Minimální Informace pro podávání Zpráv o Comet Assay (MIRCA): doporučení pro popis comet assay postupy a výsledky

MIRCA pokyny byly vytvořené členy hCOMET NÁKLADŮ Akce s cílem zlepšit analýzu a podávání zpráv o comet assay výsledky (http://www.hcomet.eu/). Autoři jsou experti na kometové testy s minimálně osmiletou zkušeností s těmito testy (15 autorů má >20 let relevantní zkušenosti). Použili jsme internetový dotazník k odběru názorů autorů ohledně důležitosti údajů o podávání zpráv (Tabulka 1; doplňující údaje). Každá informace byla klasifikována autory jako “nezbytná”, “žádoucí” nebo “ne důležitá” a pro klasifikaci byla použita prahová hodnota ≥75% shody. Pokud počet “základní informace” odpovědi nedosáhla prahu 75% shoda, ‘základní informace’ a ‘žádoucí, informace, odpovědi byly kombinované, a informace byla klasifikována jako žádoucí informace, jestli ≥75% autoři se shodli, že to byl buď “základní” nebo “žádoucí”. V tabulce 1 uvádíme vysvětlivky ke každému doporučení.

specifická doporučení MIRCA pro každý krok testu komety

krok 1A: Izolace buněk a přípravu jednobuněčné suspenze

Jako comet assay používá suspenze jednotlivých buněk, exempláře, které nejsou získány jako jednotlivé buňky musí být ošetřeny mechanicky nebo enzymaticky narušit upevnění buněk k extracelulární matrix, nebo k sobě navzájem. Homogenizace tkání mechanické narušení může samo o sobě způsobit poškození DNA, vzhledem k tomu, enzymatické trávení tkáně může vést k odstranění poškození DNA v důsledku činnosti endogenní DNA opravy enzymy, nebo zvýšení poškození DNA úrovně uvolněním nukleázami z buněk. Složení homogenizační pufr je “žádoucí” informace, zejména pokud jde o komponenty, které jsou nezbytné pro zachování integrity DNA (např. kyseliny ethylendiamintetraoctové)24,25. Popis postupu pro izolaci jednobuněčné suspenze, včetně homogenizace tkáně, je považováno za “žádoucí” informace v článcích.

vzorky krve se často používají ve studiích biomonitoringu u lidí. Protože krev představuje heterogenní populaci buněk, podrobné informace o buněčné populaci jsou v publikacích “nezbytné”. Text by měl přesně popsat, zda jsou vzorky plná krev (včetně červených krvinek), leukocyty, mononukleární krvinky nebo podskupina buněk (např. lymfocyty). To může být také užitečné, aby zahrnovala informace o postupu pro napíchnutí žíly, typ antikoagulační a následné metodu buněčné izolace (tj., odstřeďování a praní kroků) pro ty, opakování experimentu, tak to je klasifikován jako “žádoucí” informace. Informace o podmínkách skladování buněk nebo tkání, pokud jsou zamrazena, stejně jako zmrazení metody (např. snap zmrazení na suchý led nebo tekutý dusík, nebo pomalé zmrazení postup) a rozmrazování řízení, je považován za “základní” informace, jak tyto procesy mají prokazatelně vliv na bazální úrovni DNA migration26.

krok 1B: Příprava podkladu buňky pro in vitro opravy DNA assay

Žádné eukaryotní typ buňky mohou být použity jako podklad buňky pro in vitro opravy DNA testu, a buňka typ a hustota jsou “žádoucí” informace. Je “nezbytné” hlásit metodu a typ genotoxické sloučeniny použité k indukci lézí DNA v buňkách substrátu a následných podmínkách skladování buněk, zatímco celková úroveň lézí DNA, které lze detekovat v buňkách substrátu (např., počet míst citlivých na formamidopyrimidin DNA glykosylázy v buňkách léčených přípravkem Ro19-8022 plus light) se považuje pouze za “žádoucí” informaci.

