Stabilizace heterochromatin do HODINY podporuje kmenových buněk omlazení a regeneraci chrupavky

Protilátky

Pro western blotting: anti-CLOCK (#5157, 1:1,000), anti-HP1a (#2616S, 1:1,000) a anti-HP1y (#2619, 1:3,000) z Buněčné Signalizace Technologie; anti-KAP1 (Ab22553, 1:2,000), anti-Lamin B1 (Ab16048, 1:1,000) a anti-LBR (Ab32535, 1:1,000) z Abcam; anti-β-actin (sc-69879, 1:3,000) od Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) ze systémů R&D.

Pro průtokové cytometrie: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-průkazu cd45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) a anti-CD19 (555415, 1:200) od BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) a anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) od eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-CD29 (303004, 1:200), a anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) a anti-CD164 (324805, 1:200) od Biolegend (San Diego, CA, USA).

Buněčné kultury

HODINY+/+ linií (linií, linie H9, WiCell Research Institute) a CLOCK−/− linií byly udržovány na feeder vrstvy, která se skládala z mitomycin C-inaktivovaných myších embryonálních fibroblastů (Mef), v lidských embryonálních kmenových buněk v kultivačním médiu. Kultivační médium hESC obsahovalo DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM neesenciálních aminokyselin (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-merkaptoethanolu (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) a 10 ng/mL bFGF (Společné Protein Centrální, Incheon, Korea). Alternativně, linií byly kultivovány na Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-potažené desky v mTeSR střední (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada).

Oba embryonálních kmenových buněk odvozených z hMSCs a primární hMSCs byly udržovány v MSC médium obsahující Memu (Thermo Fisher Scientific) doplněném 10% fetálního bovinního séra (FBS) (Cat# 10099-141, Hodně# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), a 1 ng/mL bFGF (Společné Protein Centrální, Incheon, Korea).

editace genů zprostředkovaná CRISPR/Cas9 v hESCs

editace genů zprostředkovaná CRISPR / Cas9 byla provedena pomocí dříve popsaných metod s některými modifikacemi.33,34,65 stručně řečeno, průvodce RNA cílení exon 5 HODINY (clock-gRNA) byl klonován do gRNA klonovací vektor (#41824, Addgene) (Doplňující informace, Tabulky S1). Při zacházení s ROCK inhibitorem Y-27632 (S1049, Selleck) po dobu 24 h, linií (5 × 106) byly resuspendovány ve 100 µL Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) obsahující plasmid koktejl, který se skládal dárce plazmid obsahující homologie zbraní, CLOCK-gRNA a hCas9 (#41815, Addgene), a electroporated v 4D-Nucleofector system (Lonza). Buňky byly poté naočkovány na krmné buňky MEF. G418 (100 µg / mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) byl přidán k zahájení pozitivní selekce 2-4 dny po elektroporaci. Po 2 týdnech selekce byly klony rezistentní na G418 odebrány a přeneseny na 96jamkovou desku pro další charakterizaci a expanzi. Genomické PCR a western blotting byly použity pro identifikaci genomické editace. Navíc jsme odstranili neomycin-odpor kazety do HODINY−/− linií pomocí elektroporace s pCAG-FLpo-2A-puro vektor. Tři dny po transfekci, 1 µg/mL puromycinu (Thermo Fisher Scientific) byl použit k obohacení puromycinu-rezistentní buňky po dobu 48 h. Po 8-12 dnech výběr, vznikající kolonií byly vybrány a rozšířeny pro následné studium.

