolonii ve formě 55-60% roztoku sacharózy v/v, poskytnuté v krmné krabici ve třech případech během srpna až září 2013. Další lehké ošetření Varroa bylo provedeno 4. prosince postřikem 30 ml 2,6% kyseliny šťavelové v 60% sacharózy mezi rámy, přímo na včelí shluk. Na jaře 2014 byly kolonie přesunuty na ekologicky obhospodařované pole řepky olejné před umístěním na 10 jarně osetých polí řepky olejné (Doplňkový obr. 1). Kolonie byly považovány za pro zahrnutí v roce 2014 součástí studie, pokud měli 2-rok-starý, kladení vajíček královnou v dubnu 2014 (s výjimkou kolonií, který zemřel, znovu queened nebo 3-rok-starý queens v dubnu 2014) a neměl rojili do začátku června 2014. Tato omezení, kromě požadavku, že kolonie by exponovaných/neexponovaných se klothianidinu pro oba roky experimentu, znamenalo, že v roce 2014 jen čtyři kolonie mohou být přiděleny každé pole. Kolonie umístěné ošetřené oblasti v roce 2013 byly opět umístěny do ošetřeného pole v roce 2014, tak, aby posoudit kumulativní účinky multi-rok klothianidin expozice, ale byly jinak re-randomizováni před umístěním minimalizovat nezamýšlené předsudky. I tak, dvě kontrolní kolonií od roku 2013 musel být umístěn do klothianidin-ošetřené oblasti v roce 2014, vzhledem k nedostatečné kvalifikaci vystavena kolonie pro šest klothianidin ošetřených oblastech. Pro čtyři kontrolní pole bylo k dispozici dostatek kolonií. Síla kolonií byla vyrovnána, jak je popsáno pro rok 2013, ale pouze v rámci každé léčebné skupiny. Kolonie byly sníženy a vyrovnány podruhé (8. Června 2014), poté, co některé z nich rostly příliš velké a pokusily se rojit (Doplňkový obr. 1). Každá snížená kolonie v ceně 1 plné medu hřeben (včely), 3 hřebeny s převážně uzavřené plodu (u včel), a původní královna od roku 2013 a 6 plástů s vosk základ. Kolonie byly přesunuty do jarní řepky pole mezi 16. a 25. června 2014 a přinesl zpět do společné přezimování místě mezi 14. a 22. července 2014 (Doplňkový Obr. 1).

Reziduí analýzy

potvrdit klothianidin expozice, 24 dospělých včel na poli chytil v úlu vchod do budovy, pyl pelety shromažďovány od 5 včely, které vyhledávají potravu v řepky pole a nektar odstraněn z žaludky 5 nektar-shánění potravy včel v řepky pole byly analyzovány z každé stránky, pro klothianidin zbytků. Pyl (>25 ml) byl odebrán pomocí pylových pastí, které byly instalovány po dobu 1 dne na třech koloniích na místě a analyzovány na původ rostlinných druhů. Vzorky byly zpracovány a analyzovány jako v rundlöf et al.34 a shromážděné během hodnocení vrcholu květu v obou letech (Doplňkový obr. 1), s koncentrací klothianidin a čtyři další neonikotinoidů používá ve Švédsku (Doplňující Tabulka 2) kvantifikovat pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) a pyl identifikovány řepky typu pomocí světelné mikroskopie a pyl referenční knihovna (viz Doplňková Tabulka 2 limity detekce a kvantifikace). Pro další analýzy variability expozice neonikotinoidů včel na různých místech, shromáždili jsme 12 včely na místo od vchodu do úlu. Tento odběr vzorků byl proveden na třech místech ošetřených klothianidinem v roce 2013. Nektar byl extrahován z medového žaludku shromážděných včel. Koncentrace klothianidinu byly poté kvantifikovány jak v nektaru, tak v tkáni včel pro každého jedince. Další podrobnosti o zpracování vzorků pro různé matrice, metodu LC-MS/MS a kontroly kvality jsou uvedeny v doplňkových metodách.

