Infekční nekrotická hepatitida způsobená Clostridiumnovyi typu B u koně: kazuistika a přehled theliterature | Jiotower

Infekční nekrotická hepatitida (INH) je způsobena Clostridium novyitype B. onemocnění obvykle postihuje ovce, ve které je také odkazoval se na jako”černá nemoc” vzhledem k tomu, tmavé zbarvení podkožní tkáně způsobené byintense žilní přetížení viděl v jatečně upravených těl zvířat umírá na toto onemocnění.6 ačkoli se předpokládá, že se INH vyskytuje také u jiných druhů, včetně skotu, koz a koní, jsou k dispozici velmi omezené informace o tomto onemocnění u jiných zvířat než ovcí.2,3,19,15 navíc,vzhledem ke své přísné anaerobní povaze, izolace a identifikace C. novyi typu B je zřídka dosaženo.15 z tohoto důvodu jsou zprávy o INH obvykle omezeny na předpokládanédiagnostiku založenou na histopatologii, fluorescenčním testu protilátek (FAT) a / orimunohistochemii (IHC). Typ C. novyi je zřídkaurčeno. Zde uvádíme potvrzený případ nákazy koní způsobený C.novyi typu B, a také přezkoumat literaturu o nemoci.

14-y-starý, 511-kg bay Quarter Horse valach byl předložen San Bernardinobranch Kalifornie Zdraví Zvířat a Bezpečnost Potravin Laboratorní Systém forpostmortem vyšetření a diagnostické testy. Zvíře mělo 3-d anamnézu progresivních neurologických příznaků, rektální teplotu 38,8-40,5°C a bylo před smrtí neúspěšně léčeno nesteroidními protizánětlivými léky.Byla provedena úplná pitva ~6 hodin po smrti.

při pitvě byl kůň v dobrém nutričním stavu, s dostatečným množstvím tuku a v mírném stavu posmrtného rozkladu. Byla žlutázbarvení skléry, podkožní a tukové tkáně a artikulárníkartilagy. Multifokální ekchymotická–suffusive krvácení byly přítomny v mostmuscles, blány střevního traktu, okruží, slezina, pohrudnice, a inpapillary svaly srdce. Žilní krev byla tmavě červeno-černá. Na pericardialsac byl nafouklý s velkým množstvím serosanguineous tekutiny, a tam bylo ~5L podobné tekutiny obsahující hojné fibrinu pramenů v břišní dutině.Játra byla výrazně rozšířené a zaoblené hrany, levý lalok byl pevný,tmavě červené až černé, a měl četné subkapsulární a hluboké parenchymu plynu bubblesand hojný fibrin přes kapsle (Obr. 1A). Na řezu tohoto laloku byl průměr ~15 cm, bledá oblast obklopená tenkým hemoragickým okrajem (obr. 1B). Meningespokrývající mozek a míchu byly difúzně přetížené a v mozkové kůře došlo k epetechiálním krvácením. Ve zbytku jatečně upraveného těla nebyly pozorovány žádné další významné hrubosti.

Vzorky z mozku, plic, srdce, bránice, jater, sleziny, žaludku, střeva,slinivky břišní, nadledvin žlázy, okruží, ledvin a močového měchýře byly shromážděny andfixed v 10% pufrovaném formaldehydu (pH 7,2) po dobu 48 h a zpracované běžně na výrobu 4 µm silné hematoxylin a eosin (H&E)-barevné části. Sekce jater a ledvin byly také obarveny skvrnami Gram a Okajima.

