Konstitutivní exprese vybraných genů z pentose phosphate a aromatické dráhy zvyšuje shikimic kyselina výnos v high-glukózy dávku kultury kmene Escherichia coli chybí PT a pykF
- Konstrukce kmenů odvozených od PB12 aroK-aroL- obsahující plazmid určený pro konstitutivní expresi syntetický operon používá při výrobě shikimic kyseliny
- Posuzování vlivů způsobených pykF inaktivace v kmeny vyjadřující Aro6 operon
- Fermentační profily AR36 v dávkových kulturách
- Pohledy na glycolytic a acetát metabolismus kmene AR36 pomocí RT-qPCR
Nepublikované důkazy z naší laboratoře ukazuje, že výroba aromatických sloučenin v laboratoři-se vyvinul kmen PB12 lze dosáhnout vyšší úrovně při transkripční indukce genů zapojených v canalizing tok uhlíku do AAA dráhy dochází na začátku kvašení. S ohledem na toto pozorování byla vyvinuta nová strategie pro optimalizaci produkce SA v pb12 nesoucích neaktivní geny aroK a aroL (Obrázek 1). Tato strategie zahrnovala návrh a konstrukci plazmidu pro silnou a stabilní expresi šesti klíčových genů uspořádaných ve formě syntetického operonu, řízeného výhradně jediným promotorem Trc. Za účelem snížení metabolické zátěže, jediný plasmid odvozený od pBR327 nesoucí par locus pro zvýšení plasmidu stability byl využit jako vektor , po zapracování fragment obsahující promotor, polylinker, a transkripční terminátory od pTrc99A (Obrázek 2).
počáteční část operace byla postavena postupného zesílení a ligace první 4 kódujících sekvencí (vyrazí do války, tktA, aroGfbr, a aroE) do polylinker z plasmidu pBRINT-Ts Cm, který se používá jako klonování lešení (viz Metody). Později, 4-gene stavba byla převedena na hybridní plazmid pTrc327par ve spojení s 2 a více genů (tyč a zwf), což vede k 8Kb operon obsažené ve 12 kb plazmid (Obrázek 2). Výsledný plasmid, nazývané pTrcAro6, byl transformován do PB12 aroK-aroL – kmen postrádá lacIq gen, umožňující konstitutivní expresi genů zájmu (Tabulka 1). Pro jednoduchost byl generovaný kmen pb12 aroK-aroL-lacI nazván AR2. Po inaktivaci genu pykF v AR2 byl výsledný kmen pojmenován AR3. Kmeny odvozené od AR2 a AR3 nesoucích plazmid pTrcAro6 byly pojmenovány AR26 a AR36 (Tabulka 1).
prostorové uspořádání kódování sekvencí, které představují syntetické operace v pTrcAro6, lemovaný Trc promotér a transkripční terminátory, je znázorněno na Obrázku 2. vyrazí do války, je prvním genem v operon od několika důkazy naznačují, že jeho nízká exprese je jedním z limitujících kroků při výrobě aromatických sloučenin . Plasmid pTrcAro6 také nese tktA a aroGfbr geny, jejichž produkty jsou zapojeny v E4P syntéza a jeho kondenzace s PEP tvořit DAHP, první aromatických sloučenin (Obrázek 1). geny aroD a aroE byly také zahrnuty, aby podpořily účinnou konverzi DHQ na SA. Navíc tento plazmid nese gen zwf, kódující první enzym PPP (Obrázek 1). Rozhodnutí zahrnout tento gen bylo založeno na následujících pozorováních: 1) zvýšená exprese zwf v podstatě obnovit růst, míra ztráty v důsledku plasmidu metabolické zatížení v napětí JM101 rostoucí na glukosu jako jediný zdroj uhlíku ; 2) bylo zjištěno, že kmen PB12 zobrazí se zvláště nízkým obsahem uhlíku tok oddíl na glukóza-6-fosfátu (G6P) uzlu směrem k PPP (5% spotřebované G6P ve srovnání s 22% v rodičovské kmen JM101) . Proto je zvýšená exprese tohoto genu by se měla zvýšit dostupnost NADPH, požadované v katalytického množství enzymem shikimate dehydrogenase (AroE), a může zmírnit potenciální růst přetvářky tím, že přesměruje více G6P k nukleotidů a aminokyselin biosyntéza v kmeny odvozené od PB12 . Nicméně, experimenty prezentované v této zprávě nebyly cílem pitvat konkrétní účinek využit gen, ale místo toho se snažili charakterizovat důsledky vyjádřit všechny z nich jako operon.
s cílem podpořit efektivní překlad každého genu, každý kódující sekvence byla amplifikována pomocí primerů určených, které zavedly konsensu Shine-Dalgarno sekvence se nachází 8 bp upstream překladu začátek stránky. Nukleotidová sekvence konstruovaného operonu je uvedena v dalším souboru 1.