vývoj kolonií, re-queening a produkce medu

vývoj včel včel byl hodnocen stejným vyškoleným pozorovatelem a jedním asistentem. Byla zjištěna přítomnost pokládající se královny, stejně jako přítomnost královských buněk. Pokud byla událost re-queening doprovázena velkou ztrátou dospělých včel, mělo se za to, že se rojilo. Pokud nebyla pozorována žádná ztráta dospělých včel, mělo se za to, že kolonie znovu ustoupila přes supersedure. Kolonie produkci medu a vývoj byla stanovena vážením kolonií a na základě posouzení kolonie sílu pomocí Liebefeld method66, jako celkový počet dospělých včel a oblasti zavíčkovaný plod přes všechny snímky. Počet dospělých včel byl odhadnut počítáním včel na obou stranách 10 snímků. Počet limitovaných buněk plodu (množství plodu) byl stanoven vynásobením podílu uzavřeného pokrytí plodu 2700, což je počet buněk na jedné straně použitých rámečků. Kolonie byly zváženy během pre-expoziční a post-expoziční posouzení (pomocí Mettler Toledo lavice měřítku schopna vážit až 32 kg s 1 g přesnost), pro odhad produkce medu. Plné medové rámy byly během květu řepky olejky nahrazeny prázdnými rámy, aby kolonie mohla růst a omezit rojení. Byly zváženy jak plné, tak prázdné rámy, pro zahrnutí do výpočtu produkce medu. Během hodnocení po expozici bylo odstraněno co nejvíce rámečků medu (max 10% plochy pokryté zakrytým plodem), aby se simulovala sklizeň medu včelařů. Pre-posouzení expozice bylo provedeno v ekologicky řízených zimní-zaseté řepky pole na 6-17. června 2013 a 9-11. června 2014, a po posouzení expozice na společné přezimování včelín na 29. července do 9. srpna 2013 a 28-31. července 2014 (Doplňkový Obr. 1). Kromě toho bylo v dubnu 2014 provedeno posouzení síly jarní kolonie odhadem celkového počtu dospělých včel a počtu limitovaných plodů (Doplňkový obr. 1). Hodnotitel kolonie a asistenti byli během sběru dat oslepeni s ohledem na léčebný režim polí.

Patogen a parazit vzorku, sběr a zpracování

Vzorky kolem 100 dospělých včel byly odebrány z každé kolonie během pre – a post-posouzení expozice v klothianidin-experimentální a kontrolní experimentální řepky polí v obou letech 2013 a 2014 (Doplňkový Obr. 1). Včely byly odebrány z vnějšího hřebenu každé kolonie a sestávaly tedy ze směsi domácích včel a krmných včel67. Všechny vzorky včel byly skladovány při -20 °C, dokud nebyla provedena laboratorní práce. V. destruktor napadení sazby pro jednotlivé kolonie byly určeny mytí dospělých včel vzorky s mýdlovou vodou, aby se uvolnil a počítat mites68. Na zadečku 60 dospělých včel na včelstvo (pro jednotlivé kolonie analýzy) nebo na včelín (pro rok 2013 souhrnná kolonie analýzy, 10 včel na kolonie) byly odstraněny a umístěny do polyetylenového sáčku s vnitřní pletiva (BioReba). Na zadečku byly rozdrcené v sáčku pomocí paličky a 30 ml nuclease-free (Milli-Q) voda (0,5 ml na včelu) byl důkladně promíchat s vzorek k vytvoření homogenní suspenze. Několik 1 ml alikvotů této suspenze bylo okamžitě odstraněno a zmrazeno při -80 °C pro extrakci DNA a RNA a jako budoucí referenční materiál.

