Rafinace kmenů Chlorobi o řešení fylogeneze a metabolický potenciál zástupce hluboce větvení, neobdělávané lineage
Genomické rekonstrukce NICIL-2
Mikrobiálního společenství kompoziční analýza termofilní bakteriální konsorcia přizpůsobené k růstu na biomasu substráty (celulóza, xylan a switchgrass) jako jejich jediný zdroj uhlíku při teplotě 60 °C důsledně identifikovány všudypřítomné OTU97, který byl vzdáleně příbuzný kultivovaným členům kmene Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Metagenomic sekvenční konsorcia přizpůsobené k růstu na ionic-liquid předem switchgrass, ve kterém Chlorobi související s OTU97 byla hojná, byla provedena k pochopení fylogeneze a metabolický potenciál populace, která byla zastoupena tato OTU97. Montáž (viz materiály a metody) a automatizované binning (Wu et al., 2014) metagenome tohoto konsorcia přineslo 20 genomické koše (Doplňkový Stůl S3), z nichž nejhojnější koše byly populace úzce souvisí s Chitinophagaceae kmen NYFB (61.8%), který byl izolován od spřízněné obohacení pěstovaných na buničité (Eichorste et al., 2013) a bin související s Chlorobi (23,1%). Koše přítomen na >1% zahrnovaly více nekulturní obyvatelstvo clustering s Paenibacillaceae (koše 003 a 006), neobdělávané populace clustering s Verrucomicrobia dělení 3 (bin 004), a populace úzce souvisí s Thermobipora bispora (bin 005), actinobacterial thermophile.
koš související s Chlorobi byl pojmenován NICIL-2 (pro Newby Island kompost iontová kapalina-2. v hojnosti). Analýza bílkoviny předvídat z NICIL-2 genomu byl v souladu s jeho identifikace jako populace vzdáleně příbuzná členy FCB superphylum, s Bacteroidetes (33%) a Ignavibacteria (15.7%) s nejvíce úzce souvisí proteinových sekvencí (Obrázek 1). Zpět NICIL-2 návrh genom byl relativně malý (2.67 Mb / s) a téměř kompletní (95.3%; 102 z 107 jediném exempláři markerových genů v 152 lešení). Délka N50 pro genom NICIL-2 byla 168 929 bp a největší kontig byl 1.1 MB, což naznačuje, že většina lešení představovala vysoce kvalitní sestavu(Tabulka 1).
distribuce z nejlepších-uzavřeno linie pro všechny NICIL-2 proteiny. Procenta se odhadují vydělením počtu bílkovin, které odpovídaly každé linii, proti počtu všech proteinů NICIL-2. Podrobnosti najdete v materiálech a metodách.
Fylogenetická analýza NICIL-2
16S rRNA genu (1451 bp) byl obnoven z NICIL-2 návrh genomu. Na ribotype nejvíce úzce souvisí s 16S rRNA genu NICIL-2 (>99% totožné) byl sekvenován z fosmid klon (JFF029_06) zotavil z tepelného toku (70 °C) v Japonské zlatý důl sekvence (Nunoura et al., 2005). 16S rRNA geny od kultivovaných zástupců Bacteroidetes a Chlorobi byly <85% identické se sekvencí NICIL-2. Fylogenetický strom konstruován tak, že zarovnáte 16S rRNA genové sekvence týkající se NICIL-2 prokázala, že linie obsahující NICIL-2 byl odlišný od Bacteroidetes a Chlorobi (Obrázek 2). Linie NICIL-2 obsahovala dvě linie sestupu na základě teploty vzorkovacího prostředí. Vysoká teplota desky (vyznačena červeně na Obrázku 2) součástí ribotypes především se dostal z prostředí s vysokou teplotou v rozmezí od 55 °C do 80 °C, jako klon OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). Druhý shluk zahrnoval ribotypy primárně získané z prostředí se střední teplotou v rozmezí od 20 °C do 32 °C (znázorněno zeleně na obrázku 2). Od OPB56 byl první klon zjistil, že je spojen s tímto fylogenetický clusteru, linie obsahující NICIL-2 je označována jako OPB56 clade. Rozšířený pohled na genový strom rRNA 16S je znázorněn na doplňkovém obrázku S1.