vzorky jater byly odebrány asepticky a podrobeny aerobní a anaerobikultuře na 5% ovčích agarových destičkách po dobu 48 hodin. PCR byla provedena pro virus West Nile (WNV)na vzorcích centrálního nervového systému a pro koňský herpesvirus 1 (EHV-1) na nosním výtěru. Na jaterních vzorcích byla provedena obrazovka těžkých kovů včetně olova, manganu, železa, rtuti,arsenu, molybdenu, zinku, mědi a kadmia.Mozkomíšní mok byl testován na protilátky proti Sarcocystisneurona za použití nepřímého tuku. Jaterní skvrny byly zpracovány FATfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum,Clostridium sordelli, a C. novyi usingcommercial konjugáty (VMRD, Pullman, WA). Navíc, formalin-fixed,paraffin-embedded části jater byly zpracovány nepřímou immunoperoxidasetechnique pro C. novyi, pomocí komerční soupravy (RTU VECTASTAINElite ABC systému, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogenní peroxidázaaktivita byla uhasena 3% roztokem peroxidu vodíku, následovaným pepsinterapií pro získání antigenu. Vzorky pak byly inkubovány s BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) zablokovat nespecifická vazba, beforeincubation s kozí anti–C. novyi polyklonální protilátky (VMRD) at37°C po dobu 60 min. Pro vizualizaci byl použit vektor NovaRED chromogen (VectorLaboratories). Části jater inkubovány s normální kozí sérum místo všeobecné protilátky byly použity jako negativní kontrola. Játra z krávy, ve kteréc. novyi byla identifikována kulturou a PCR byla použita jako pozitivní kontrola.

vzorky jater byly zpracovány pro extrakci DNA (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen, Hilden, Německo) podle pokynů výrobce. Extrahované DNA wasused jako šablonu pro multiplex PCR pro amplifikaci úseků flagellingenes (fliC), C. septicum, C. novyi typ A, C. novyi typ B, C. chauvoei, a Clostridium haemolyticum, u již dříve.17 navíc jsme vyvinuli konvenční PCR pro zesílení segmentu theC. novyi typ B alfa toxin (TcnA) gen(GenBank přistoupení JENV01000127.1), hlavní faktor virulence z thismicroorganism. Následující oligonukleotidovou sekvencí byly navrženy:5′-TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′ (CNtBaF) a 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3′ (CNtBaR),které zesilují ~342-bp fragment DNA cílového genu. Konvenční PCR bylaprovedeno v celkovém objemu 25 µL obsahujícím 5 µL extrahované DNA, 0.25 µL každého primeru (10 µM), 7 µL nuclease-free voda, a 12,5 µL PCR Master Mix(2X, Promega, Madison, WI), obsahující Taq DNA polymeráza (pH 8,5, 50 U/mL), dntp(400 µM) a MgCl2 (3 mM). Na termocykleru profily byly následující:94°C po dobu 5 min, 30 cyklů 94°C 1 min, 55°C po dobu 1 min a 72°C po dobu 1,5 min,následuje závěrečné prodloužení kroku při teplotě 72°C 7 min. Vzorky byly uchovávány při teplotě 4°Cuntil PCR reakce byly vizualizovány pod uv světlem v ethidiumbromide (Amresco, Solon, OH)-barveny 1% agarózovém gelu (Agarózového SFR, Amresco). DNAextracted od C. novyi typ B (ATCC 25758), C. novyi typ A, C. septicum, C. chauvoei, C. haemolyticum kultury byly usedas pozitivní kontroly. Voda místo DNA byla použita v negativní kontrolereakce.

Mikroskopicky, kapsle jater byla pokryta hojný fibrin smíchané s celldebris, a tam byly subkapsulární a hluboké parenchymu emphysematosa puchýře ofvarious velikostí. Nejvíce zarážející bylo zjištění, multifokální, aby focally extensivecoagulative nekróza, obklopena ráfku velkého počtu životaschopných anddegenerate neutrofilů, krvácení, fibrin, buněčné zbytky, a velké agregáty ofgram-pozitivní bakteriální tyče, z nichž některé měly subterminal spóry (Obr. 1C, D).D). V interveningparenchyma a v méně postižených jater, tam byl žluči stáze, multifocalhemorrhages, a segmentové–difuzní fibrinoid nekróza cév, mnozí kterého také obsaženy fibrinové tromby. Renální tubulární epitel měl mildcytoplazmatickou vakuolizaci a v lumenof renálních tubulech byly přítomny proteinové a granulární odlitky. Odlitky byly pozitivně obarveny skvrnou Okajima (obr. 1E). V mozku,tam byl difúzní přetížení, multifokální a náhodně rozptýlené perivascularhemorrhages, a mírné-výrazné rozšíření Virchow–Robin prostor withacidophilic edém. Viscerální peritoneum bylo pokryto hojným fibrinem s velkým počtem životaschopných a degenerovaných neutrofilů; většina peritoneálních krevních cév byla přetížena a / nebo obsahovala fibrinové tromby. Několik malých tepen ažíly v kůře a dřeně nadledvin měly také fibrinové tromby. Thespleen měl vaskulární kongesci a multifokální parenchymální a kapsulární krvácení. Plíce byly difuzně přetížené a měly multifokální krvácení a edém, kromě několika krevních cév obsahujících fibrinové tromby. Bylo pozorováno multiplesubendokardiální, subepikardiální a subpleurální krvácení.

