Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutace blok non-CG metylace a umlčení endogenního genu, | Jiotower

Výsledky a Diskuse

identifikovat faktory, které řídí metylace a umlčování WS PAI geny, izolovali jsme mutantní varianta WS, pai1C251Y, ve kterém umlčování metylovaný tričko PAI2 genu mohou být zobrazeny podle intenzity modré fluorescenční rostlin fenotyp pod ultra-violet (UV) světlo (Bartee a Bender, 2001). V kmeni pai1C251Y jsou jedinými potenciálními zdroji aktivity enzymu PAI Gen PAI1, který je ochromen mutací missense, a Gen PAI2, který je umlčen. Protože tento PAI nedostatek, napětí se hromadí fluorescenční tryptofan cesta meziproduktů, stejně jako zobrazení žluto-zelený list pigmentace, snížené velikosti, zvýšená bushiness, a snížená plodnost. Mutace druhého místa, které zmírňují tlumení PAI2, však potlačují fenotypy s deficitem PAI (Bartee and Bender 2001). Proto jsme mutagenizovali kmen pai1C251Y a prověřili sazenice s potlačenými slabými fluorescenčními fenotypy. Jako sekundární obrazovka jsme testovali methylaci PAI analýzou Southern blot s restrikčními enzymy citlivými na methylaci. Konkrétně jsme testovány metylace s charakterizováno jako endonukleázy HpaII a MspI, které rozpoznávají sekvenci 5′-CCGG-3′. HpaII je citlivý na methylaci jak vnitřních (CG), tak vnějších (CNG) cytosinů, zatímco MspI je citlivý pouze na methylaci vnějších cytosinů. Tyto enzymy se štěpí jednou v každém lokusu ws PAI a odhalují hustotu i vzorec methylace pro každý gen (Bender a Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist a kol. 1999).

z této screeningové strategie jsme izolovali 11 ztrátových alel v genu CMT3 (viz níže a materiály a metody). Na cmt3 mutanti v pai1C251Y pozadí, zobrazí se silně sníženou fluorescence na začátku sazenice rozvoj a částečně snížena fluorescence v dospělých rostlin, s větší velikost, snížená bushiness, a zvýšení plodnosti (Obr. (Obr.1).1). Tyto střední fluorescenční izoláty cmt3 se nevrátily k nefluorescenci, což je diagnostika ztráty reziduální methylace PAI2 (Bender a Fink 1995), při detekovatelné frekvenci. Jsou zobrazeny částečně zvýšené štěpení s HpaII a silně zvýšené štěpení s MspI pro PAI geny vzhledem k rodičovské pai1C251Y (Obr. (Obr.2A).2A). Vzorec štěpení naznačoval, že mutanty cmt3 byly nejvíce ovlivněny udržováním methylace CNG genů PAI. K určení, zda cmt3 mutanti také vliv metylace vysoce opakované genomické sekvence, jsme reprobed na HpaII/MspI Southern blot se sondou na 180-bp centromera-spojené opakovat (CEN) sekvence (Vongs et al. 1993). Tato sonda odhalila malý účinek na štěpení HpaII, ale zvýšila štěpení MspI, v souladu se vzorem pozorovaným u genů PAI (obr. (Obr.2B).2B). Podobný vzorec zvýšeného štěpení MspI byl také pozorován při opakované rDNA(údaje nejsou zobrazeny). Všech 11 testovaných alel cmt3 mělo v těchto testech identické methylační vzorce. Navíc, když byly alely cmt3 odděleny od alely pai1C251Y do pozadí ws divokého typu, také v těchto testech zobrazovaly identické methylační vzorce (obr. (Obr.2).2). Pai a CEN methylační vzory byly odlišné od vzorů indukovaných charakterizovanými mutacemi s deficitem methylace ddm1 a met1 (obr. (Obr.2; 2; Bartee and Bender 2001).

přesněji určit, metylace vzory v cmt3 mutant pozadí, provedli jsme genomové sekvenování metylace vzory v PAI1 a PAI2 pořadatel regionech zástupce cmt3 alely pomocí hydrogensiřičitan sodný mutageneze (Frommer et al. 1992). Tato analýza odhalila, že většina methylovaných cytosinů (87% v PAI1 a 70% v PAI2) se vyskytla u reziduí CG (obr. (Obr.3; 3; Tabulka Table1).1). Ve srovnání s promotorem ws pai1 divokého typu (Luff et al . 1999; Tabulky Tabulka1),1), CG metylace byla snížena 34%, CNG metylace byla odstraněna, a asymetrické metylace byla snížena 93%; v PAI2 promotér, CG metylace byla snížena o 8%, CNG metylace byla snížena 92%, a non-CG metylace byla snížena o 75%. Ztráta funkce CMT3 má tedy silný vliv na udržování CNG a asymetrické methylace a slabší vliv na udržování methylace CG. Tyto výsledky jsou v souladu se zprávami, že Arabidopsis CMT3 a kukuřice ZMET2 jsou důležité pro udržení methylace CNG na různých genomových místech (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), ale dále ukazují, že CMT3 je také důležitý pro udržení asymetrické methylace pro geny PAI. Tento výsledek znamená, že CMT3 přímo řídí symetrickou i asymetrickou methylaci, nebo že snížení symetrické methylace v pozadí mutantů cmt3 způsobuje sníženou asymetrickou methylaci jako sekundární důsledek. Protože metylovaných sekvencí v promotor a první exon z PAI2 reporter gene (∼370 bp) obsahují pouze 16 rozptýlené CG motivy, ztráta non-CG metylace výrazně hypomethylates tomto regionu genu (Obr. (Obr.3), 3), účtování zvýšené exprese PAI2 v supresorovém mutantu.

