Makrofágů Vyčerpání tím, že Klodronát-Obsahující Liposomy Snižuje Neointimal Formace Po Balónu Zranění u Potkanů a Králíků

Zánětlivé buňky hrají významnou roli v cévní opravy, přijímáni bezprostředně po zranění.1,2 infiltrace makrofágů v tkáni aterektomie a stav aktivace krevních monocytů korelují se zvýšenou rychlostí restenózy.3,4 účinky makrofágy v restenózy pravděpodobně jsou způsobeny jejich schopnost vyjádřit četné růstové faktory, cytokiny a enzymy, které přispívají k rozvoji restenózy.5 Proto jsme předpokládali, že systémové inaktivace monocytů a makrofágů může vést k útlumu neointimal tvorbu a makrofágy hrají klíčovou roli v patogenezi restenózy.

deplece makrofágů lze dosáhnout systémovou injekcí liposomů obsahujících klodronát.6 Klodronát patří do rodiny bisfosfonátů (BPs), činidel hledajících kosti, které jsou silnými inhibitory osteoklastů. Stejně jako ostatní BPs má klodronát špatnou propustnost buněčné membrány.7 liposomů je snadno zachyceno buňkami retikuloendoteliálního systému, zejména makrofágy. Liposom-zprostředkované dodání klodronát inaktivuje a zabíjí makrofágy po účinné phagocytosis8 ale není toxický pro nonphagocytic buněk.6

Metody

Liposomy

Klodronát (Sifavitor) a rhodamine RE (Avanti Polar Lipids) byly shrnuty v liposomy složené z 50 µmol/L distearoyl-phosphatidylglycerol (DSPG) (Avanti), 100 µmol/L cholesterol (Sigma Chemických látek), a 150 µmol/L 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC) (Avanti) reverzní fáze odpařování techniku, jak je popsáno jinde.9 Průměrná velikost liposomů byla 190±18 nm, 24,5 mmol / L a 20 mmol/L, klodronát a lipidy.

validace LC biologické aktivity byla stanovena na makrofágových surových 264 buňkách. LC ale ne zdarma klodronát výrazně snížil počet a šíření životaschopných buněk v závislosti na dávce a neměl vliv na buňky hladké svaloviny (jižního středomoří) nebo endoteliálních buněk (EC) životaschopnost a proliferaci v koncentracích 500 µmol/L (data nejsou zobrazena), v souladu s publikovanými údaji.8,10

králičí Model

novozélandští bílí králíci (Harlan Laboratories, Jeruzalém, Izrael) o hmotnosti 2,5 až 3.5 kg bylo použito v souladu s pokyny pro péči o zvířata Hebrejské univerzity v Jeruzalémě a National Institutes of Health (USA). Zvířata byla krmena aterogenní stravou 2% cholesterolu a 6% arašídového oleje, počínaje 30 dny Před angioplastikou. Byla zjištěna hypercholesterolemie (plazmatický cholesterol >1200 mg/dL). Zvířata byla anestetizována xylazinem (7 mg / kg) a ketaminem (40 mg/kg). Byly podány Heparin (200 U/kg), atropin (0, 05 mg) a norfloxacin nikotinát (70 mg). Balón zranění byla provedena na levé společné krkavice s 3-mm angioplastika balón katétr (Cordis, 2×1 minutu inflace na 8 atm). Zvířata byla náhodně přiřazen k intravenózní lipozomální nebo zdarma klodronát (15 mg/kg), prázdné liposomy, nebo vyrovnávací paměti. Vyšetřovatel zaslepený typem experimentální skupiny provedl experimenty. Po eutanazii pentothalem byly tepny perfuzně fixovány in situ 150 mL 4% roztoku formaldehydu (pH 7.4), zpracované pro morfometrické analýzy a obarví s Verhoeff elastinu barvení, Mayer hematoxylin a eosin, a upravený Movat pentachrome.

byl použit model potkanů

samci potkanů Sabra (Harlan Laboratories) o hmotnosti 350 až 420 g. Model poranění krkavice krysy byl proveden, jak bylo popsáno výše.11,12 lipozomální klodronát (15 mg / kg)byl injikován ve dnech -1 a +6. Orgány byly sklizeny 14. den a zpracovány tak, jak je popsáno výše.