Paraziti, patogeny, symbiotických mikrobů a imunitní geny

shromážděné včelí vzorky byly vyhodnoceny pro různé patogenní a nepatogenní parazitů a mikrobů, aby bylo možné studovat vliv umístění kolonie na klothianidin léčených oblastech na jejich výskyt a hojnost. Organismy zahrnovaly všudypřítomný ektoparazit Varroa destructor, 13 viry: akutní paralýza včel virus (ABPV), mšice smrtelná paralýza virus (ALPV), Big Sioux River virus (BSRV), black queen cell virus (BQCV), chronická paralýza včel virus (CBPV), deformovaných křídel viru typu A (DWV -), deformované křídlo virus typu B (DWV-B), virus akutní Izraelské paralýzy (IAPV), Kashmir bee virus (KBV), Jezero Sinai virus kmen 1 (LSV-1) a napětí 2 (LSV-2), Sacbrood virus (SBV), pomalý včelí paralýza virus (SBPV); dva společné včela microsporidian střevním parazitům (Nosema apis a Nosema ceranae) a dva symbiotické střevní bakterie (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola a Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Pro rok 2013 vzorky jsme rovněž analyzovány na včelín úrovni mRNA osm včel geny (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Hřbetní-1A, Jedlík-jako, NimC2, PGRP-S2 a SPH51), jehož výrazem byly dříve spojeny s pesticidy, patogeny a/nebo parazit exposure19,44 a (sociální) imunitu v honeybees45.

extrakce Nukleové kyseliny

DNA byla extrahována z bee homogenáty pomocí protokolu izolace DNA z Nosema spores69, který je dostatečně robustní, aby také extrahovat DNA z bakterií a jiných mikroorganismů. Celkem 500 µl primárního včelího homogenátu bylo odstředěno po dobu 5 minut v mikrofuze při 13 000 ot / min. Pelet byl opakovaně zmrazené-rozmrazit s kapalným dusíkem a zemi s sterilní Teflon micropestle do práškové. Práškové pelety byly resuspendovány ve 400 µl Qiagen Rostlinných tkání DNeasy AP1 lysis buffer obsahující 4 µl RNAse-A (10 mg ml−1) a inkubovány a třepe po dobu 10 min při 65 oC, po kterém se 130 µl P3 neutralizační pufr (3.0 M octan draselný, pH 5.5) bylo přidáno, následovalo 5 minut inkubace na ledu a centrifugace po dobu 5 minut při 14 000 ot / min, aby se odstranily zbytky lýzy. DNA byla očištěna od 500 µl supernatantu pomocí Qiagen automatizované Qiacube extrakce robot, po DNeasy plant protokolu a eluci DNA do 100 µl nuclease-free vody. RNA byla extrahována Qiacube robot přímo od 100 µl primární včela homogenátu pomocí Qiagen RNeasy Plant protokolu (včetně Qia-shredder pro další homogenization70) a RNA byla eluována do 50 µl nuclease-free vody. Přibližné nukleové kyseliny koncentrace byla stanovena pomocí NanoDrop, po které byly vzorky ředěny nuclease-free vodou do jednotné 10 ng µl−1 (DNA a LSV-1(RNA)) nebo 20 ng µl−1 (pro všechny ostatní vzorky RNA) a skladovány při -80 °C.

