Protilátky zaměření claudin-1 jako potenciální kolorektálního karcinomu terapie

CRC vzorky

Pro profilování genové exprese, jsme vybrali 143 nádoru vzorky ze 143 pacientů zahrnutých do tří kohort: prospektivní single-center studie REGP (19 pacientů) (GSE62322) , retrospektivní multicentrické studie COSIVAL (68 pacientů) a prospektivní multicentrické studie BIOCOLON (56 pacientů) (GSE62080 a GSE72970) . Pro tyto tři studie, Zařazení kritéria: histologicky prokázáno, adenokarcinom tlustého střeva, pokročilé a bidimensionally měřitelné nádoru (stadium IV), věk mezi 18 a 75 let, a Světová Zdravotnická Organizace (WHO) performance status ≤2. Před jakoukoli léčbou podstoupili všichni pacienti operaci pro resekci primárního nádoru nebo endoskopickou biopsii.

pro analýzu western blot bylo použito 13 dalších vzorků nádorů z prospektivní studie s jedním centrem REGP, ale nebyly zahrnuty do 143 vzorků.

Pro imunohistochemie analýzu, vzorky tkáně z 52 dalších pacientů s CRC byly dodatečně vybraných z Institutu pro Výzkum Rakoviny z Montpellier patologie soubory pouze tehdy, když normální sliznice, adenom a adenokarcinom vzorky byly k dispozici pro stejného pacienta.

Všechny studie s použitím lidských vzorků tkáně byly schváleny příslušnými etickými komisemi a všichni účastníci byli informováni o studijních cílů a metod a podepsal písemný informovaný souhlas před zařazením.

Genové exprese analýzy

tlustého Střeva vzorky (normální tlustého střeva, primární nádor, a jaterní metastázy vzorků pro REG/P studii, ale pouze primárního nádoru vzorky pro COSIVAL a BIOCOLON zkoušky) byly shromážděny v době operace následující standardizovaný postup pro získání vysoce kvalitní RNA . Vzorky byly poté hybridizovány do polí lidského genomu U133 Plus 2.0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

identifikovat nové terapeutické cíle pro protilátka terapie založené v metastazujícím kolorektálním karcinomem, jsme ve srovnání expresních profilů normální sliznice (n = 17), primární tumor (n = 20) a jaterních metastáz (n = 19) vzorky tkáně.

Jako CRC různorodost musí být vzaty v úvahu při porovnávání expresních profilů, primární nádor vzorků (n = 143) byly klasifikovány pomocí CRC molekulární klasifikace na základě expresních profilů, které byly navrženy tři nezávislé skupiny a nedávná shoda klasifikace . Krátce, De Sousa e. Melo et al. navrhla skupina nádorů ve třech třídách: CCS1 (ČKR s nestabilitou mikrosatelitů, MSI), CCS2 (rakovina s chromozomální nestability, CIN) a CCS3 (nový podtyp) . Sadanandam et al. identifikováno pět molekulárních podtypů založených na buněčném fenotypu: pohár-like, Transit-Amplifying (TA), Enterocyte, Stem-like a zánětlivé . Marisa et al. popsáno šest molekulárních podtypů (C1 až C6) s následujícími hlavními rysy: C1 = CIN a downregulace imunitních drah, C2 = MSI, C3 = mutovaný KRAS, C4 = fenotyp kmenových buněk, C5 = CIN a upregulace cest WNT a C6 = profil exprese CIN a normálního genu. A konečně, od šesti dříve publikovaných podpisů, mezinárodní konsorcium představila klasifikace se čtyřmi konsensu podtypy: MSI (CMS1), kanonický (CMS2), metabolické (CMS3), a mezenchymální (CMS4) (recenze ). Rozdělení vzorku CRC podle molekulárního podtypu je uvedeno v dalším souboru 1: tabulka S1.

analýza Imunohistochemie

Vzorky byly sestaveny v tkáni micro-array (TMA) pomocí tří tkáně jader (0.6-mm každý), jak bylo dříve popsáno . Krátce byly 3-µm úseky TMA de-parafinizovány a rehydratovány v odstupňovaných alkoholech. Teplem indukované získávání antigenu bylo provedeno inkubací úseků TMA v EDTA pufru (pH 9)při 98 °C ve vodní lázni po dobu 20 minut. Po neutralizaci endogenní peroxidázy, TMA řezy byly inkubovány s polyklonální anti-CLDN1 protilátek (JAY-8, Zymed laboratories Inc., CA, USA) nebo protilátky diluent (Dako, Glostrup, Dánsko) po dobu 60 min. Primární vazba protilátek byla vizualizována pomocí systému Envision® a Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Dánsko). Procento CLDN1-pozitivní buňky a intenzity barvení (0, žádné barvení; 1, nažloutlé; 2, hnědé; a 3, tmavě hnědá) byly hodnoceny pro jednotlivé TMA místě.