maximální pravděpodobnost fylogenetický strom, postavený na románu lineage NICIL-2 pomocí 16S ribozomální RNA gen. Klad nejblíže druhu NICIL-2 byl z fosmidu izolovaného z japonského zlatého dolu (Nunoura et al ., 2005). Teplotní rozsahy druhů byly stanoveny z literatury spojené s každým přístupovým číslem NCBI. Teplota obyvatel pro druhy byla označena červenou (>55 °C), zelenou (20-32 °C) nebo černou (neurčeno). Měřítko Označuje 0, 05 změn na nukleotidové místo. Podrobnosti o stavbě stromů jsou uvedeny v materiálech a metodách. Rozšířený fylogenetický strom zobrazující všechny uzly lze nalézt v doplňkovém obrázku S1. Plnobarevná verze tohoto obrázku je k dispozici na Isme Journal online.
Pro stanovení fylogenetické příslušnosti NICIL-2 a OPB56 clade více úplně, další ribozomální protein sekvence byly získány z dat získaného z přírodních vzorků. Jeho homologů 22 zachovaných ribozomální geny v NICIL-2 byly nalezeny ve dvou Japonských vřídelní fosmid klony (JFF029_C06 a JFF027_B02). Tato sada 22 ribozomálních proteinů byla použita k vyhledávání metagenomických datových sad z prostředí s vysokou teplotou. Kompletní sady těchto zachovaných ribozomální geny byly identifikovány ve čtyřech metagenomic sady dat získané z prostředí s vysokou teplotou. Automatický binning z těchto datových sad zotavil šest blízkosti-kompletní (>90% kompletní) návrh genomů, které jsou obsaženy sekvence pro zachovaných 22 ribosomální proteiny v NICIL-2 genomu a Japonský zlatý důl fosmid klony (Doplňující Tabulky S4). Pět ze šesti dlouhých proteinových sekvencí klastru s v OPB56 linie s NICIL-2, zatímco jeden sekvencí z Yellowstonu Fairy Falls clustery s Ignavibacteria (Obrázek 3a). Tento fylogenetický strom prokázal, že Chlorobea, Ignavibakterie a OPB56 vytvořily monofyletickou kladu s vysokou jistotou (97%). Bacteroidetes tvořil zřetelný shluk a rodina Rhodothermaceae, jejíž příslušnost k Bacteroidetes byla zpochybněna (Nolan et al., 2009), byly spojeny s Bacteroidetes s vysokou důvěrou (>80%). Druhý fylogenetický strom byl konstruován spojením vyrovnání 86 jednu kopii genů sdíleny mezi Bacteroidetes, Chlorobi a Fibrobacter (Obrázek 3b). Tento strom reprodukoval topologii pozorovanou pro Gen postavený z 22 ribozomálních genů, což dále podporovalo přidružení Chlorobea, Ignavibakterií a OPB56.
maximální pravděpodobnost fylogenetický strom, postavený na románu lineage NICIL-2 pomocí (a) 22 ribozomální proteiny a (b) 86 single-kopírování proteiny sdílené mezi Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 a Fibrobacter klastrů. Měřítko Označuje 0, 1 změny na místo aminokyseliny. Podrobnosti o stavbě stromů jsou uvedeny v materiálech a metodách.
komplementární přístup k pochopení evoluční vztahy mezi Bacteriodetes a Chlorobi bylo identifikovat indels v konzervované proteiny (Gupta a Lorenzini, 2007). Inzerce v DNA polymerázy III (28 aa) a alanyl-tRNA syntetázy (12-14 aa), které jsou zachované mezi GSB a chybí mezi Bacteriodetes byly připisováno jako charakteristika kmenů Chlorobi. Zarovnání těchto dvou proteinů (Doplňující Údaje, S2 a S3) naznačují, že DNA polymeráza III vložení do GSB proteinových sekvencí není přítomen v předpokládané proteiny z Ignavibacteriae a NICIL-2 genomy, zatímco 2-3 aminokyseliny vložení do GSB alanyl-tRNA syntetázy sekvence jsou zachovány v Ignavibacteria a NICIL-2 proteinových sekvencí.