RT-qPCR a qPCR

různé mikroorganismy a hostitelských mRNA cíle byly detekovány a kvantifikovány buď v Jednom Kroku reverzní transkripce-kvantitativní PCR (RT-qPCR) pro patogenů s RNA genomem a imunitní a interní referenční gen mRNA cíle, nebo pomocí kvantitativní PCR (qPCR) pro organismy s DNA genomu. Podrobnosti o testech jsou uvedeny v doplňkové tabulce 10, doplňkové tabulce 11 a doplňkové tabulce 12. Reverzní primer pro Amel / LRR byl mírně přepracován od Di Prisco et al.19 protože extrémně vysoká komplementarita mezi původními dopřednými a reverzními primery vedla k vysokým hladinám PCR artefaktů dominujících kvantitativnímu signálu. Reakce byly provedeny ve dvojím vyhotovení, v reakčních objemech 20 µl (DNA) nebo 10 µl (RNA) obsahujících šablonu 2 µl (DNA) nebo 1,5 µl (RNA), 0,4 µM (DNA) nebo 0.2 µM (RNA) dopředného a reverzního primeru a buď Bio-Rad Eva Green qPCR mix (DNA) nebo Bio-Rad One-Step itaq RT-qPCR mix se SYBR Green detection chemistry (RNA). Reakce byly inkubovány v 96-well optical qPCR desky v Bio-Rad CFX connect termocykleru, pomocí následujících zesílení cyklistické profily: 10 min při 50 °C pro komplementární DNA (cDNA) syntéza (RT-qPCR): 5 min při 95 °C (inaktivace reverzní transkriptázy a aktivaci Taq polymerázy), následuje 40 cyklů 10 s při 95 °C pro denaturaci a 30 s při 58 °C pro nátěr žíhání, rozšíření a shromažďování údajů. Pro DNA testy následující amplifikační cyklus profily byly použity: 2 min při 98 °C pro počáteční denaturace následuje 40 cyklů 5 s při 98 °C pro denaturaci a 10 s při 60 °C penetrace žíhání, rozšíření a shromažďování údajů. Zesílení cykly byly následovány tání křivka analýzu k určení specifičnosti amplifikace čtení fluorescence v 0,5 °C krocích od 65 °C do 95 °C. Součástí na každé reakční desky byly pozitivní a negativní (non-template) puncovní kontroly. Pro každý typ testu (Doplňující Tabulka 10, Doplňková Tabulka 11. a Doplňující Tabulka 12) kalibrační křivka byla připravena pomocí 10-fold řada ředění pozitivní kontroly o známé koncentraci pokrývající 6 řádů, pro kvantitativní konverze dat, stanovení referenční tání křivka profilu amplikonu a odhadu reakce statistiky výkonu.

konverze Dat a normalizace

křivky tání jednotlivých reakcí byly hodnoceny vizuálně, aby oddělit nespecifické amplifikace, které se liší v teplotě tání profily z pravé cílové cDNA/DNA amplikony. Nespecifické amplifikace byly z datové sady odstraněny. Všechny testy byly provedeny ve dvou vyhotoveních, přičemž střední hodnota těchto dvou duplikátů byla použita v dalších výpočtech. Oba duplikáty musely přinést kladnou kvantitativní hodnotu a projít analýzou křivky tání, aby data byla zahrnuta do datové sady. Surová data RT-qPCR všech potvrzených amplifikací byla následně převedena na odhadovaná čísla kopií každé cílové RNA, za použití odpovídající kalibrační křivky pro test. Tyto údaje byly vynásobeny různými faktory ředění v průběhu postupu pro výpočet odhadovaných kopií každého cíle na bee69. Vzhledem k tomu, že RNA je snadno degradována, existuje riziko, že rozdíly mezi jednotlivými vzorky v kvalitě RNA (tj. degradace) mohou ovlivnit výsledky70. Aby se to napravilo, byly na všech vzorcích provedeny testy RT-qPCR na mRNA společného interního referenčního genu včel (RP49). Data pro RNA cíle zájmu byly poté normalizovány, aby průměrná hodnota pro RP49 mRNA, čímž se oprava data pro vzorek-specifické rozdíly v RNA kvality s ohledem na RT-qPCR performance70.

Statistické analýzy

proporce včela-shromažďují pyl, který vznikl z řepky olejné-typ rostliny byly ve srovnání mezi typy léčby (klothianidin ošetření osiva/neošetřené) pomocí zobecněné lineární model za předpokladu, binominal distribuce a opravuje pro overdispersion. Koncentrace klothianidinu v nektaru a pylu shromážděných včelami a ve včelí tkáni byly porovnány mezi léčbami pomocí Wilcoxon–Mann-Whitneyových testů. Pro porovnání koncentrací klothianidinu ve včelí tkáni a nektaru u jednotlivých včel mezi poli jsme použili analýzy rozptylu (ANOVA) s identitou pole jako prediktorem. Kromě toho, koncentrace klothianidinu v tkáni a nektar žaludeční obsah jednotlivých včely byly spojeny pomocí vícenásobné lineární regrese s pole identita a koncentrace klothianidinu v nektaru jako vysvětlující proměnné, a to koncentrace klothianidinu v bee tkáně jako odpověď proměnnou.