velká většina intralezionálních grampozitivních tyčinek pozorovaných v játrech byla pozitivní na C. novyi IHC (obr. 1F). Tuk byl pozitivní na C.novyi, ale negativní pro ostatní testované klostridiální druhy. Jaterní vzorky byly pozitivní na flica tcna genů c. novyi typu B a negativní na fliC genů ostatních testovaných klostridií (obr. 2). Vzorky mozkomíšního moku byly negativní na test imunofluorescenční protilátky s. neurona. PCR pro WNV a EHV-1 bylnegativní. Aerobní nebo anaerobní kulturou nebylo dosaženo významného růstu bakterií. Obrazovka těžkých kovů odhalila zvýšenou koncentraci železa ve vzorcích jater (1 500 ppm; referenční interval: 100-300 ppm).

provedli jsme předpokládanou diagnózu INH na základě hrubých a mikroskopických změn, spolu s výsledky tuku a IHC pro C.novyi. Diagnóza INH produkovaná C. novyi typu B byla potvrzena detekcí PCR genů fliC a TcnA tohoto mikroorganismu. Pokud je nám známo, bylo hlášeno pouze 6 případů podezření na IHN. dříve u koní. Tři případy se vyskytly v Austrálii,8,9,11 a jeden každý v Nový Zéland,23 Skotsko,19 a Spojených Státech (Montana).16 V těch případech, předpokládaná diagnóza byla založena na hrubé a microscopiclesions spolu s detekci C. novyi TUKU,9,16,19 IHC,23 a/nebo kultury.9,19 typ C. novyiinverged však nebyl v žádném z těchto případů stanoven.

C. novyi je grampozitivní, anaerobní bacil tvořící spory, který se běžně vyskytuje v půdě a stolici zvířat.15 je klasifikován do typů A, B A C na základě rozsahu produkovaných toxinů.4C. novyi typ A produkuje hlavně smrtící, edém vyvolávající alphatoxin (TcnA), a non-smrtící fosfolipázy, gama toxin; tato bakterie isassociated s plyn gangréna člověka a zvířat, obvykle společně s dalšími klostridií. C. novyi typ B také vyrábí TcnA, kromě na nekrotizující a hemolytická beta toxin, ačkoli bývalý je považován za nejdůležitějšími virulence faktor pro patogenezi INH. C. novyi typ C je považován za netoxický anepatogenní.13,15 C. haemolyticum bylo dříve známé jako C. novyitype D, a to je ještě odkazoval se na toto jméno některými autory; proto, wealso diskutovat o tomto mikroorganismu zde. C. haemolyticum alsoproduces beta toxin, ale v mnohem větším množství, než je C. novyitype B; tento toxin je považován za hlavní faktor virulence tohoto mikroorganismu,a to je zodpovědný za bacilární hemoglobinurie (BH), onemocnění affectingmainly dobytek, který je klinicky a patologicky velmi podobné INH.11,10,14