Morfometrické Analýzy

Osm až 10 sekcí v každém snímku byly analyzovány pomocí počítačové morfometrické analýzy (NIH Image) tím, že vyšetřovatel oslepen na typu experimentální skupiny. Sekce s největším luminálním zúžením neointimou byla analyzována, jak bylo popsáno výše.11 zbytkový lumen, Plocha ohraničená vnitřní elastickou laminou (původní lumen) a plocha ohraničená vnější elastickou laminou (celková arteriální Plocha) byly měřeny přímo. Stupeň neointimal zahušťování byla vyjádřena jako poměr mezi plochou neointima a původní lumen (% stenózy) a jako poměr mezi neointimal oblasti do oblasti médií (N/M). Stupeň remodelace, konstriktivní (negativní) a expanzivní (pozitivní), a přestavby poměru (RR) byla odhadnuta porovnáním poměru celkových arteriální části balónu-zraněný segmentu s přilehlým, noninjured referenční segment.

průtoková Cytometrie

Antikoagulované krve (200 µL) byla inkubována po dobu 30 minut (4°C, ve tmě) s mouse anti-human RPE-konjugované anti-CD14 (DAKO). Po dobu 15 minut byl přidán roztok pro lýzu FACS (ředění 1:20). Zbytkové buňky byly promyty (×1500 ot / min, 5 minut, 4°C) v médiu FACS (PBS, 1% BSA, 0, 02% azid sodný) a suspendovány v 1 mL FACS médiu pro průtokovou cytometrii. Monocyty byly identifikovány podle jejich relativní velikosti, bočního rozptylu a fluorescence.

Distribuce Liposomů

Králíci jsou injekčně s rhodamine-značené liposomy (0,4 mg/kg) a LC nebo pufru v den -1 a utraceno na dny +1 a +6. Krevní monocyty byly odděleny použitím ficollového gradientu (Sigma)a centrifugace (×1500 ot / min, 5 minut). Sklizené tkáně byly opláchnuty ve fyziologickém roztoku; řezy byly namontovány na sklíčka a pozorovány konfokální mikroskopií (Zeiss LSM 410).

imunohistochemie

Explantované vzorky byly vyříznuty po krátké perfuzi fyziologického roztoku a okamžitě zmrazeny v Oct sloučenině pro kryosekciaci (Ted Pella, Inc). Snímky byly deparaffinized, inkubovány s 1% H2O2 v methanolu (10 minut) k zablokování endogenní peroxidázy, a pak s 10% koňského séra PBS pro (20 minut). Primární protilátky pro králičí RAM-11 (DAKO) nebo PCNA (PC10, DAKO) byly aplikovány po dobu 1 hodiny při 37°C. Sekce byly poté promyty PBS následovanou biotinylovanou sekundární protilátkou (IgG proti myší koně, vektorová laboratoř)a komplexem avidin-biotin-peroxidáza (ABC Elite kit, vektorová laboratoř) po dobu 30 minut. Vývoj barvy bylo dosaženo tím, že 5 minut expozice 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochlorid (DAB-peroxidázový substrát, Sigma Chemical Co) v přítomnosti peroxidázy substrátu (Sigma). Diapozitivy byly mírně kontrastovány žaberním hematoxylinem č. 3 (Sigma). Pozitivní barvení bylo hodnoceno pod mikroskopem (Olympus, BX40) při 2× / 0,25 10× / 0.25 zvětšení a digitalizované video snímky. Prevalence makrofágů byla hodnocena jako průměrná procentuální plocha obsazená pozitivně obarvenými buňkami v 5 až 6 vysoce výkonných polích.

produkce a transkripce IL-1β

pro tyto studie byly použity samostatné skupiny zvířat. Tepny a játra byly homogenizovány v kolagenázovém pufru a extrahovaný IL-1β byl měřen pomocí komerčních souprav ELISA (systémy R&D).