tato studie sledovala obecně Před-Po-Control-Impact (BACI) design, s spárován pole struktura se opakuje po dobu dvou po sobě jdoucích let v kolonii úrovni pro údaje o kolonie rozvoje, stejně jako prevalence a množství parazitů, patogenů a střevní bakterie. V letech 2013 a 2014, byly analyzovány společně v jeden kompletní model, s ošetřením semen, květu, rok a jejich interakce jako fixní faktory. Účinek klothianidin léčby byla hodnocena interakce mezi bloom a ošetření osiva, jak je tento termín odráží rozdíl ve změnách mezi ošetření v průběhu řepky kvetou(s). Pokud tři-způsob interakce (bloom × ošetření osiva × rok) byl významný (tj. pokud proměnná reagoval odlišně na klothianidin léčby od jednoho roku do následujícího), datový soubor byl rozdělen podle roku a rok byl vynechán jako fixní faktor. Dále byla datová sada analyzována pouze 1 rok, pokud údaje sestávaly z velikosti vzorku ≤10 V jednom roce jak pro prevalenci mikrobioty, tak pro hojnost (doplňková Tabulka 1). Kolonie, které se rojili (8 na kontrolu polí a 10 na klothianidin ošetřených oblastech v roce 2013; jeden v kontrolní oblasti a dvě při klothianidin-ošetřené oblasti v roce 2014) byly z analýzy vyloučeny, protože rojení má velký vliv na rozvoj kolonie. Vyloučena je také jediná kolonie, která ztratila svou královnu během transportu před umístěním pole v roce 2013(ošetřené pole). Vyloučení kolonií, které se rojily z analýzy, kvalitativně změnilo některé výsledky (viz doplňková tabulka 13). Změny úrovně významnosti mohou být způsobeny sníženým statistickým výkonem, náhodnou šancí nebo biologickými účinky.

Lineární smíšené účinky modely (LMM) byly použity k testování účinku klothianidin léčby na rozvoj kolonie měřená jako počet zavíčkovaný plod buněk (množství plodu) a počet dospělých včel. Ošetření semen (klothianidin nebo kontrola), květ (před nebo po květu řepky olejky), rok (2013 nebo 2014) a jejich interakce byly pevnými faktory. Identita farmového páru, identita farmy a identita kolonie byly zahrnuty jako náhodné faktory. Produkce medu byla porovnána mezi ošetřeními pomocí LMM s identitou farmového páru a identitou farmy jako náhodnými faktory. Zobecněné lineární smíšené modely (GLMMs) byly použity k testování vlivu klothianidin léčby na re-queening a úmrtnosti kolonií s farm identitu jako náhodný faktor.

vliv klothianidin léčby na jaře kolonie rozvoj, měřená jako počet dospělých včel a množství plodu, byla testována pomocí LMM a GLMM, respektive s ošetření osiva jako fixní faktor a farm pár identity a farm identitu jako náhodné faktory. Pro počet limitovaných plodových buněk jsme použili zápornou binomickou distribuci chyb a funkci logaritmické vazby.

mikrobiomem a Varroa data byla analyzována jak na jejich binomické (přítomnost/absence) a kvantitativní (množství) charakter, pomocí GLMMs (s binomické chyba distribuce, a logit link funkce) a LMMs (s normální chyba distribuce), respektive s ošetřením semen, květu, rok a jejich interakce jako fixní faktory. GLMMs na mikroorganismus nebo Varroa prevalence zahrnuty pouze kolonie identitu jako náhodný faktor, jako efektivní velikost vzorku (tj. méně časté výsledek na přítomnost/nepřítomnost dat) neumožňuje zahrnutí více náhodných faktorů. Byly analyzovány pouze organismy a roky s (účinnou) velikostí vzorku >10 z hlediska údajů o prevalenci i hojnosti. Kromě toho byly z analýzy hojnosti vyloučeny kolonie, které alespoň jednou netestovaly pozitivní na konkrétní mikroorganismus. Množství včelích patogenů a bakterií bylo logaritmicky (log10) transformováno, protože jsou obecně exponenciálně distribuovány. LMMs na hojnosti cílového organismu obsahovaly identitu páru farmy, identita farmy a identita kolonie jako náhodné faktory. Varroa čísla na 100 včel a včelstev hmotnosti byly square-root transformována, aby se zabránilo non-normální rozdělení reziduí. Intervaly spolehlivosti byly vypočteny na základě pravděpodobnosti profilu. Pro data transformovaná druhou odmocninou, odhady byly zpětně transformovány na původní měřítko pro grafické ilustrace.

transkripty imunitních genů byly k dispozici pouze pro rok 2013 a na úrovni včelínů, ale také následovaly návrh BACI. LMMs na genové expresi obsahovaly ošetření semen a květ jako fixní faktory a identitu farmy jako náhodné faktory.