Western blot analýzy

Nádoru vzorky tkáně od pacientů byly přímo broušené v lyzačního pufru (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% A NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM roztokem orthovanadate, jeden koktejl inhibitoru proteázy tablet pro 10 ml) pomocí Mixer Mill® MM 300 jednotka (Qiagen, Valencia, CA). Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovým testem (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Poté bylo 50 µg celkových proteinů vyřešeno 12% stránkou SDS a přeneseno na nitrocelulózové membrány (Whatman® Protran®, velikost pórů 0,45 µm). Nespecifická vazebná místa byla blokována 5% (hm./obj.) odtučněné mléko v PBS s 0,1% (obj./obj.) látky Tween 20 (PBS-T) při pokojové teplotě po dobu 1 h a poté membrány byly inkubovány při 4 °C s polyklonální anti-CLDN1 protilátek (JAY-8) přes noc. Membrány byly poté promyty a inkubovány s příslušnými křenové peroxidázy konjugované se sekundární protilátkou po dobu 1 h. Zjevení byla provedena s chemiluminiscence system (Amersham Biosciences); pro normalizaci byla použita exprese β-tubulinu.

extrakce Subcelulárního proteinu

extrakce proteinu byla provedena tak, jak bylo popsáno výše . Pro každý vzorek byly řezy o tloušťce 20 µm řezány kryotomem, smíchány v kapalném dusíku a jemně rozemlety mikro-tloučkem. Na subcelulární protein extrakce, ProteoExtract Subcelulární Proteomu Extrakční Kit byl použit podle pokynů výrobce (Calbiochem). Subcelulární frakce (10 µg / každá) byly naloženy na 12% gelů SDS. Imunoblotingu bylo provedeno, jak je popsáno výše, s následující primární protilátky: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histonu H3 (Pierce) a β-tubulinu (Sigma T4026).

Buněčné linie

následující lidských CRC buněčné linie byly použity: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (dárek od C. Montagut, Oddělení klinické Onkologie, Nemocnice del Mar, Barcelona, Španělsko), HCT116 (CCL-247), a LS174T (ATCC CL-188). Získat CLDN1-pozitivní buněčné linie SW480 (SW480-CLDN1), buněk SW480 byly stabilně transfektovaly s lidskou CLDN1 cDNA klonů (Invitrogen MGC kolekce) nebo s prázdným vektorem (pcDNA) pomocí jetPRIME™ pro transfekci činidlem (Polyplus-transfekci Inc., Franci). Klony pozitivní na CLDN1 byly vybrány rostoucími transfekovanými buňkami v přítomnosti 500 µg/ml geneticinu. Pro CLDN1 tlumení hluku, SW620 byl transduced s lituji, pane vektor obsahující shRNA proti CLDN1 (SW620shCLDN1) nebo proti luciferase (shLUC, negativní kontrola). Po 24 hodinách byly buňky vybrány s 1 µg/mL puromycinu a stabilní klony byly sloučeny. Všechny přechodné transfekce byly provedeny pomocí transfekčního činidla jetPRIME™.