pro analýzu reverzní transkripce–polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) byla RNA z krčních tepen extrahována pomocí sady pro izolaci RNA (Life Technologies). Byla zkoumána kvalita, velikost a množství RNA a hodnoty pásem byly normalizovány na expresi β-aktinové mRNA.13

aktivita Matrix metaloproteinázy-2

supernatant homogenátu tepen v pufru kolagenázy byl analyzován na aktivitu kolagenázy. Vzorky byly odděleny na želatině impregnované (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyakrylamidové gely podle nonreducing podmínky, protřepat 30 minut v 2,5% Triton X-100 (BDH), inkubovány v kolagenázu vyrovnávací paměti (16 hodin, 37°C), a barevné s 0,5% Coomassie G-250 (BioRad) ve směsi methanol/kyselina octová/H2O (30:10:60). Intenzita pásma byla stanovena počítačovou denzitometrií (molekulární dynamika typu 300A).

Statistika

Data jsou vyjádřena jako průměr±SD. Srovnání histologických nálezů mezi kontrolní a léčebnou skupinou bylo provedeno nepárovým Studentovým t testem. Srovnání krevních monocytů a cytokinů v průběhu času bylo provedeno pomocí 2cestné analýzy ANOVA. Rozdíly byly statisticky významné při p<0,05.

Výsledky

Prevence Postangioplasty Hyperplazie

Masivní šíření jižního středomoří a extracelulární matrix tvorbě byl viděn v kontrolních zvířat balón po zranění (Obrázek 1, a a b). Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly mezi léčbou prázdnými liposomy, fyziologickým roztokem nebo volným klodronátem v roztoku (výsledky sdružené jako kontroly). Poměr N / M byl 1,4±0,44 (obrázek 1e) a luminální stenóza 75±8%. LC (15 mg/ kg, dny -1 a +6) snížil poměr N / M na 0,66±0,2 (Obrázek 1, c, d A e) a luminální stenóza na 41±8%. U obou kontrol došlo k mírné expanzivní remodelaci (RR=1. 22±0,24) a zvířata ošetřená LC (RR=1,29±0,25). Mediální oblast, morfologie kostí a minerální složení nebyly léčbou LC ovlivněny (údaje nejsou zobrazeny). Nebyly pozorovány žádné zjevné infekce a žádné detekovatelné systémové vedlejší účinky.

zjistit vliv deplece makrofágů v nonhypercholesterolemic animal model (bez pěnové buňky) krysa krční zranění, byl použit model.11 značená neointima byla potlačena LC léčbou, bez významné změny mediální a celkové arteriální oblasti (tabulka).

Mechanismus účinku

Snížení Krevních Monocytů a Tkáňových Makrofágů

Základní monocytů úrovni 2,8±0,5% bílých krvinek (WBC). Před operací, 24 hodin po injekci LC, byly monocyty prudce sníženy na <0, 2% celkového WBC (Obrázek 2 ,a A b), zatímco počet WBC zůstal nezměněn. Tři dny po operaci, krevní monocyty byly mírně zvýšila na 3,5±0,4% v kontrolních zvířat a 0,7±0,7% v LC-léčených zvířat, vrací se k normálu po 6 dnech (Obrázek 2c).

makrofágy jater a sleziny byly sníženy barvením LC (RAM 11) 6 dní po poranění (obrázek 3). Kladně barevného prostoru v játrech byl významně snížil z 21,5±4% 14,7±2,9% a ve slezině oproti 33,3±1.5% na 11,4±3% v kontrolní a LC-léčených králíků, resp. Podobně bylo pozorováno snížené arteriální zbarvení RAM-11 pro makrofágy u králíků léčených LC 3 a 6 dní po poranění (obrázek 4).

redukce monocytů a makrofágů byla také detekována injekcí fluorescenčních liposomů (FL). Výrazné snížení fluorescenčního signálu bylo pozorováno v krevních monocytech (stejně jako snížený počet) a v játrech a slezině zvířat léčených LC (obrázek 5). FL byly detekovány v poraněných, ale ne v intaktních tepnách. FL podávaný současně s LC významně snížil fluorescenční signál v poškozené arteriální stěně (obrázek 5).

