Kruhové diferenciální exprese RNA v krvi buněčných populací a zkoumání circRNA deregulace v pediatrické akutní lymfoblastické leukémie

CircRNAomes z B-, T-buněk a monocytů populace

CircRNA výraz v B-, T-buněk a monocytů populace zdravých dárců byla zkoumána s použitím high-hloubka ribodepleted RNA-seq dat z 12 vzorků, s 4 opakování pro každou populaci buněk řazeny z mononukleárních buněk periferní krve, Pbmc (GEO series ID: GSE110159; doplňkové metody a doplňková Tabulka 1).

CircRNA kvantifikace a anotace byly poskytnuty CirComPara25, což v kombinaci 9 circRNA detekce softwarových nástrojů (CIRI226 Findcirc27; CIRCexplorer228 na BWA29, STAR30, Segemehl31 a TopHat232 rovnátek; DCC33; circRNA_finder34; a Segemehl31) chcete-li získat nejspolehlivější backsplices. Bylo prokázáno, že sdílený výstup ze dvou nebo více algoritmů pro detekci circRNA snižuje falešně pozitivní predikce35,36. CirComPara provádí filtry kvality čtení před zpracováním, jako je ořezávání adaptérů, výběr střední kvality čtení a filtrování podle délky čtení. Navíc, CirComPara počítá lineárně sestříhané čte zarovnány backsplice křižovatek každého circRNA odhadnout vyjádření lineární přepisy vyjádřil z circRNA hostitele-gen. Tyto hodnoty byly v kombinaci s backspliced číst počítá, kterými se měří kruhovou výraz, vypočítat podíl exprese mezi kruhovou a lineární izoformy (Kruhové na Lineární výraz Podíl, CLP; viz Metody). Dále, CLP vloží koncept kruhový na lineární výraz korelace, takže CLP variace napříč podmínek vyjadřuje míru nezávislosti mezi circRNA a jeho hostitele-gen je lineární expression33.

celkově bylo nejméně dvěma metodami detekováno 68 007 cirkrna z 10 148 jednotlivých genů. Jak uvádí Hansen et al.36 se algoritmy většinou shodovaly na vysoce vyjádřených cirkrna, zatímco ty, které byly detekovány pouze jedním algoritmem, měly obecně nízký počet čtení (Doplňkový obr. 1).

Dále, pod-sadu 6,228 circRNAs (z 3,323 geny) ukazuje expresi ve všech biologických replikátů alespoň jeden typ buněk byl získán a odkazoval se na jako “vysoké důvěry” (HC) circRNAs (Doplňující Tabulka 2). Srovnání cirkrna hlášených v této studii s výsledky Nicolet et al.17 potvrzena shoda na 83% 489 HC circRNAs citováno v předchozí studii a zveřejněny 5,824 další HC circRNAs, které byly dosud zkoumány pro výraz odchylky v krevních buněčných populací (Doplňkový Obr. 2A).

6,228 HC circRNAs, 5,970 a 5,821 byly vyjádřeny v B – a T-buněk, a 5,144 v monocytů (Obr. 1a). Většina cirkrna (4 763; 80%) byla detekována ve všech třech typech buněk, včetně všudypřítomných circZNF60937, circHIPK338 a nových cirkrna. Nové cirkrna (např. circPICALM) jsou pravděpodobně specifické pro hematopoetický kompartment. Circrna sdílené dvěma buněčnými typy, kde jsou většinou běžné mezi lymfocyty.

porovnání cirkrnaomu B -, T-buněk a monocytů. (a) Přesah 6,228 vysokou důvěru (HC) circRNAs vyjádřená v B-, T-lymfocyty a monocyty; (b) analýza Hlavních komponent HC circRNA výraz profily; (c) Ověřené circRNAs po RNase R léčbu. B2M, GAPDH a HPTR mRNAs jsou zobrazeny jako pozitivní kontroly; Relativní vyjádření je počítáno jako 2−∆Cq, kde ∆Cq je rozdíl mezi RNase R ošetřeny, a celkové PBMC RNA; (d) Počet circRNAs za genem vyjádřené celkově a v každé buňce typ.

bez Dozoru hlavních komponent analýza ukázala relativně malé variace circRNA výraz profily v rámci opakování stejné populace buněk, a ukázal na circRNAome rozdíly, které jasně diskriminováni typy buněk (Obr. 1b).