Krok 1C: Test kontroly

V tomto článku, testu kontroly se vztahují na vzorky, které jsou zahrnuty v každém comet assay experiment; tyto jsou někdy označovány jako referenční standardy, interní kontroly nebo technické controls16,27. Test kontroly jsou obvykle kryokonzervované alikvoty z jedné šarže z buněk, které byly vystaveny vlákna DNA-lámání agent (např., ionizujícím zářením, peroxidem vodíku nebo methyl methansulfonátové), nebo léčba, která způsobuje konkrétní typ DNA léze (např. fotosenzibilizátor Ro19-8022 plus světlo, nebo bromičnanu draselného léčby, vyvolat oxidaci DNA). Existují různé kontrolní testy pro standardní alkalickou kometu a enzymově modifikovanou kometu. Sloučenina použitá pro test modifikovaný enzymem by neměla vytvářet zlomy řetězců DNA, protože tyto snižují dynamický rozsah míst citlivých na enzymy. V biomonitorovacích studiích, stejně jako cross-sekční, intervenční a klinických studií, neexponované buňky mohou být použity jako test kontroly. Je “nezbytné” vykazovat úrovně poškození v kontrolních testech a variaci testu (směrodatná odchylka) jak ve standardním, tak enzymem modifikovaném testu komety.

in vitro DNA repair assay používá interní experimentální kontroly, které se také používají při výpočtu opravné aktivity, spíše než kontroly testů jako takové. To je “základní” informace na úrovni DNA opravit řezy v nucleoids z (i) non-vystaveny substrátu buňky inkubovány s reakční pufr, k určení bazální úrovně poškození DNA v substrátu DNA (tj., pozadí, kontrola’); (ii) vystaveny buňky inkubovány s reakční pufr, odhalit úrovni nespecifické DNA zlomů nebo základním stránky vyplývající z léčby poškození agent (tj. léčba řízení’); (iii) non-vystaveny substrátu buňky inkubovány s proteinového extraktu ze vzorku, pro kontrolu nespecifické řez nebo štěpení činnosti (tj. specifičnost řízení’); a (iv) vystaven substrátu buňky inkubovány s lézí-specifický enzym, podobný test kontroly pro enzym-modifikovaný kometový test (tj. ‘inkubace reakce ovládání’).

Krok 1D: Negativní a pozitivní kontroly

V tomto článku, negativní a pozitivní kontroly se týkají experimentálních skupin, jak je popsáno v pokynech OECD (TG 489) pro kometovou analýzu in vivo na zvířecích tissues18. Negativní a pozitivní kontroly se tedy týkají celého experimentu. Pozitivní vliv se týká přímo nebo nepřímo působící genotoxické sloučeniny, která vytváří DNA zlomů nebo enzym-citlivých lokalit zjištěných s comet assay. Pro enzym-modifikovaný kometový test, není tam žádný seznam pozitivních kontrol k dispozici, které odpovídá sloučeniny OECD uvádí jako pozitivní kontroly pro alkalická comet assay (pro navození DNA zlomů) ve specifických tkáních zvířat. Kromě toho neexistuje pozitivní kontrola pro studie biomonitoringu u lidí, protože zdraví lidé nemohou být záměrně vystaveni genotoxickému činidlu. Pozitivní kontroly jsou již považovány za povinné v experimentech s buněčnou kulturou v genetické toxikologii a budou de facto “zásadní” informací v článcích využívajících kometový test. Ve studiích na zvířatech však pro praktické účely údaje komety o kontrolních testech (tj., vzorky uvedené ve výše uvedeném oddíle nazvaném “krok 1C, kontrolní testy”) jsou dostatečné, zatímco výsledky skutečných negativních a pozitivních kontrol jsou považovány pouze za “žádoucí” informace.

2. Krok: Vkládání buněk v agarózovém

comet assay byl původně vyvinut za použití tři vrstvy agarózy na sklíčko, se střední vrstva obsahující buňky. Horní vrstva agarózy však není nutná a některé postupy nepoužívají spodní vrstvu (např. Je “žádoucí” hlásit typ snímků a velikost (tj., plocha) gely, jako podíl buněk v blízkosti okraje gelu se zvyšuje, jak gel velikost klesá a DNA v nucleoids na okraji gelu mohou migrovat jinak, než že v nucleoids směrem do středu gel22. Konečná koncentrace agarózy (s buňkami v ní zabudovanými) je “nezbytná” pro hlášení, protože migrace DNA závisí na hustotě gelu.