Metabolické rekonstrukce NICIL-2
fyziologii NICIL-2 byla odvozena od metabolické rekonstrukce a její metabolický potenciál ve srovnání se zástupci GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus a Salinbacter ruber) a Ignavibacteria (Ignavibacterium album a Meliobacter roseus). Geny kódující proteiny související s fotosyntézou, včetně homologů C. tepidum je fotosyntetické reakční centrum podjednotek (CT1020, pscB, psC, pscD), chlorosome obálky proteinů (csmABCDEFHIJX) a bakteriochlorofyl a proteiny (fmoA), chybí ve všech dalších genomů, přičemž GSB v této srovnávací set (Eisen et al., 2002). Vizuální shrnutí metabolické rekonstrukce je uvedeno na obrázku 4. Úplné informace o genech, čísla krabic a zkratky, viz doplňkové tabulky S5 a S6.
Rekonstruované metabolismus NICIL-2 odvodit z vykouzlil genomu. Úplné informace o genech, čísla krabic a zkratky, viz doplňkové tabulky S5 a S6. Červený text představuje enzymy nebo biosyntetické dráhy, které v genomu chybí. Modré, zelené a fialové šipky označují tok ATP, NADH a NADPH.
Uhlíkový metabolismus
NICIL-2 genomu kóduje kompletní sadu genů pro glykolýzy, KREBSOVA cyklu a glukoneogeneze (Obrázek 4). Geny pro cyklus rTCA, které jsou přítomny a exprimovány pro autotrofní fixaci uhlíku v GSB, chybí. Kromě toho, přítomnost genů kódujících lipoová kyselina-obsahující kofaktory v pyruvát dehydrogenázy a α-ketoglutarát dehydrogenázy komplexů naznačuje, že KREBSOVA cyklu funguje v oxidačním směru. Většina cyklu rTCA byla rekonstruována v r. marinus a I. album, včetně několika pyruvát-ferredoxin oxidoreduktáz a α-ketoglutarát-ferredoxin oxidoreduktáz, dva potřebné enzymy pro cyklus rTCA. I. album i. R. marinus genomů nedostatek ATP-dependentní citrát lyázou, kritický enzym k dokončení rTCA cyklu (Buchanan a Arnon, 1990). Bylo navrženo, že I. album může používat ATP-nezávislé citrát lyázou, aby funkce v rTCA cyklu místo, i když toto tvrzení je nevyzkoušené experimentálně a ani I. album, ani R. marinus bylo prokázáno, že růst autotrophically (Liu et al., 2012a).
navzdory vysokému relativnímu množství v přizpůsobených kulturách rostoucích na rostlinné biomase měl NICIL-2 překvapivě omezenou enzymatickou schopnost dekonstruovat komplexní biomasu. Srovnání metabolický potenciál pro polysacharidů hydrolýzou mezi 20 koše extrahované z metagenome od předem-switchgrass obohacení prokázáno, že NICIL-2 má relativně méně genů pro celulózy a hemicelulózy dekonstrukce ve srovnání s ostatními členy mikrobiálních společenství (Doplňkový Obrázek S4). Zejména kmen NYFB, verrukomikrobiální populace a mnohočetné grampozitivní Firmicutes mají rozsáhlejší repertoáry genů pro hydrolýzu polysacharidů. Další kontrola rekonstruovaných genomů přidružených k OPB56 z vysokoteplotních přírodních vzorků prokázala, že nedostatek genů pro hydrolýzu polysacharidů byl pro tento klad společný. Mezi genomy, které se shlukují s Bacteroidetes a Chlorobi, R. marinus, m. roseus a Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, který shluky s Ignavibakteriemi, vlastnil rozsáhlý repertoár glykosidových hydroláz pro dekonstrukci rostlinné biomasy. Tyto analýzy naznačují, že NICIL-2 a souvisejících členové OPB56 clade jsou pravděpodobně nejsou zapojeny do primární dekonstrukce biomasy v přizpůsoben společenství a přírodním prostředí. Je možné, že NICIL-2 může růst na cukr monomery nebo oligomery; nicméně, jen jeden předpověděl disacharid transportní gen byl identifikován v genomu.