Posuzování vlivů způsobených pykF inaktivace v kmeny vyjadřující Aro6 operon
vyhodnotit účinky způsobené pykF inaktivace na výrobu SA, výkon produkčních kmenů AR26 (pykF+) a AR36 (pykF-) byl ve srovnání s použitím shake baňky obsahující 15 g/L Glc a 5 g/L YE. Jako kontrola byly také zahrnuty stejné kmeny obsahující prázdný plazmid pTrc327par (bez operonu Aro6), AR2e a AR3e.
I když SA nahromaděné ve všech případech, jak se očekávalo pro mutanty v aroK a aroL, kmeny obsahující pTrcAro6 dosáhl vyšší SA koncentraci než ty s prázdný plasmid (Obrázek 3b). Kromě toho, SA titr byl téměř dvakrát vyšší v AR36 než v AR26 (6,1 g/L vs. 3,3 g/L). Snížení spotřeby Glc bylo pozorováno v kmeni AR26 po přibližně 18 hodinách kultury, korelující s vysokou koncentrací acetátu a zastavením produkce SA. Naproti tomu kmen AR36 vykazoval konstantní spotřebu Glc a bylo vyrobeno zanedbatelné množství acetátu (obrázek 3c, 3d). Tyto výsledky ukazují, že geny přítomné v umělém operonu jsou funkční a podporují produkci SA od začátku kultury. Jejich konstitutivní exprese snížena na specifickou růstovou rychlost (μ) o 25% v pykF+ pozadí, a nepatrně se zvýšil v pykF – varianta, ale neměl způsobit významné změny maximální biomasy vyrábí (Xmax) ve srovnání s kmeny s prázdný plasmid (Obrázek 3a). Je pozoruhodné, že v kmenech exprimujících operon za těchto růstových podmínek inaktivace genu pykF zvýšila produkci SA, eliminovala akumulaci acetátu a umožnila stálou spotřebu Glc.
K určení, zda vyšší acetát výroby a nižší SA výroby v AR26 ve srovnání s AR36 je důsledkem podstaty nízká dostupnost kyslíku a acidifikace prostředí, v třepací lahve kultur, oba kmeny byly kultivovány v 1 L šarže fermentors za kontrolovaných podmínek pH a rozpuštěného kyslíku napětí (TEČKA). Jako přístup ke zvýšení SA titr, počáteční koncentrace Glc v těchto experimentech byla zvýšena na 100 g/L, a YE koncentrace byla současně zvýšena na 15 g/L s cílem umožnit vyšší biomasy generace.
Za těchto podmínek kmen AR36 vyrábí 42 g/L SA v 60 h, náročné všechny Glc, a hromadí 12 g/L octanu. V kontrastu, po 47 h napětí AR26 vyrábí maximálně 13 g/L SA, ne vyčerpat Glc, a nahromaděné 29 g/L kyseliny octové (Obrázek 3e a Tabulka 2). Bez ohledu na kontrolovaných podmínek v fermentors, kde hodnota pH byla udržována na 7 a TEČKA byla vyšší než 20% ve všech dobách, na výrobu profilů z obou kmenů se podobalo chování pozorované v shake baněk, s AR26 produkovat více acetátu a méně SA. I když globální objemové Glc míra spotřeby (Qsglobal), μ a Xmax dosaženo tím, že oba kmeny byly podobné, produktivitu, výnos, a titr byly více než dvojnásobně vyšší v AR36 než v AR26 (Obrázek 3e a Tabulka 2).
je pozoruhodné, že tak velké rozdíly v acetát a SA výroby byly pozorovány narušuje pouze jeden gen, který demonstruje výhody kombinované inaktivace PT a pykF při použití konstitutivní exprese systém vyvinul E. coli kmen. K účtu pro pozorováno zlepšení v SA výroby, jsme naznačují, že včasná a konstantní exprese enzymů zakódovaných v operon mohl udržovat stabilní spotřeba glycolytic meziproduktů v celém kultur, brání vysoké výkyvy v jejich intracelulární koncentrace. Předpokládáme, že kombinace tohoto stabilní metabolického stavu se sníženou tok z PEP na pyruvát způsobené inaktivaci pykF gen může zvýšit dostupnost PEP a další glycolytic prekurzory pro SA produkce bez poklesu Glc míra spotřeby. Uznáváme však, že při absenci naměřených koncentrací intracelulárních metabolitů jsou tyto poznámky spekulativní.