spory C. novyi jsou vysoce odolné vůči environmentalconditions a vzhledem k tomu, že spory se běžně nachází v půdě, pasoucí se animalsmay spolknout často.6,19 i když není plně prokázáno, současné dogma je takové,že po požití, spóry C. novyi typ B jsou absorbovány ze střeva a dostat se do jater prostřednictvím portální cirkulace, po kterém oni arespread do dalších orgánů. Spóry jsou pohlcených a zůstávají latentní v Kupffercells jater, a v makrofázích sleziny a kostní dřeně.2,6 OBYV hascommonly byl považován za protějšek BH, protože obě onemocnění arebelieved nastat po poranění jater, což způsobuje nekrózu a associatedanaerobic podmínky, které jsou nutné pro klíčení latentní spory a deformací toxinů.14 Migraci nezralých forem Fasciola hepatica prostřednictvím jater je považován za nejdůležitější predispoziční faktor pro obě BH a INHin přežvýkavců, a obě nemoci jsou častější v oblastech s vysokou prevalencí fasciolóza.1 OBYV přežvýkavců byla také spojena s Cysticercustenuicollis a jiné parazity, včetně Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum, andThysanosoma actinoides,2,6,15,21 i když úlohu těchto parazitů v patogeneze onemocnění nebyla prokázána.Jakékoli poškození jater vedoucí ke vzniku anaerobních stavů však může být apredisponujícím faktorem INH. Patří mezi ně, ale nejsou omezeny na, játraabscesy, biopsie, změny tuků, telangiektázie a toxické látky. Jakmile je TcnA produkována a uvolňována vegetativními formami C. novyi typ B,jeho monoglycosyl transferázy činnost inaktivuje několik guanosine5′-trifosfát (GTP)-vazebné proteiny v buňkách hostitele, což inalteration a přerozdělení aktin cytoskeletu.3 TcnA také narušuje systém vimentinu a tubulinu.7,18 Třeba zdají být více dramatické v kapilární endotel, což vede k thewidespread extravazaci tekutiny vidět v INH15 a pravděpodobně multisystémové trombózy pozorovány u koně ourreport. U ovcí je vysoce akutní povaha onemocnění detekceklinické příznaky obtížné, přičemž zvířata jsou obvykle nalezena mrtvá. V případech, kdy znameníjsou pozorovány, jsou nespecifické a zahrnují slabost, letargii, anorexii,hypertermii, tachypnoe, hyperpnoe a nakonec lež. Klinickopatologickézměny mohou zahrnovat neutrofilii s levým posunem, azotemii, metabolickou acidózu a zvýšené aktivity jaterních a svalových enzymů.15,19

Vzhledem k tomu, že pouze 6 případů podezřelých INH byly popsány dříve v koních,k dispozici epidemiologické, klinické a patologické informace jsou mizivé. Na základě tohoto omezeného počtu případů neexistuje zjevná predispozice pohlaví nebo plemene v případech koňovitých a mohou být postižena jak mladá, tak dospělá zvířata. Klinický průběh je obvykle delší u koní než u přežvýkavců, trvá 12-72 h a výsledek byl vždy fatální. Klinické příznaky se liší od mírné-k-severedepression a neochota k pohybu, neurologické příznaky, včetně ataxie a headtilt, hyperemická a/nebo ikterické sliznice a oční skléry, bolest břicha,a poloze.20,23 V jednom případě, ve kterém byla provedena abdominocentéza, bylo dosaženo zvýšeného množství zakalené tekutiny se zvýšenou koncentrací bílkovin aspecifická gravitace.9

Clinicopathologic profily koní s INH jsou vysoce variabilní, a oni mayrepresent různých fázích toxemia a poškození jater. Tyto změny obsahovat neutrofilie s posunem doleva, zvýšené hladiny jaterních enzymů,trombocytopenie, hyperfibrinogenemia, hyperbilirubinémie, a decreasedconcentration elektrolytů.9,16,19 navíc, zvýšenéaktivovaný parciální tromboplastin, protrombin a trombinové časy byly hlášeny.23 Tyto změny, v kombinaci s kapilární microthrombi pozorovat, aresuggestive diseminované intravaskulární koagulace, což je proces, pravděpodobně occurduring průběhu toxemia a hemolýza u velkých zvířat.22,23 výsledná spotřeba koagulačních faktorů, jejich snížená syntéza kvůlihepatální selhání a synergický účinek TcnA na vaskulární endotel jsoupředpokladně zodpovědný za rozšířené krvácení pozorované v případechinh.

ačkoli ikterus není u přežvýkavců popsán, koně mohou někdy vykazovat tento znak spojený s INH.19,23 ikterus se zdá být spojen se závažnostípoškození jater a do jisté míry s hemolýzou, jako v našem případě, ve kterémhemoglobin byl vizualizován v renálních tubulech okajimovou skvrnou. Kůň v naší studii měl mírně zvýšenou koncentraci železa v játrech, což svědčí o ahemolytickém procesu.5 Tato úroveň železa v játrech, je však běžné najít v horsesdying z různých příčin, a to je často považován za vedlejší findingassociated s přetížením a posmrtné autolýze (autorů unpublishedobservation).