exprese 21 HC cirkrna byla validována RT-PCR v Pbmc různých zdravých dárců (doplňková Tabulka 3; Tabulka 1; obr. 1c). Tato validace zahrnovala exonické cirkrna z 15 různých genů, dvě alternativní izoformy IKZF1 a ZFY specifické pro muže z chromozomu Y, jednu circRNA (18:63280887-63281214:−) odvozené od circularization 328 bp unikátní velké BCL2 intron, a jeden circRNA z domnělého nového genu (“intergenic”, viz níže). Kruhové struktury circRNAs byl potvrzen pozorovány obohacení circRNAs po RNase R léčbu, a detekovány zásahovou jednotku-PCR s rozdílnými primery specifickými pro backsplice junction14,27. Navíc, všechny předpokládané backsplice křižovatky byly potvrzeny sekvenováním Sanger.

Více kruhových izoformy a circRNAs z nové geny

Téměř všechny circRNAs (99.4%) odvozené z anotovaných genů, převážně s backsplice křižovatek překrývající známý exons (98.9%). 71 circRNAs s oběma konci v intronic regionů, nejhojnější ty, včetně lymfocytů-specifické circBCL2, který byl ověřen, circHLA-E, circRASSF3, a několik circMBL1 izoformy.

téměř polovina hostitelských genů circRNA exprimovala více (až 20) kruhových izoform (obr. 1d). Bylo pozorováno preferenční využití backsplice junction a vyjádření jedné nebo několika převládajících izoform. Nejvyšší počet izoforem byly vyjádřeny v monocyty tím, AGTPBP1 (20) a PICALM (15), a v lymfocytech u UBAP2 (19) a ATM (17).

třicet čtyři cirkrna odvozených z mezigenních oblastí. Intergenic circRNAs pomocí stejné backsplice končí v různých kombinacích identifikovány tři loci vyjadřuje více izoforem. Pět “intergenních” cirkrna odvozených z domnělého nového genu v oblasti Xq11 .2 (chrX: 65051462-65113813) (Doplňkový obr. 3). Nejhojnější circRNA aktivní, circX(intergenic) (X:65051462-65075912:+), dříve detekovány v krvi také Memczak a colleagues12, byl ověřen (Obr. 1c).

dále jsme zkoumali, do jaké míry je výraz ve prospěch kruhového s ohledem na lineární transkripty překrývající se backsplice křižovatky. CLP hodnoty se pohybují od 0 do 1: 0 přijde, když ne kruhové výraz je detekován, 0 < CLP < 0.5 představuje circRNAs vyjádřil méně bohatě než příslušné lineární izoformy, 0.5 znamená, že kruhové a lineární přepisy mají ekvivalentní množství, 0.5 < CLP ≤ 1 označuje kruhové izoformy vyjádřené hojněji než příslušné lineární transkripty. Zejména CLP = 1, když není detekována lineární exprese vzhledem k circRNA. Zajímavé je, že pro 10 cirkrna nebyla detekována žádná lineární exprese. Navíc, CLP byla pozoruhodně vysoká (>0.95) pro 14 circRNAs (Doplňující Tabulka 4), včetně circGUSBP2 a circNBPF10, s mediánem CLP v rozmezí od 0,99 1 ve všech buněčných populací (Doplňující Tabulka 4), a circAFF2, který ukázal vysokou CLP v monocyty (0.97). Preferenční přepis circularization ve zralé krevní buňky specifické genes5,39 a/nebo vyšší stabilitu kruhové ve srovnání s lineární RNAs16,40 by mohly tyto závěry vysvětlit.

Srovnání mezi typy buněk zveřejněny typ buněk-specifické circRNA výraz a alternativní circularization vzory