ačkoli výběr pro NICIL-2 probíhal za aerobních podmínek, může mít schopnost fermentace. Geny pro fermentativní produkci etanolu jsou přítomny (alkoholdehydrogenázou, EC 1.1.1.1), zatímco geny pro mravenčanu (přes pyruvát formát lyázy, ES 2.3.1.54), laktát (pomocí laktát dehydrogenázy, EC 1.1.1.27) a propionátu (přes methylmalonyl-CoA karboxylové transferázy, 2.1.3.1) chybí. NICIL-2 genom kóduje gen pro fosfotransacetylázu (EC 2.3.1.8), ale ne acetát kinázu (EC 2.7.2.1), z nichž oba jsou potřebné pro výrobu fermentačního acetátu. I. album I m. roseus obsahují geny pro produkci laktátu a acetátu, zatímco C. tepidum ne.
Dusíku a síry v metabolismu
Geny pro amonného asimilace, glutamin syntázy (EC 6.3.1.2) a glutamát syntázy (ES 1.4.1.13) byly zjištěny v NICIL-2 genomu. Nebyly však identifikovány žádné geny pro odlišnou redukci dusičnanů, asimilační redukci dusičnanů, denitrifikaci, fixaci dusíku a nitrifikaci. C. tepidum kóduje NIF geny potřebné pro fixaci N2, zatímco M. roseus (Kadnikov et al., 2013), i., 2012a) a R. marinus (Nolan et al., 2009) ne. C. tepidum je obligátní oxidační činidlo síry, a proto může oxidovat sulfid, thiosíran, siřičitan a elementární síru. C. tepidum přednostně oxiduje sulfid na elementární síru, poté elementární síru a thiosíran na síran (Chan et al., 2008). Kromě toho může být siřičitan oxidován, když je dodáván v růstovém médiu, ale nemůže udržet C.tepidum jako jediný donor elektronů (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I., m. roseus a R. marinus postrádá všechny geny potřebné pro oxidaci redukovaných sloučenin síry.
biosyntéza aminokyselin
genomu NICIL-2 chybí mnoho klíčových genů pro biosyntézu aminokyselin. Kompletní cesty jsou kódovány pro alanin, arginin, asparagin aspartát, β-alanin, glutamát, glycin, lysin a methionin. NICIL-2 postrádá ilvC a leuABCD, a proto má neúplné cesty pro biosyntézu valinu, leucinu a isoleucinu. Podobně i. album genomu postrádá všechny geny potřebné pro valin, leucin a isoleucin biosyntéza z pyruvátu kromě větvených amino transferázy (ilvE), zatímco M. roseus a C. tepidum obsahují kompletní cesty. Ani NICIL-2, ani I. album kóduje geny nutné pro biosyntézu prolinu z glutamátu (proBAC), zatímco oba C. tepidum a M. roseus. Srbský gen pro biosyntézu serinu chybí v NICIL-2, i. album, M. roseus, a Nachází se v některých GSB, včetně C. tepidum. NICIL-2 může také používat aminokyseliny jako růstové substráty. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).
Electron transport
The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Místo toho, většina genů jsou uspořádány nezávisle po největší NICIL-2 lešení (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE a nuoMN), a zbývající geny se nacházejí na tři menší tůra (nuoAB, nuoL a nuoC), což naznačuje, že absence operon struktura není artefakt shromáždění. C. tepidum obsahuje jednu sadu genů kódujících NADH: ubichinonoxidoreduktázu, která postrádá nuoEFG (11 podjednotek). I. album A M. roseus obsahují dvě sady nuoABCDHIJKLMN a jednu sadu nuoEFG (Doplňkový obrázek S6). Je zajímavé, že Komplex I z NICIL-2 je nejvíce úzce souvisí s těmi Rhodothermus marinus a Salinibacter ruber z Bacteroidetes, z nichž oba obsahují jednu kompletní sadu genů pro NADH:ubichinon oxidoreduktázu (Obrázek 5a). Homology pro 11 podjednotek Komplexu I byla také zjištěna ve všech šesti NICIL-2 související koše zotavil z Yellowstone a Skvělé Vroucí Jaře, a zřetězené sestavy z těchto proteinových sekvencí klastru s sekvence z NICIL-2.