Krok 3: lýza buněk

existuje několik postupů pro lýzu buněk v kometovém testu. Informace o složení roztoku lýzy jsou “nezbytné”. U některých typů buněk může být vyžadován další inkubační krok enzymu (např. s proteinázou K) a podrobnosti o inkubaci by měly být rovněž uvedeny jako “základní” informace. Některé zprávy naznačují, že doba rozpadu může mít vliv na stabilitu některých typů DNA lesions28,29,30, takže délka lýzy a teplota lyzačního roztoku jsou “žádoucí” informace.

krok 4A: Opravy enzymů zpracování v enzym-modifikovaný kometový test

Jako lytický roztok může inhibovat aktivitu opravy enzymu, je žádoucí stanovit, zda promytí bylo provedeno mezi lyzačního kroku a enzymové léčby (tj., složení promývacího pufru, množství výplachu a doba trvání). Je “nezbytné” předávat informace o zdroji opravných enzymů, protože bylo prokázáno, že enzymy od různých výrobců se liší jak svou aktivitou, tak svou specificitou vůči lézím nukleobázy16. Ve většině kometa studií, titrační křivky pokusy jsou prováděny k identifikaci optimálních podmínek pro enzym treatment31; nicméně, výsledky enzymu titrační křivky jsou hlášeny jen zřídka a jsou klasifikované zde jako “žádoucí” informace (odkaz na předchozí studie by mohla být místo toho), i když bychom to považovat za “základní”, aby se zpráva o trvání a teplota zpracování. Koncentrace enzymu aplikovaného na gel je “zásadní” informací; je vhodnější hlásit koncentraci v enzymatických jednotkách (U / ml), i když koncentrace proteinu (mg/ml) je také užitečná. Typ inkubační jednotku (např. inkubátor, slide příkop nebo 12-gel systém) a způsob inkubace jsou “žádoucí” informace. To by mělo být uvedeno, zda inkubace byla provedena (i) v enzymové lázni nebo s kapkou a krycí sklíčko na snímku, (ii) ve standardním 2-gel verze, 12-gel nebo více-no systém, nebo (iii) v zvlhčený box v inkubátoru, na topné desky, nebo ve vytápěné slide příkop.

krok 4B: Příprava extraktu a inkubace pro test opravy DNA in vitro

je “žádoucí” uvést počet buněk nebo hmotnost tkáně použité k přípravě proteinových extraktů, zatímco “nezbytné” je vykazovat konečnou koncentraci proteinu v buněčných nebo tkáňových extraktech přidaných do substrátové DNA. Složení extrakčního pufru (“žádoucí” informace) je méně zásadní než složení inkubačního pufru (“základní” informace), protože tento může ovlivnit úroveň pozadí migrace DNA. V souladu s informacemi pro enzymem modifikovaný test komety je “žádoucí” hlásit výsledky titračních experimentů nebo odkazovat na předchozí studie ze stejné laboratoře, kde byly provedeny. Objem extraktu přidaného do buněk substrátu vloženého do gelu je “žádoucí” informací. Je “nezbytné” hlásit dobu trvání a teplotu inkubační doby, protože ovlivňují počet opravných řezů. Pokud jde o test komety modifikovaný enzymem, způsob inkubace je “žádoucí” informací, která se má hlásit pro test opravy in vitro. Informace o totožnosti enzym používá se jako inkubační reakce ovládání (s uvedením množství DNA lézí v substrátu buněk) a složení pufru použitého pro pozadí úrovni oprav DNA řezy v neexponované substrátu buňky jsou “esenciální”, protože jsou klíčem k prokázání spolehlivosti opravy DNA řez činnosti.

Krok 5: Alkalické léčba

high-alkalické-pH roztoku narušuje vodíkové vazby, které drží DNA spolu a také převádí určité nucleobase lézí v DNA zlomů. Doba trvání alkalické úpravy tedy může ovlivnit úroveň migrace DNA v následné elektroforézě32, 33, 34. Specifické informace týkající se složení alkalického roztoku, pH, teplota a doba léčby jsou tedy “základní” informace.

Krok 6: Elektroforéza

nejdůležitější ovladače DNA migrace jsou doba trvání elektroforézy a elektrický potenciál (pokles napětí přes elektroforézy, nádrže, platformu), 35. To je “základní”, že složení elektroforetického pufru, síla elektroforéza (gradient napětí (V/cm) během elektroforézy, nádrže, platformu) a doba trvání elektroforézy jsou hlášeny. Vysoké teploty během elektroforézy může mít vliv na DNA migration36; tak, informace o teplotě elektroforéza řešení je “základní”, a to může být doprovázeno popisem kroků, aby udržel konstantní teplotu (např. chlazení platformy nebo cirkulaci pufru).