Statistické analýzy dat byly provedeny pomocí R s výjimkou analýz, řešení ověření klothianidin expozice a využití pozemků, pro které SAS 9.4 pro Windows (SAS Institute Inc.) byl použit. LMMs byli fit pomocí funkce lmer z balíčku lme4 a GLMMs byli fit pomocí glmmTMB funkce glmmTMB balíček v R. P hodnoty z GLMMs byla vypočtena míra pravděpodobnosti testy. Hodnoty P Z LMMs byly vypočteny pomocí funkce Anova v balení automobilu, přičemž byly použity F-testy typu III pro modely obsahující interakce a F-testy typu II pro modely bez interakcí (tj. Účinky fixních faktorů byly odhadnuty pomocí kontrastů od součtu k nule u všech modelů s výjimkou těch, které se týkaly reziduí neonikotinoidů. Sum-to-zero kontrasty umožňují stanovení hlavních účinků / interakcí (tj. odhad nezávisle na jiných nezávislých proměnných) a ukazují účinky faktorů jako odchylky od velkého průměru(intercept). U faktorů se dvěma úrovněmi je velikost odchylky každé úrovně od velkého průměru stejná, ale směr se liší. Představujeme účinky faktorů (ošetření semen, květ, rok), jako odchylku druhého stupně (klothianidin, po, 2014) od velkého průměru. To byl také případ interakcí, takže například interakce ošetření semen × květu ukazuje, do jaké míry se kolonie vystavené klothianidinu lišily změnou květu řepky olejky od průměrné změny obou ošetření.

Power analýzy

Jsme hráli power analýzy pro počet dospělých včel a počet zavíčkovaný plod buněk a produkci medu, aby prošetřila vliv velikosti bychom mohli detekovat vzhledem k naší konstrukci, replikace a výběru modelu. Síla byla stanovena pro rozsah vliv velikosti na nominální hladině významnosti α = 0,05 pomocí 1000 simulací Monte Carlo na velikost účinku pomocí powerSim funkce simr balíček. Výkon byl vypočítán pro rozsah velikostí účinků, vyjádřený jako změna počtu dospělých včel, počtu limitovaných plodových buněk nebo produkce medu. Vydělením velikosti účinku se říct, počtu včel, znamená počet buňkách nebo produkci medu všech ovládaných kolonií, získali jsme vliv velikosti vyjádřené jako procentní změnu těchto matic (Doplňkový Obr. 3). Tato analýza výkonu umožnila porovnat naši velikost efektu s velikostí efektu, kterou prezentovali Rundlöf et al.34. Pomocí úplný model, mohli bychom zjistit vliv velikosti na počet dospělých včel pod 5% výkon 80% ve srovnání s účinkem velikost pod 20% předložený Rundlöf et al.34. To je dokonce nižší než požadavky na velikost efektu <7% stanovené EFSA32. V důsledku významné interakce ošetření osiva, květu a roku, datový soubor pro počet limitovaných plodových buněk byl analyzován samostatně pro každý rok. Proto zde uvádíme analýzu výkonu pro každý rok. Velikost účinku, při které bylo dosaženo 80%, se zvýšila z méně než 10% v roce 2013 na mírně pod 11% v roce 2014 (Doplňkový obr. 3), pravděpodobně kvůli snížené replikaci v roce 2014. Také jsme provedli analýzu elektrické produkce medu (množství medu na včelstvo v kg) pomocí údajů z obou let, což ukazuje, že vliv velikosti pod 20% by mohla být zjištěna s výkonem 80% (Doplňkový Obr. 3).

souhrn hlášení

další informace o experimentálním návrhu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto článkem.