Fermentační profily AR36 v dávkových kulturách
s ohledem na předchozí výsledky, AR36 byl vybrán pro další charakterizaci jeho kinetické a stechiometrické výkon v 1 L fermentors. K dosažení tohoto účelu byla výroba SA testována se třemi různými podmínkami kultivace s vysokým substrátem. Růst, Glc a vedlejší produkty byly měřeny pro každý případ, což zase umožnilo srovnání produktivity a výnosů.
nejprve bylo použito 50 g / L Glc a 15 g / L YE (obrázek 4a). Růst nastal během prvních 10 hodin a vytvořil 6,3 g / L hmotnosti suchých buněk s μ 0,53 h-1. Za tohoto stavu, 24 g/L SA byly vyrobeny v 32 h. Glc spotřeby a SA výroby došlo od počátku kvašení a trvala až do Glc vyčerpání, i když konkrétní Glc míra spotřeby (qs) a konkrétní SA produktivity (qp) byly vyšší v exponenciální fáze (Tabulka 3). Výsledný výtěžek SA na Glc (YSA/Glc) byl 0,47 mol / mol a globální objemová Produktivita SA (Qpglobal) byla 0.74 gSA / L * h (Tabulka 3). S ohledem na hromadění vedlejších produktů v SA dráhy, koncentrace 2,4 g/L DAHP, 2.1 g/L DHS, 1.4 g/L QA, 0.4 g/L GA, a 0,3 g/L DHQ, byly přítomny v supernatantu na konci kvašení (Obrázek 5a). Za těchto podmínek prakticky žádné acetát byl produkován během fermentace, dosahuje maximální koncentrace 1,5 g/L po 32 h (Obrázek 4a).
Vzhledem k tomu, že 50 g/L Glc byly spotřebovány zcela, druhá várka experiment byl zahájen s 100 g/L Glc a 15 g/L YE. Jak je uvedeno ve srovnání s AR26 v předchozím oddíle, AR36 pěstovaný za těchto podmínek produkoval přibližně 42 g / L SA za 60 h (obrázek 4b). V tomto případě, po konzumaci asi 100 g/L glukózy a dosažení maximální koncentrace SA, kmen produkoval 12 g/L octanu. Hodnoty získané pro YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax, a μ, byly podobné těm, získané s 50 g/L Glc a 15 g/L YE (Tabulka 3). Tyto experimenty ukazují, že při použití stejné koncentrace YE, dvojnásobné množství Glc je spotřebováno téměř dvakrát za čas, což naznačuje, že průměrná míra spotřeby glukózy je udržována mezi oběma kultivačními podmínkami. Koncentrace 4,8 g / L DAHP, 2,8 g / L DHS, 3,4 g / L QA, 0.Po 60 hodinách bylo v supernatantu přítomno 7 g/L GA a 0,9 g/L DHQ (obrázek 5b). Zajímavé je, že při zdvojnásobení koncentrace Glc meziproduktů AAA cesta zvýšil v poměrně úměrně s SA, což znamená, že spotřeba 100 g/L Glc není zřejmě vytvářet nové uhlíkové tok překážek. Výsledkem bylo, že množství SA vytvořené vzhledem k celkovým vyrobeným aromatickým sloučeninám bylo v obou pokusech téměř 80% (obrázek 6).