i když to může být předpokládal, že koně jsou náchylnější než jiné speciesto akce hemolytická beta toxin produkovaný C. novyitype B, hemoglobinuric změny nebyly popsány v podezřelých případech ofINH.16,23 ve srovnání s C. haemolyticum,C. novyi typ B produkuje nižší hladiny beta toxinu;15 proto je jeho příspěvek k patogenezi INH předpokládá beminor, což způsobuje určitý stupeň hemolýzy u koní, ale ne natolik, aby inducesignificant hemoglobinurie-související změny. Kromě toho žádný z předchozích případů nevyloučil roli C. haemolyticum jako původce nákazy, takže z těchto případů nelze vyvodit konečné závěry. C. haemolyticum bylo zapojeno do případu septické peritonitidy Ina mare identifikací pomocí MALDI-TOF; v tomto konkrétním případě se však o identifikaci PCR nebo toxinu nepokusilo.11

predisponující faktor pro INH u koní vždycky nebyla stanovena, přestože jaterní migrace z F. hepatica a související motolic, stejně jako členové Strongylidae rodiny, mají beensuggested.9,12,19 Navíc, léčba anthelminthic před theonset klinických příznaků bylo navrženo jako potenciální spouštěč thedisease,9,16,23 pravděpodobně tím, že způsobují určitý stupeň jaterní necrosisassociated s destrukcí migrujících parazitů. Nicméně, žádné vědeckénení k dispozici důkaz, který by podpořil tuto hypotézu. Bohužel není známopředisponující faktory byly stanoveny v našem případě.

Jako v našem případě, většina předchozích zprávách popsal jeden (více v jednom case19) zaměření nekrózy postihující játra, důsledně se nachází v leftlobe. To kontrastuje s INH ovcí, ve kterých jsou náhodně distribuovány, malénekrotické ložiska jsou častější.6,15 důvod pro totovariace v distribuci není známa. Je možné, že převaha oflesions na levém laloku souvisí s tzv. portál streaming, což odpovídá pro diferenciální průtok portální krve do určité laloky theliver. Protože C. novyi je pravděpodobně absorbován z smallintestine, a krev z orgánů vyplývá portál streaming na leftlobe, to může vést v tomto laloku jsou převážně ovlivněny.6 absence změn spojených s jaterní encefalopatií (např.6 může naznačovat, že neurologické příznaky v tomto a předchozích případech bylynásledkem krvácení, kongesce a perivaskulárního edému zaznamenaného v mozku, souvisejícího s toxemií a působením TcnA na kapilární endotel.

INH by měl být v seznamu diferenciálních diagnóz koní s neurologickýmklinické příznaky, toxemie, akutní selhání jater a peritonitida. Přestože léčba vysokými dávkami penicilinu a tetracyklinů může být účinná protic. novyi, pokročilá produkce toxinů obvykle výsledkyve špatné prognóze.19 V oblastech, kde nemoc je jednoznačně spojena s jaterní flukesand/nebo jiné parazity, snižuje parazitní zatížení a omezení přístupu ofanimals na špatně odvodněné pastviny může být pokus jako preventivní opatření.15

Vzhledem k tomu, že několik klostridií onemocnění se předpokládá, že jsou spojeny s acceleratedpostmortem rozkladu, důležitým aspektem pro správné diagnózy ofINH je potřeba pro rychlé vyhodnocení a uchování tkání po deathof zvíře.6,23 klinická anamnéza, rutinní pitva, histopatologie a imunostaining C. novyi v jaterních lézích jsou nezbytnéposkytnout předpokládanou diagnózu INH. Protože izolace není alwayssuccessful, s ohledem na striktní anaerobní požadavky mikroorganismů,molekulární identifikaci pomocí PCR je cenným nástrojem poskytnout etiologicdiagnosis, a pro odlišení C. novyi typ B od otherclostridial patogeny.