Soused spojení nezakořeněné dlouhých bílkovin stromy Komplexu I (a) a alternativní Komplex III (b). Čísla v závorkách označují počet podjednotek použitých k vytvoření stromu. Měřítko označuje x změny na aminokyselinové místo.
Na ACIII je nová třída bakteriální membránové oxidoreduktázy nalézt v organismu, které často chybí bc1 komplexu (Yanyushin et al., 2005). ACIII od R. marinuse (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) a vláknitá anoxygenní fototrofická bakterie Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) byl očištěn a studován. V poslední době bylo v řadě bakteriálních genomů nalezeno velké množství genových shluků kódujících podjednotky ACIII, s variacemi v ústavě a organizaci (Refojo et al., 2013). Například, R. marinus obsahuje geny actABCDEF v operon, který kóduje šest ACIII podjednotek; homologů tohoto genu klastru byly identifikovány v několika členy Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Fylogenetický strom zobrazuje vztah ACIII od NICIL-2 k jeho nejbližším příbuzným (obrázek 5b). GSB nemají ACIII, a proto nejsou v tomto stromu zastoupeny. Nicméně, ‘Kandidát Thermochlorobacter aerophilum, který není členem GSB, kóduje ACIII, že pravděpodobně funkce v aerobní dýchání (Liu et al., 2012b). Je důležité si uvědomit, že jak I. alba a M. roseus jsou jedinečné mezi tato sada ACIII, protože obsahují pět podjednotek, s actDE podjednotky identifikovali jako fúzní protein. Plný počet genů, kódujících všechny ACIII podjednotek, které byly získány ze dvou NICIL-2-související genomu koše z Yellowstone metagenomes, bylo zjištěno, že obsahují actDE fusion a clustery s. alba a M. roseus. NICIL-2 tuto fúzi neobsahuje a geny pro její komplex ACIII jsou blíže příbuzné R. marinusovi a s. ruberovi.
nicil-2 terminální akceptory elektronů zahrnují cytochrom C oxidázu typu aa3 (komplex IV) a možné alternativní oxidázy cytochromu c, anotované jako CoxMOP. Je nepravděpodobné, že by NICIL-2 byl mikroaerofilní, protože oxidázy typu cbb3 nebyly v genomu detekovány. Kromě toho byl cytochrom bd nezjištěn. Pro srovnání, genomy i. album A M. roseus obsahují geny pro cytochrom C oxidázu typu cbb3 a komplex cytochromu bd.
genom NICIL-2 obsahuje neúplnou sadu genů men pro syntézu menachinonu. Kompletní biosyntetická cesta menachinonu obsahuje menFDHCEBAG (Bentley a Meganathan, 1982) a genom NICIL-2 zahrnuje pouze menBAG. Pro srovnání, C. tepidum a I. album obsahuje kompletní cesty mužů, zatímco genomy m. roseus a R. marinus mají anotace pro všechny požadované geny kromě menB a menH, resp. Homologové genů kódujících enzymy alternativní biosyntetické dráhy menachinonu, futalosinové dráhy (Arakawa et al., 2011), byly nezjištěny v NICIL-2. Chybí také biosyntetické geny ubichinonu. Genom NICIL-2 může mít v této oblasti neúplné pokrytí a další geny men mohou být nalezeny s kompletně sestaveným genomem. Alternativně, NICIL-2 mohou zapojit do chinon výměnu s ostatními členy komunity, jak bylo pozorováno pro phototrophic konsorcia ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu et al., 2013).
Bičíky a chemotaxe
Geny kódující proteiny pro bazální tělesné, háčku a vlákna sestavy jsou přítomny v NICIL-2 genomu. NICIL-2 však postrádá geny kódující chemotaxi, kromě jednoho regulačního proteinu, CheY. GSB jsou považovány za non-pohyblivé a nedostatek chemotaxe a bičíků, zatímco I. album, M. roseus a s. R. marinus mít bičíkový a chemotaxe stroje.