vliv zvýšení YE na produktivitu SA byl zkoumán třetí sadou experimentů s použitím 100 g / L Glc a 30 g / L YE. I když biomasa byla zdvojnásobena při použití dvakrát koncentrace YE, SA titr, μ a YSA/Glc byly velmi podobné těm, získané v kultuře s 100 g/L Glc a 15 g/L YE (Obrázek 4b Obrázek 4c). Ve spojení s údaji získanými z dalších dvou podmínek tato zjištění naznačují, že množství YE primárně určuje maximální biomasu, které lze dosáhnout. Zvýšení počáteční koncentrace YE navíc nezměnilo titr SA a podporuje pozorování, že SA se vyrábí hlavně z glukózy. Přímý vztah mezi počáteční YE koncentrace a maximální biomasy vytvořené, bez ohledu na počáteční koncentrace Glc testovány v těchto podmínkách růstu, naznačuje, že jeden nebo více limitující živiny jsou dodávané YE. Zdá se také, že takové živiny nemohou být syntetizovány z Glc, proto jejich vyčerpání z YE omezuje růst dlouho před vyčerpáním Glc. Očekává se, že aromatické aminokyseliny a vitamíny přítomné v YE, které jsou potřebné k vyrovnání AR36 auxotrophy bude stát omezuje; nicméně, jiné sloučeniny v tomto komplexu médií může také hrát roli v omezení růstu v průběhu času.
Pro výchozí YE koncentraci 30 g/L, celkem 106 g/L Glc a 43 g/L SA byly spotřebovány a vyrobeno, respektive, v přibližně polovinu času, než fermentace s 15 g/L YE. S 30 g/L YE, Qsglobal a Qpglobal vzrostl na dvojnásobek, ve srovnání s kvašení s 15 g/L YE, i když SA titr zůstala beze změny (Tabulka 3). Od biomasy také zvýšil dvojnásobně, vypočtené qp a qs byly podobné mezi tři experimenty, a to jak v exponenciální a stacionární fáze, které vykazují metabolické robustnost inženýrství kmen za testovaných podmínek.
kromě toho výsledky ukázaly, že zvýšení koncentrace YE významně nezvýšilo koncentraci meziproduktů dráhy SA (obrázek 5c). V tomto ohledu bylo uznáno, že přítomnost velkého množství meziproduktů dráhy může negativně ovlivnit regeneraci SA z fermentačního vývaru . Tato obava má režie nějaké úsilí do předmětu, což vede k testování podmínek kultivace, genetické pozadí, a použití non-metabolizable glukózy analogy, jako se snaží minimalizovat vedlejší produkt generace .
V těchto experimentech byl zjištěn vysoký podíl SA vzhledem k vedlejším produktům bez použití jakékoli další modifikace kmene nebo procesu. Koncentrace každé cestě meziprodukt byl v porovnání se součtem všech aromatických meziproduktů, a jejich podíly byly použity pro výpočet molární poměr SA pro každý produkt na konci kvašení (Obrázek 6). Poměr SA ukázalo být vyšší než 10 pro DHS, QA, nebo DAHP, a vyšší než 40 pro GA nebo DHQ pro všechny substrátu koncentrace. Pozoruhodné je, že za všech podmínek byly získané výtěžky SA blízké 50% teoretického maxima a výtěžky celkových aromatických sloučenin (TAC) byly nad 60% teoretického maxima, odhadované jako 0.86 molTAC/molGlc (viz metody a obrázek 6). To odráží efektivní přesměrování glukózy k AAA dráhy v napětí AR36, a to i při použití vysoké glukózy v dávkových kulturách. Poměr SA vedlejší produkty, stejně jako získané SA a TAC výnosy jsou poměrně konstantní pro všechny podmínky hodnoceny, a představují pro naše poznání zaznamenány nejvyšší hodnoty pro SA produkce fermentačního procesu. Tyto vylepšení může být odůvodněno tím, že vezme v úvahu, že platforma přítomen v inženýrství kmen umožňuje více homogenní vyjádření potřebné enzymy na efektivní genetické pozadí. To, v kontrastu s jinými systémy exprese, kde požadované geny jsou vyjádřeny v oddělených plasmidy, v rámci různých organizací, nebo v kmeny nejsou optimalizovány pro efektivní využití vysoké hladiny Glc. Kromě výhod týkajících se dynamiky genové exprese, skutečnost, že IPTG není potřeba vyvolat Aro6 operon představuje významný ekonomický přínos pro výrobní proces, protože vysoká cena IPTG omezuje jeho použití ve velkém měřítku kvašení.