Další, naším cílem bylo definovat rozdíly z B-, T-buněk a monocytů populace circRNAomes. Párové srovnání tří populací identifikovány celkově 1,369 výrazně rozdílně vyjádřené circRNAs (DECs) mezi typy buněk (Doplňující Tabulka 5), které jsou odvozeny od 880 geny. Hierarchické shlukování expresních profilů DEC odráželo množiny circrna upregulovaných v každém typu buňky (obr. 2a). DECs výlučně nebo nadměrně exprimované V jednom buněčném typu indikovaly cirkrna specifické pro populaci (obr. 2b): 622 bylo charakteristických pro B-buňky, 183 T-buněk a 438 monocytů (celkem 1 243; doplňková Tabulka 5). Kromě toho bylo 72 DECs upregulováno v obou populacích lymfocytů (obr. 2b-d). Ne výrazně obohacený KEGG drah gene ontology vedlo pro geny z B-buněk-charakteristika circRNAs, které však zahrnuty geny zapojené v B-cell receptor signální dráhy, jako je SOS2 a NFKB1, či s B-buněčných funkcí. Naopak geny exprimující T-buněčné charakteristické cirkrna byly signální cestou receptoru T-buněk významně obohaceny. Navíc geny cirkrna charakteristických pro monocyty významně obohatily několik biologických procesů a cest souvisejících s funkcemi monocytů. Jiné hostitelské geny charakteristické pro buněčný typ měly místo toho buněčné funkce, které nebyly přímo spojeny s buňkou původu (doplňková Tabulka 6).

diferenciální exprese cirkrna v populacích dospělých krvinek. a) hierarchické shlukování (euklidovská vzdálenost; kompletní clustering) projevu profil 1,369 výrazně rozdílně vyjádřené circRNAs (DECs) mezi typy buněk. (b) Vennův diagram znázorňující překrytí circRNAs nadměrně exprimován v každé populaci: non-křižovatka části osnovy typ buněk-specifické nadměrně exprimován circRNAs. (c) Hostitelské geny pro DECs nadměrně exprimován pouze v jednom typu buněk: křižovatka regiony představují geny vyjadřující různé kruhové izoformy nadměrně exprimován v různých typech buněk. (d) zásahovou jednotku-PCR ověření exprese 15 circRNAs, z nichž 13 jsou výrazně nadměrně exprimován v monocytů (M), T-buňky (T), B-buňky (B), nebo obou populací lymfocytů (T + B). Ve shodě s údaji RNA-seq nebyly circZFY a circGRHPR významně diferencovaně vyjádřeny. Genové exony zapojené do backsplice jsou zobrazeny v závorkách za názvem circRNA. Exprese vzhledem k průměru B-buněk. Mann-Whitney U-test, hodnota p* < 0.05, ** < 0.01.

i když typ buněk-charakteristika circRNA sady byly disjunktní, překrytí genových sad, které vyjádřila konkrétní izoformy uvedeno alternativní typ buněk-specifické circularization vzory. Poznámky, 37 genů, vyjádřené circRNAs charakteristické dva typy buněk, a představovaly 14,7% genů s více typ buněk-specifické circRNAs (Obr. 2c). Čtyři circAKT3 izoformy ukázal, typ buněk-specifický výraz, tři pro B – a T-buněk; také čtyři circMBNL1 byly buňky konkrétní typ 3 pro B-buňky a jeden pro monocyty. Navíc, šest různých GRK3 kruhové izoformy byly speciálně nadměrně exprimován na B-buňkách, zatímco dva jiní byli nadměrně exprimován pouze v monocyty.

Kvantifikace o zásahovou jednotku-PCR v B-buňky, T-buňky a monocyty řazena od 5 nezávislých zdravých dárců potvrdil, RNA-seq výsledky pro všech 15 testovaných circRNAs, podpůrné údaje, robustnost a reprodukovatelnost (Obr. 2d a doplňkový obr. 4).

Významné up-regulace v B-buňkách 5 circRNAs, včetně circAFF3 (exons 4-6), circIL4R (exons 6-7), circSETBP1 (exon 2) byla potvrzena. Navíc vysoká exprese circRNA z genomové oblasti 9p13. 2 včetně PAX5 (Doplňkový obr. 5) byl ověřen: circPAX5 (exons 2-5) a circZCCHC7 (exon 2) byli oba z B-buněk-specifické, zatímco trend směrem k upregulace circGRHPR v B-buňkách byla ve shodě s odhadem z RNA-seq dat. PAX5 vykazuje nápadnou roli v závazku B-cells41 a co exprese PAX5 a ZCCHC7 lineární přepisy byl popsán během progrese od běžných lymfocytů prekurzorů pre-pro-B cells42. Naznačující spoluregulaci 9p13.2 locus, circPAX5, circZCCHC7 and circGRHPR isoforms were all overexpressed specifically in B-cells. CircPAX5 and circZCCHC7 were previously detected in CD19 + cells14. Both circZCCHC7 and circGRHPR were identified in CD34 + cells and, according to data on RNA base modification promoting efficient initiation of protein translation from circRNAs in human cells, are likely to encode peptides10.