Produkce anti-CLDN1 mAb 6 F6

Pro produkci protilátek, 6-8 týdnů staré samice BALB/c myší (Harlan, Gannat, Francie) byly zpochybněny tím, intraperitoneální (i.p.) injekci 4 miliony myší NIH buňky přechodně transfektovaly s CLDN1 cDNA (NIH-CLDN1 buňky) každé dva týdny (pět injekce celkem). NIH-CLDN1 buněk byly smíchány s kompletním Freundově adjuvans (Sigma) pro první injekci, a neúplné Freund ‘ s adjuvantní (Sigma) pro další čtyři injekce. Intravenózní posilovací injekce buněk NIH-CLDN1 byla podána tři měsíce po páté imunizaci. O tři dny později byly buňky sleziny z imunizovaných myší fúzovány s buněčnou linií myelomu myši P3-X63-Ag.8.653 k produkci hybridomů myší. Supernatanty z nově generovaných klonů byly promítány pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS) pomocí buněk SW480-CLDN1 a SW480 (negativní kontrola). Výsledky screeningu byly potvrzeny provedením a dalším screeningem pomocí buněk SW620 a SW620-shCLDN1. Klon anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 byl vybrán a klonován omezením ředění. Protilátky isotyping ukázal, že 6 F6 byl IgG3k.

Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s francouzskou vládou pokyny pro experimentální studie na zvířatech (dohoda CEEA-LR-12052).

označení radioaktivním izotopem a SPECT-CT

Žena pokusným nahých myší (6-8 týdnů staré) byly zakoupeny od Harlana. 6 F6 mAb byl značeného s 125I (Perkin Elmer) při konkrétní aktivitě 370 MBq/mg pro jedno-fotonové emisní tomografie (SPECT) zobrazení, pomocí JODO-GEN (Pierce Chemical Co.) způsoba. Po ocasní žíly injekci 16 MBq/50 µg 125I-značeného 6 F6, celé tělo single fotonové emisní tomografie/počítačová tomografie (SPECT/CT), obrázky byly získány s 4-hlava multiplexování multi-pinhole NanoSPECT kamera (Bioscan Inc., Washington, USA) v různých časech (48, 72 a 96 h). Současně byly získány mikro-CT snímky celého těla pro anatomickou společnou registraci s daty SPECT. Rekonstruovaná data SPECT a CT byla vizualizována a společně zaregistrována pomocí Invivoscope®.

Clonogenic assay

Kolorektální rakovinné buňky byly nasazeny do 6-talíř (150, 250 nebo 400 buněk/jamku) a nechá se držet při 37 °C přes noc. Poté byl do každé jamky přidán 1 ml RPMI s nebo bez 6 F6 mAb (konečná koncentrace: 100 µg/ml) a buňky byly kultivovány po dobu šesti dnů. Po dalších šesti dnech v médiu bez protilátek byly destičky odečteny pomocí zobrazovacího cytometru Celigo™ a aplikace” ověření jedné kolonie”. Cytometr Celigo™ je stolní systém buněčné analýzy in situ, který poskytuje obrazy studní pomocí osvětlení jasného pole (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

Vytvoření tří-dimenzionální (3D) hyperboloidu kultur

Ultra-low attachment, s kulatým dnem 96jamkové destičky (Corning Costar) byly použity pro kulovitý útvar. Buňky SW480, SW480-CLDN1 nebo SW620 byly naočkovány při hustotě 5 × 104. Buňky se agregovaly a sloučily do 3D sféroidů během 24-72 hodin. Snímky jamek byly pořízeny mikroskopem s fázovým kontrastem pomocí 5× objektivu nebo zachyceny zobrazovacím cytometrem Celigo™ pomocí aplikace” Tumorosphere”. Životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí testu životaschopnosti luminiscenčních buněk CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, USA). Po přidání 100 µl činidla CellTiter Glo do každé jamky po dobu 10 minut byla luminiscence měřena na čtečce luminiscenční mikrodestičky MicroBeta TriLux 1450 (Perkin Elmer).

Buněčného cyklu a proliferace analýzy v toroidy

Toroidy byly připraveny nanesením 1000 DiFi buněk na jamku v ultra-low attachment 96jamkové desky, a roste v přítomnosti 100 µg/ml 6 F6 mAb nebo irelevantní mAb (retuximab) po dobu 5 dnů. Pro analýzu buněčného cyklu, buňky byly peletovaného, trypsinized, promyta PBS, pevné v 75% ethanolu, a potřísněné 40 µg/ml propidium jodidu v přítomnosti 100 µg ml−1 RNAse (Qiagen). Distribuce buněčného cyklu byla stanovena průtokovým Cytometrem FC500 Beckman Coulter pomocí kanálu FL-3. Buňky byly uzavřeny na bodovém grafu, který zobrazoval vrchol DNA-pulse-peak vs oblast DNA-pulse, aby se vyloučily dublety. Distribuce buněčného cyklu byly ilustrovány pomocí softwaru pro analýzu toku Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, or, USA).