Pohledy na glycolytic a acetát metabolismus kmene AR36 pomocí RT-qPCR
získat hlubší vhled metabolické změny vyvolané konstitutivní exprese Aro6 syntetické operace v napětí AR36, přepis úrovně několika genů byly měřeny ve třech různých fázích růstu v kulturách s 50 g/L Glc a 15 g/L YE. Jak je uvedeno v Metodách, údaje získané z časné exponenciální fáze (EE), pozdní exponenciální fáze (LE) a stacionární fází (ST) byly normalizovány vůči naměřené hodnoty z kmene AR3e na EE, pěstované za stejných kultivačních podmínek.
výsledky ukazují, že přítomnost a vyjádření operon v napětí AR36 zvyšuje transkripční úrovně několika genů, kódujících glycolytic enzymů v EE a LE fází (Obrázek 1 a Obrázek 7a). Nárůst exprese genů galP a glk je obzvláště zajímavý, protože bylo hlášeno, že jejich produkty kontrolují dovoz a fosforylaci glukózy v pb12, rodičovském kmeni AR36 . Kromě toho dochází k významnému zvýšení transkripčních hladin CHZO a eno, ale ne pykA. Tyto změny mohou promítnout do vyšší dostupnost PEP a fruktóza 6-P (což může být přímo převedeny do E4P o plazmidem transketoláza), rostoucí výnos z aromatických sloučenin. My se domnívají, že pozorována upregulace glycolytic genů u kmene AR36 by mohl být jedním z důsledků nízké hladiny některých glycolytic meziprodukty (glukóza 6-fosfát, fruktosa-6-fosfátu a PEP), způsobené silné a konstitutivní exprese operon-kódované enzymy, které spotřebovávají tyto metabolity.
Na druhé straně, transkripční úrovně genů, kódujících enzymy, které se účastní acetát biosyntézy (poxB, ackA a pta) nebyla modifikována přítomností syntetických operon, zatímco actP a acs, kódující enzymy, které se účastní acetát asimilace, byli silně upregulated v EE a LE fází (Obrázek 7b). Upregulace actP a acs geny byla také detekována v exponenciální fázi růstu v rodičovské kmen PB12, že je schopen spolupráce-využití Glc a acetát v minimálním médiu . Tato zjištění korelují s nízkými hladinami acetátu v testovaném růstovém stavu (obrázek 4a). Důležité je, že transkripční hodnoty těchto genů zapojených do asimilace acetátu byly ve fázi ST nízké (obrázek 7b). Pokud tato reakce je zástupce jiné růstové podmínky, mohlo by to částečně vysvětlit acetát pozorována akumulace v kvašení s 100 g/L Glc, které konzumují vyšší množství Glc během stacionární fáze (Obrázek 4b Obrázek 4c). Tyto výsledky zdůrazňují actP a acs jako potenciální genové cíle, aby uměle zvýšit jejich vyjádření v pozdní kultury etapách, s využitím očekávané schopnosti kmen AR36 využít současně Glc a-acetát, přítomné v jeho rodičovského kmene PB12 .
geny přítomné v syntetických operon ukázal velmi silný výraz úrovní (i ve stacionární fáze), což odráží konstitutivní povahu organizace a vysoký počet kopií plasmidu (viz Obrázek 7c). Tyto výsledky korelují s nepřerušenou Glc spotřeby a SA produkce pozorována v průběhu celého kvašení (Obrázek 4a), což naznačuje, že enzymy kódované geny v operon jsou přítomny v průběhu pěstování času. Na obrázku 7c je vidět, že hladiny transkriptu aroD a zwf jsou poměrně vyšší a nižší než ostatní čtyři geny v operonu. Toto pozorování by měl být užíván s opatrností, protože šest genů v operon jsou ve srovnání s těmi, přítomné v chromozomu referenční napětí AR3e. Od hodnoty získané pro šest genů jsou normalizovány mezi nimi, rozdíly mezi jejich chromozomální výraz v napětí AR3e může změnit relativní srovnání s kmenem AR36. Nicméně, transcriptomic údajů je v souladu s vysokým poměrem SA aromatických meziproduktů získaných v testované podmínky, které je třeba očekávat, když všechny geny v operon byly dostatečně vyjádřeny. Spolu s kinetickou a stechiometrické údaje, tyto výsledky poukazují na výhody zaměstnávání constitutively-vyjádřil syntetické operon jako alternativní strategie, jak zvýšit výnos z SA z Glc vyvinul kmen, který postrádá PT a pykF.