Regarding T-cells, significant overexpression was confirmed for circIKZF1 (exons 2–3), circTNIK (exons 5–7), circTXK (exons 2–6) and, in agreement with previous reports17, for circFBXW7 (exons 3–4). Also an increasing trend for circZFY (exons 2–3) in T-cells and for circAFF2 (exon 3) in monocytes, in agreement with Nicolet et al.17, confirmed RNA-seq results, while significant upregulation of circX(intergenic) and circBCL2(intronic) in lymphocytes and of circHIPK3 (exon 2) in monocytes was validated.

Nicolet et al.17 bylo nalezeno 102 cirkrna odlišně exprimovaných napříč typy a stadii krevních buněk, z nichž 98 bylo zjištěno v našich datech. Zejména 42 cirkrna vyústilo v rozdílné vyjádření také v našem srovnání, 31 z nich bylo specifické pro buněčný typ. Celkově naše data, kde po dohodě s circRNA klastrů dříve spojené do zralých buněčných populací (Doplňkový Obr. 2b). CircRNAs dříve přidělen do lymfoidních buněk-specifické shluky vykazovaly nejvyšší expresi v B-buněk nebo T-buněk, včetně circZCCHC7 a circFBXW7, že jsme experimentálně ověřena. Devět z 10 cirkrna, které byly dříve považovány za monocyty specifické, byly připomenuty naší analýzou, která byla více exprimována v monocytech, včetně cirkaf2. Nicméně, většina z 1,243 circRNAs definován jako typ buněk-specifické v této studii, včetně 11 z 15 circRNAs, pro který typ buněk-specifické zvýšená exprese byla potvrzena zásahovou jednotku-PCR v této studii (Obr. 2d), nebyly zastoupeny v klastrech definovaných Nicolet et al.

dále jsme zkontrolovali, zda množství kruhových izoforem s ohledem na lineární expresi bylo změněno mezi typy buněk. Změny CLP napříč podmínkami vzorku ukazují rychlost nezávislosti mezi circRNA a lineární expresí hostitelského genu. Za prvé, jsme pozorovali, že počet circRNAs s hojnější kruhové výraz podíl (CLP > 0.5) byl nejvyšší v lymfoidních buněk (185 v monocyty, 333 a 364 v B-buňky a T-buňky, v tomto pořadí), což je v souladu s předchozí pozorování na menší sadu circRNAs17. Poté jsme identifikovali 687 cirkrna (ze 495 genů) s expresí nezávislou na hostitelském genu (doplňková Tabulka 7). Mezi DECs, 163 měl významné odchylky kruhové vyjádření poměru mezi typy buněk v dohodě k diferenciální absolutním vyjádření, což naznačuje, že pozorované rozdíly těchto circRNA výraz úrovni přes buněčné populace nejsou vzhledem k odpovídající variantu lineární výraz. Cirkikzf1, u kterého byla validována upregulace v T-buňkách, byl také exprimován s vysokým CLP v T-buňkách. Zejména 25 cirkrna vykazovalo vysoký a významně různý podíl kruhové exprese (Doplňkový obr. 6), včetně validovaných cirkx (intergenních) a tří dalších intergenních cirkrna, všechny nadměrně exprimované v B-A T-buňkách. CircSMARCA5 měl nejvyšší absolutní a relativní kruhovou expresi v B-buňkách, zatímco byl významně nižší v T-buňkách a nejnižší v monocytech (Doplňkový obr. 7).

Vyjádření circRNAs v šesti cytogenetické podtypy B-prekurzorových buněk akutní lymfoblastická leukémie

od výše popsané transcriptome-široký circRNA zdrojů, vyjádření a případné deregulace circRNAs v BCP-ALL byla zkoumána pro cílový soubor circRNAs. Vybrané cirkrna vykazovaly specificitu lymfocytů a / nebo odvozené od lokusů spojených s leukémií. Podle těchto kritérií deset cirkrna s validovanou upregulací v B-buňkách, T-buňkách nebo v obou populacích lymfocytů (obr. 2d) byly vybrány pro kvantifikaci v BCP-ALL, včetně circRNAs od známých genů (AFF2, AFF3, BCL2, FBXW7, IKZF1, IL4R, PAX5, SETBP1 a ZCCHC7) a nově zjištěná circX(intergenic) vysoce vyjádřeny v lymfocyty. Kromě toho circZFY, cirkrna exprimovaná na vysoké úrovni v krevních buňkách mužských subjektů; circHIPK3, pro které jsou známy onkogenní vlastnosti u solidních rakovin43; a circPVT1, nedávno spojený s akutní lymfoblastickou leukémií22, byly zahrnuty.