Na den 4 kultury, buněčné proliferace byla měřena inkubaci buněk s 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) na 24 h. EdU je začleněn do DNA během aktivní syntézu DNA. Poté, po buněčné trypsinizaci a fixaci / permeabilizaci v 75% ethanolu/PBS, byl začleněn EdU označen a detekován pomocí sady Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow cytometrie Assay Kit (Invitrogen). Buňky byly poté inkubovány 1 µg / ml 4′, 6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) v PBS/0,1% Tritonu X100 při 37 °C po dobu 30 minut. Pro kvantifikaci fluorescenčního signálu a pro analýzu dat byla použita aplikace Celigo™ “Expression Analysis” (Target 1 + Mask). Buňky byly identifikovány pomocí jaderné skvrny DAPI a syntéza DNA byla kvantifikována měřením začlenění EdU.

Myš xenograftových modelů

1.5 × 106 buněk SW620 nebo 3 × 106 DiFi buňky byly suspendovány v kultivačním médiu a podaná subkutánně (s. c.) do pravé křídlo 6-8-týden-staré ženské pokusným nude myší z Harlanu. Když nádor objem dosáhl přibližně 100 mm3, byly myši náhodně v různých skupinách a léčena jsem.p. injekce 0,9% NaCl nebo 6F6 mAb (15 mg/Kg v jedné injekci) dvakrát týdně po dobu tří po sobě jdoucích týdnů na první pokus a třikrát týdně pro druhý experiment. Nádory byly měřeny dvakrát týdně pomocí třmenu a objemů vypočtených podle vzorce: D1 x D2 x D3 / 2.

Intrasplenic jaterní kolonizace model

V každém experimentu, 2 milionů luciferase-exprimujících buněk SW620 (SW620-LUC, buňky) byly injikovány ve slezině 6-8-týden-staré ženské pokusným nahých myší. Slezina byla odstraněna 2 minuty po injekci buněk. 1. den po injekci byly myši náhodně rozděleny do dvou skupin po 10 myších, které byly léčeny buď 15 mg / kg 6 F6 mAb nebo 0, 9% NaCl injekcí IP, třikrát týdně. K vyhodnocení metastazující vznik a šíření, luciferase výraz byl sledován luminiscence zobrazovací po injekci luciferin (Fotoaparát Ivis Lumina II, PerkinElmer®) jednou za týden. V 5. týdnu po operaci byly myši obětovány, játra byla odstraněna, fotografována a makroskopicky viditelné metastázy na povrchu jater byly počítány.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru STATA 13.0 (StataCorp). Pro genovou expresi nebo imunohistochemické experimenty byly analyzovány rozdíly mezi skupinami pomocí testu Kruskall Wallis / Dunn. Korelace mezi CLDN1 genové exprese a přežití bez progrese (PFS) a celkové přežití (OS) byly hodnoceny v celé skupině (n = 143 pacientů) a podle nádor molekulární subtyp. Za tímto účelem bylo 143 pacientů rozděleno do dvou skupin na základě mediánu exprese genu CLDN1 (tj. Hodnoty PFS a OS byly porovnány pomocí Kaplan-Meierovy metody a rozdíly mezi distribucemi přežití hodnocenými pomocí log-rank testu.

párový t-test byl použit k porovnání účinku inkubace s 6 F6 mAb v experimentech in vitro.

v experimentech in vivo byl použit lineární smíšený regresní model ke stanovení vztahu mezi růstem nádoru a počtem dní po injekci. Pevná část modelu zahrnovala proměnné odpovídající počtu dnů po štěpu a různým léčebným skupinám. Do modelu byly zabudovány podmínky interakce; byly zahrnuty náhodné zachycení a náhodné svahy, aby se zohlednil časový efekt. Koeficienty modelu byly odhadnuty maximální pravděpodobností. Míra přežití byla odhadnuta od data injekce až do data, kdy nádor dosáhl objemu 1500 mm3 pomocí Kaplan-Meierovy metody. Křivky přežití byly porovnány pomocí log-rank testu. Pro experimenty s kolonizací jater byly rozdíly mezi skupinami hodnoceny Mann-Whitney U testem. U všech experimentů byly rozdíly považovány za významné, když P < 0,05.