Krok 7: Neutralizace

tento krok zahrnuje odstranění přebytečného alkalického roztoku ze sklíček, aby se zajistilo účinné barvení. Je “žádoucí” popsat složení neutralizačního roztoku.

Krok 8: Barvení a vizualizace

DNA-vázající barviva mají rozdílné vazebné afinity k DNA, a proto mohou mít vliv na výpočet primární comet assay deskriptory v image analysis software differently36,37,38. Typ barviva je “základní” informace, zatímco koncentrace je “žádoucí” informace, stejně jako doba mezi barvením a vizualizací. Intenzita světla z různých typů mikroskopických lamp se liší. Kromě toho se liší v závislosti na věku lampy a době, kdy byla zapnuta během bodování komet. Neexistuje však žádný standardní postup pro měření intenzity světla a odpovídající korekci úrovně migrace DNA. Kromě toho se může zdát, že stejná kometa má různé úrovně migrace DNA při různých zvětšeních mikroskopu. Proto je “žádoucí” hlásit zvětšení mikroskopu použité pro bodování. Je “žádoucí” ukázat reprezentativní obrazy komet (např., kontrola s malou nebo žádnou migrací, mírná a rozsáhlá migrace DNA) spolu s hlášenými úrovněmi migrace DNA.

krok 9A: bodování a analýza dat

tento krok vyžaduje hlášení “podstatných” informací pro primární deskriptor testu komety (např.. %DNA v ocasu, délce ocasu, momentu ocasu nebo vizuálním skóre), počet analyzovaných komet na vzorek a způsob vyjádření celkové úrovně migrace DNA (např. medián nebo průměr skóre komety). Není důležité hlásit individuální výsledek každé komety v každém gelu; jsou kombinovány pro výpočet celkové úrovně poškození. Protože nelze vyloučit, že různé obrazové analýzy softwarové balíčky mohou mít různé způsoby, jak vypočítat primární comet assay prediktor, to je “základní” nahlásit použitý software (software název, výrobce, verze). Všechny základní deskriptory sdílet omezení, že je třeba mít odborné znalosti v comet assay pochopit, co znamenají, vzhledem k tomu, že pokud kalibrační křivka je vytvořena (pomocí ionizujícího záření, které indukuje přestávky na známé frekvence), výsledky mohou být převedeny na relativní léze frekvence ve srovnání s nezměněném nukleotidů nebo nucleobase páry; tyto údaje jsou jednoznačné a zprostředkovat informace, které všechny mohou vědci understand39. Postup pro získání kalibrační křivky, pomocí ionizujícího záření, a převést migrace DNA úrovní léze frekvence vzhledem k nezměněném nukleotidů nebo nucleobase dvojice byla hlášena previously40. Proto je “žádoucí” vykazovat výsledky jako hladiny lézí na 109 nezměněných nukleotidů nebo 106 párů nukleobáz.

krok 9B: Výpočet enzym-citlivých míst nebo čistý počet řezů v substrátu DNA pro in vitro opravy DNA assay

inkubace s DNA opravy enzymy, zvyšuje úroveň DNA migraci, jako i bazální úrovni DNA zlomů a enzym-specifické léze přispívají k celkovému počtu DNA zlomů. Jako migrace DNA, která je přičítána bazální úroveň poškození DNA a enzym-specifické léze mohou pocházet z různých mechanismů, genotoxicity, je nedostatečný, aby se zprávy pouze celková úroveň poškození DNA po enzymatické ošetření. Místo toho je “nezbytné” hlásit genotoxicitu jako místa citlivá na enzymy, kde byla bazální úroveň migrace DNA odečtena od migrace DNA ve sklíčkách ošetřených enzymy.

Jako in vitro opravy DNA test používá stejný substrát buněk všechny buňky nebo tkáně vzorky extraktu, je zbytečné mít souběžné pozadí a léčba kontroly pro každý vzorek ve stejném experimentu (tj. test run). Může existovat více než jeden substrát (např., při analýze jak bazické, tak nukleotidové excizní opravné aktivity), a proto jsou zapotřebí samostatné kontroly pro každý typ testu opravy DNA. Je “nezbytné” hlásit čisté řezy opravným extraktem v DNA substrátu.

krok 9C: Statistická analýza výsledků

statistické analýzy jsou “nezbytné”. Typ statistické analýzy závisí na návrhu studie a sleduje obecné předpoklady ve statistickém testování v genetické toxikologii a biomonitoring41,42.