exprese 13 vybraných circrna byla měřena pomocí qRT-PCR ve 32 vzorcích XENOGRAFTU (PDX) odvozených od BCP (doplňková tabulka 8).

všechny leukemické vzorky byly nejprve porovnány s B-buňkami od zdravých dárců (Doplňkový obr. 8 a obr. 3a) pro kontrolu deregulované exprese cirkrna v leukemických buňkách. U sedmi cirkrna byla exprese významně odlišná ve všech vzorcích ve srovnání s B-buňkami. CircIL4R, circZCCHC7 and circX(intergenic), all highly expressed in lymphocytes, were less expressed in ALL. Conversely, overexpression of circAFF3, circHIPK3, circPVT1 and circPAX5 in BCP-ALL emerged. Differently from circPVT1 and circHIPK3, a functional characterization of circPAX5 and circAFF3 is still lacking. Thus, custom functional predictions, in terms of possible miRNA- binding sites, RNA binding protein (RBP) binding sites, and coding potential were obtained (Fig. 3b and Supplementary Fig. 9).

CircRNA výraz v trpěliví-odvozené BCP-VŠECHNY vzorky a předpokládané funkce circAFF3 a circPAX5. (a) Relativní exprese 12 circRNAs hodnotí zásahovou jednotku-PCR u zdravých PBMC získaných B-buněk a 32 BCP-ALL trpěliví-odvozené xenograft vzorky s různými genetické podtypy: MLL upravil (n = 4), BCR-ABL (3), ETV6-RUNX1 (6), TCF3-PBX1 (4), vysoká hyperdiploid (>50 chromozomů, 7), “Ostatní” (negativní pro zmíněné přestavby, 8). Exprese vzhledem k B-buňkám. Pouze významné hodnoty p (<0.05) jsou uvedeny (Kruskal-Wallisův test, opravený pro vícenásobné testování pomocí postupu Benjamini, Krieger a Yekuteli). P-hodnoty na “B-buňkách” se vztahují na B-buňky vs všechny BCP – všechny vzorky (Mann Whitney U-test, zobrazeny pouze významné hodnoty). (b) Predikce funkce a interakce circAFF3 a circPAX5, včetně předpokládané miRNA-vazebná místa, sekvenčních motivů, případně rozpoznávány RNA vazebné proteiny (RB) a otevřené čtecí rámce (Orf) alespoň 150 nt zahrnující backplice.

dále jsme zkoumali expresi cílové sady cirkrna napříč hlavními BCP-všechny cytogenetické podtypy (obr. 3a). Cytogenetické podtypy jsou charakterizovány specifické genetické léze, včetně rekurentních translokací (MLL přestaveb, BCR/ABL, ETV6-RUNX1, a TCF3-PBX1 fúze) a hyperdiploid karyotypu. Charakterizace cytogenetického podtypu je nápomocná pro prognózu rizika a stratifikaci léčby pacientů s leukémií. Leukemické buňky různých podtypů mají odlišné biologické vlastnosti, profily genové exprese a specifické znaky mirna44,45. V této souvislosti byly nové informace o heterogenní povaze akutních leukémií přidány pozorovanými významnými rozdíly v expresi circRNA mezi cytogenetickými podtypy (obr. 3a). CircAFF2 byl vysoce exprimován v TCF3-PBX1 BCP-ALL a, v menší míře, v ETV6-RUNX1 BCP-ALL, ve srovnání s B-buňky a další cytogenetické BCP-ALL podskupin. CircBCL2 (intronic) byl upregulován ve všech s fúzemi ETV6-RUNX1. CircSETBP1 a circX (intergenic) byly oba velmi redukovány v přeskupených vzorcích MLL. Cirkikzf1 byl nižší u BCR-ABL a hyperdiploidních leukémií ve srovnání s podtypem ETV6-RUNX1, ve kterém byla exprese zachována na úrovních srovnatelných s B-buňkami.