PCNA, IL-1β, a Matrix Metaloproteinázy-2

oblast pozitivně obarvených na PCNA na 6 dní po zranění byl výrazně snížila z 5,6±2,6% v kontrolních zvířat na 1,7±1,3% v LC léčených králíků (Obrázek 6, a a b). Neointima byla sotva pozorována v tomto časném okamžiku, kdy je proliferace SMC maximální.

Analýza IL-1β úrovní v arteriální tkáně po zranění ukázal, zvonek-formoval vzor vrcholit na 6 dní po zranění a návratu k bazální úrovně po 30 dnech (Obrázek 7a), a významný pokles IL-1β úrovně byl pozorován po 3 a 6 dnů v LC-léčených zvířat. U kontrolních zvířat byla transkripce IL-1β mRNA silnější 3. den než slabší exprese 1 den po poranění, ale obě byly významně sníženy LC léčbou (obrázek 7b). Hladiny IL-1β v játrech byly také sníženy po jedné injekci LC v den -1, sklon k bazálním hladinám po 30 dnech(údaje nejsou uvedeny).

Arteriální matrix metaloproteinázy (MMP-2) aktivita vzrostla po zranění, které vykazuje ve tvaru zvonu vzor vrcholit na 6 dní (292±46) a návratu k bazální úrovně, na 14 dnů (Obrázek 7c). LC významně zmírnila aktivitu MMP-2 a v den 6 to bylo pouze 52±17.

Diskuse

Tato studie ukazuje, poprvé, že inaktivace makrofágů tím, že systémové podání liposom-zapouzdřené klodronát inhibuje luminální ztráta balón po zranění v obou potkanů a zvýšenou hladinou cholesterolu králíky. Tyto výsledky potvrdit naši hypotézu, že makrofágy hrají klíčovou roli v patogenezi akcelerované arteriopathies. Pozorovaného zvýšení luminální oblasti bylo dosaženo hlavně snížením neointimální hyperplazie. Bylo také prokázáno mírné zvýšení expanzivní remodelace, ale jeho příspěvek k rozdílu v luminální oblasti byl minimální.

Klodronát patří do rodiny BPs, léků užívaných klinicky při poruchách souvisejících s kostí včetně osteoporózy. Být vysoce hydrofilní a negativně nabitý, volné BPs jsou téměř neschopné překročit buněčné membrány.7 absorpce BP osteoklasty resorbujícími kosti (pocházející jako makrofágy z krevních monocytů) nastává, když buňky pohltí kost potaženou lékem.7 Volný klodronát ani LC neinhibovaly proliferaci SMC nebo EC nebo neointimální tvorbu. Efektivní a selektivní endocytóza z klodronát v makrofázích je dosaženo tím, že zapouzdření klodronát v lipozomech.9,10,14 Po fagocytózy, lysozomální akce narušuje tukové dvojvrstvy, na lipozomech a zdarma klodronát se uvolní do buňky, což způsobuje nevratné funkční poškození a apoptózy.8,15

LC podání pravděpodobně přerušilo odpověď rané fáze na zranění, která je zprostředkována migrací makrofágů v reakci na expresi MCP-1.16 injekce LC před zraněním ostře vyčerpaný krevní monocyt (Obrázek 2) a počet makrofágů a aktivita v játrech, slezině a poraněné arteriální stěně (obrázky 3, 4 a 5). Snížení monocytů k dispozici v době úrazu snížení intimální hyperplazie, možná podobné účinky pozorované u spolujezdce krve monocyty IL-10.17 Blokování monocytů/makrofágů migraci do poškozené lodi z lumen a/nebo adventitia (Obrázek 5) brání účinky těchto buněk na SMC migrace a proliferace.

hladiny IL-1β a MMP-2 byly sníženy v poškozených arteriálních segmentech po LC léčbě. Tyto hlavní produkty aktivovaných makrofágů, vylučované po arteriálním poškození, přispívají k procesu neointimální proliferace.18-20 snížená proliferace SMC může také přispět ke snížení IL-1β A MMP-2.21 nicméně, protože LC neovlivňují SMC a ECs a nemají žádný účinek na fibroblasty, 9 makrofág je pravděpodobně primárním cílem LC. Inhibice intimální hyperplazie v krysím modelu, bez pěnové buňky v tepně, dále podporuje systémové deplece makrofágů jako mechanismus řízení snížena SMC šíření a neointimal formace. Celkově tento přechodný systémový imunomodulační a protizánětlivý účinek snížil migraci a proliferaci SMC a arteriální restenózu.