Na cmt3 mutant locus v pai1C251Y cmt3 tlumič izolátů byla mapována kříže s polymorfní kmen Nd-0, která má podobné uspořádání hustě methylovaných PAI geny, jak bylo zjištěno v WS (Melquist et al. 1999). Generace F2 se slabě fluorescenční fenotypy diagnostické homozygotnosti pro oba pai1C251Y a cmt3 byly identifikovány pomocí vizuální kontroly pod UV světlem a potvrzen MspI Southern blot pro silné PAI štěpení podobné té, která je pozorována v rodičovské tlumič izolátů. Mapovací populace rostlin F2, která splňovala tato kritéria, byla poté použita ke skórování genomických lokusů spojených s potlačeným fenotypem. Analýza mapování odhalila vazbu na jeden lokus na spodním rameni chromozomu 1. Protože CMT3 předpokládaný Gen cytosin methyltransferázy mapuje tento lokus, zaměřili jsme se na tento gen jako na kandidáta. V každé mapovací populaci jsme našli úplnou vazbu na polymorfní marker, který leží do 100 kb genu CMT3. Potvrdit, že CMT3 gen byl ve skutečnosti na místě metylace supresorové mutace, jsme klonován a sekvenován gen od 11 mutant izolátů. Sekvenování odhalilo jedinou změnu báze v kódovací sekvenci CMT3 v každém izolátu. Tři mutantní alely ovlivněné absolutně konzervované aminokyseliny v methyltransferázy katalytické domény, včetně zástupce cmt3G456D alela používá pro bisulfite sequencing. Předpokládalo se, že další alela předčasně ukončí protein. Dvě alely vytvořily spojovací mutace. Zbývajících pět alel postižené aminokyselin mezi methyltransferázy motiv IV a C konci proteinu, které jsou vysoce konzervované mezi CMT genů (Obr. (Obr.4).4).

dále potvrzují, že CMT3 gen byl mutací lokusu, jsme změnili pai1C251Y cmt3 izolátů s wild-type WS genomu klon CMT3 gen. Sazenice transformantů byly silně fluorescenční, podobně jako u kmene pai1C251Y (obr. (Obr.1).1). Transformační linie testované analýzou Southern blot v generaci T2 ukázaly remethylaci genu PAI2 na úrovně pozorované v původním kmeni pai1C251Y (údaje nejsou zobrazeny). Klonovaný Gen CMT3 by tedy mohl doplňovat mutantní methylační defekty. Jako kontrola byl reprezentativní mutant pai1c251y cmt3G456D také transformován genomickým klonem ws divokého typu genu CMT2. Sazenice TRANSFORMANTŮ CMT2 byly slabě fluorescenční, podobně jako u netransformovaného rodičovského kmene (obr. (Obr.1), 1) a nevykazovala detekovatelnou remethylaci PAI2. Tato analýza ukazuje, že CMT2 nemůže nahradit funkci CMT3. V tomto ohledu je zajímavé poznamenat, že CMT2 se liší od CMT3 především ve své N-koncové sekvenci (obr. (Obr.44).

Dříve vyznačuje metylace-nedostatečné Arabidopsis kmenů s vadami buď SWI2/SNF2 chromatin remodeling factor-related gene DDM1 (Jeddeloh et al. 1999) nebo gen met1 cytosin methyltransferázy související s Dnmt1 vykazuje progresivní vývojové abnormality (Finnegan et al . 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Naše předběžná analýza šesti generací inbredních pai1C251Y cmt3 a dvou generací inbredních kmenů cmt3 neodhalila žádnou zjevnou segregaci morfologických změn. Tento rozdíl mezi cmt3 a jinými mutanty s deficitem methylace pravděpodobně odráží skutečnost, že methylace CG je zachována ve vyšším stupni v cmt3 než v ddm1 nebo met1 (obr. (Obr.2; 2; Bartee and Bender 2001). Protože mnoho endogenních methylovaných míst v genomu Arabidopsis, jako jsou opakování CEN (obr. (Obr.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001) a promotor homeo-doménového genu FWA (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), nesou primárně methylaci CG, nelze očekávat, že mutace cmt3 silně ovlivní tato lokusy. Místo toho CMT3 s největší pravděpodobností působí jako posilující metyláza, která přidává další vrstvu methylace do konkrétních genomových oblastí, jako jsou geny PAI, ve kterých zvýšená hustota methylace vede ke zvýšenému umlčení. Konkrétní model je, že bazální vrstva CG metylace poskytována další funkce, jako je MET1 by mohl sloužit jako vodítko pro CMT3, která by pak zdobí bazální vrstvy s extra CG a non-CG metylace. CMT3 nábor do cílových regionech by mohlo zahrnovat chromatin protein interakcí s chromodomain motiv (Henikoff a Comai 1998), spolu s interakce zprostředkované unikátní N-terminální sekvence.

protože houby jako Neurospora crassa a Ascobolus immersus mohou udržovat methylaci bez CG (Selker et al . 1993; Goyon a kol. 1994), tyto organismy mohou kódovat CMT geny. Naopak, protože zvířata, jako jsou lidé a myši, postrádají methylaci bez CG, předpokládá se, že těmto organismům chybí geny CMT, jak je tomu v případě analýz současných sekvenčních databází. Zjevný nedostatek METYLÁZ podobných CMT ve zvířecích genomech (Finnegan a Kovac 2000) naznačuje, že zvířata vyvinula alternativní mechanismy pro posílení stavů chromatinu.