naše zjištění jsou souběžná s příznivými účinky pozorovanými po modulaci funkce makrofágů různými modalitami. Snížená tvorba neointimy po poranění byla dosažena u králíků blokádou Mac-122 a u myší s deficitem Mac-1.23 tak, v souladu s nedávnými zprávami, 9,17,22,23 zánětlivý proces hraje klíčovou roli v kaskádě formace neointima. Deplece makrofágů také snižuje hyperplazii žilních štěpů.24 bez Ohledu na jiná patologie pokud jde o spoušť, postižené cévy, základní deska v angioplastied tepny, složení stenotická tkáně, a doba trvání procesu, pozitivní vliv na žilní štěp model naznačuje, společná role makrofágů při stimulaci cévního intimální hyperplazie.

Důsledky a Omezení

Zdarma klodronát není pronikají buňky a má krátký poločas v systémové cirkulaci.6 Klodronát unikající z mrtvých makrofágů a liposomů se ve významné míře nehromadí v jiných tkáních než v kostech. Žádný efekt byl pozorován na somatický růst nebo na sérum obsah minerálních látek po LC léčbu, jako výsledek lipozomální formulace, stejně jako u většiny ostatních liposomy a částic, drug delivery systémů, byl v retikuloendoteliálního systému. Navíc dvě injekce 15 mg/kg volného klodronátu by neměly mít žádný účinek na normální kost.25

inaktivace makrofágů nese nebezpečí imunosuprese a infekce. Nicméně, stejně jako ve studiích na mike26 a potkanech s deficitem Mac-1, 24 nebyla v naší studii pozorována žádná zjevná infekce s přechodnou deplecí makrofágů. Monocyty v krvi se v této studii plně zotavily 6 dní po injekci a koncentrace IL-1β se vrátily na bazální hladiny. Jiní ukázali, že obnovení funkce makrofágů 4 až 6 dní po depleci vyvolané LC nevyvolává žádné dlouhodobé toxické účinky.6,14 klinické důsledky přechodné, částečné deplece jaterních a slezinných makrofágů systémovou LC by měly být dále zkoumány ve studiích na lidech.

velké množství zpráv o farmakologických pokusech o inhibici intimální hyperplazie u zvířat nebylo přeloženo do následné inhibice restenózy u lidí. Současná studie používá LC jako vyšetřovací nástroj k objasnění role zánětu při cévní opravě a možné hodnoty modulace VROZENÉ imunity při redukci postinjury intimální hyperplazie. Že přínos byl pozorován ve dvou zvířecích modelech, krysa a zvýšenou hladinou cholesterolu králík, s různorodých zranění a různé stupně zánětu, podporuje hlavní role monocytů a makrofágů v cévní opravy a zvyšuje prediktivní hodnota pro inhibici restenózy u lidí.

Makrofágů bohatých oblastech jsou převládající v aterosklerotických lézí u pacientů s nestabilní anginou pectoris a akutním infarktem myokardu,3 a makrofágy pravděpodobně zprostředkují prasknutí aterosklerotického plátu a náhlé akutní koronární syndromy.27 Další studie jsou oprávněné zkoumat, zda deplece makrofágů tím, lipozomální bisfosfonáty může svěřit strategie pro stabilizaci jiných zánětlivých zprostředkované vasculopathies a kardiomyopatie, včetně akutní koronární syndromy.

Na závěr, správa LC inhibována neointimal šíření po balónu zranění u potkanů a zvýšenou hladinou cholesterolu králík modely. Navrhovaný mechanismus je systémová selektivní, přechodná modulace aktivity monocytů / makrofágů. Makrofágy, i když relativně skromné v neointimální tkáni, hrají hlavní roli v procesu neointimální proliferace. Proto včasná modulace a inaktivace makrofágů po dobu 1 týdne po poranění významně snižují postangioplastiku arteriální zúžení později.

Poznámky pod čarou