generování a charakterizace hMSC

HMSC byly odlišeny od hESC podle dříve publikovaného protokolu.25,86,87 Ve zkratce, linií byly disociované do embryoid bodies (EBs) a léčeni diferenciace střední (MEMa (Invitrogen) a doplněno 10% FBS (Cat# 10099-141,Hodně# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1mM NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß, a 1% penicilin/streptomycin (Gibco)) na Matrigel-potažené desky za 10 dní až 95% soutoku. Další, splývající MSC-jako buňky byly stravitelné a chromované na Matrigel-potažené desky ošetřené MSC kultivační médium obsahující Memu (Invitrogen) a doplněno 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng/mL bFGF, a 1% penicilin/streptomycin (Gibco). Poté byly konfluentní buňky podobné MSC pasážovány na desky potažené želatinou. HMSC byly pomocí FACS purifikovány různými protilátkami odpovídajícími hMSC specifickým markerům (CD73, CD90 a CD105). Na CD73, CD90 a CD105 triple-pozitivní buňky byly dále charakterizovány povrchový antigen značky, včetně pozitivní markery, jako je CD44, CD166, CD29, HLA-ABC, a CD13, a negativní markery, jako CD34, CD43, průkazu cd45, CD164, CD14, CD19, a PDPN. Funkčnost hMSCs byla dále ověřena diferenciace směrem k chondrocytů, adipocytů a osteoblastů. Osteoblasty, chondrocyty a adipocyty odvozené od HMSC byly charakterizovány von Kossa barvením (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) a osteokalcin barvení (s uvedením osteogenesis), toluidinová modř (T3260, Sigma) a aggrecan barvení (s uvedením chondrogenesis), a Oil Red O (O1391, Sigma) barvení (s uvedením adipogenesis) podle pokynů výrobce.

izolace a kultura primárních HMSC

primární HMSC byly izolovány z dásní různých jedinců.23,33,34,65 tkáně odděleny od dásně byly nakrájíme na malé (1 mm2) kousky nůžkami v TrypLE™ Express Enzymu (1 ×), plus Dispase IV a dále inkubovány při 37 °C po dobu 30 min. Suspenze trávené tkáně byly neutralizovány kultivačním médiem MSC a centrifugovány při 200 × g po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Výsledné pelety byly resuspendovány v MSC kultivační médium obsahující Memu (Invitrogen) a doplněno 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF, a 1% penicilin/streptomycin (Gibco) a á na želatinou potažené desky pro růst primární hMSCs.

Luciferase reporter assay

plazmid PER2-dLuc byl laskavý dárek od E. E. Zhanga.88 Buňky přechovávání PER2-dLuc byly pěstovány na soutoku v 24-well kultivační destičky a synchronizovány s 20 µM forskolin (S2449, Selleck) po dobu 2 h. Média pak byla nahrazena MSC kultivační médium obsahující 0,25 mM luciferin (ŠTĚSTÍ-1G, GoldBio). Buňky byly sledovány v lumicycle luminometru při 37 °C po dobu 5-7 dnů; vygenerovaná data byla analyzována pomocí softwaru pro analýzu LumiCycle (Actimetrics). Data z prvního 24hodinového cyklu byla z naší statistické analýzy vyloučena.

in vitro synchronizace hMSC a cirkadiánní analýza

HMSC byly naneseny na želatinové desky s MSC médiem až do 95% soutoku. Pro synchronizaci byly buňky poté ošetřeny 20 µM forskolinem po dobu 2 h a znovu uloženy v MSC médiu po dvojnásobném promytí PBS. Buňky byly odebrány od 24 hodin po synchronizaci v 3-h intervalech po dobu 9 časových bodů, následované extrakcí RNA a detekcí RT-qPCR. Neparametrický test JTK_CYCLE byl použit pro ověření cirkadiánních oscilací, jak bylo popsáno výše.89 vlákna časového průběhu HMSC s hodnotami p i q < 0,05 byly považovány za rytmické.

Western blotting

buňky byly lyzovány v SDS pufru obsahujícím 4% SDS a 100 mm Tris-HCl. Na koncentrace proteinu byla stanovena pomocí BCA kvantifikace kit (Thermo Fisher Scientific), a ~20 µg proteinů na vzorek byl podroben SDS-PAGE a electrotransferred na PVDF membrány (Millipore). Poté byly membrány blokovány 5% mlékem a inkubovány s primárními protilátkami a poté s konjugovanými sekundárními protilátkami s křenovou peroxidázou (HRP). Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány v systému ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Statistické analýzy byly kvantifikovány pomocí softwaru Image J (NIH). Každá skupina měla tři nezávislé experimenty. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

transmisní elektronová mikroskopie

hodiny+/+ a hodiny-/− HMSC byly enzymaticky sklizeny Tryplem (Thermo Fisher Scientific) a centrifugovány při 500 × g po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Výsledné pelety byly fixovány 4% paraformaldehydem (PFA) v PBS (pH 7,4) na ledu přes noc. Buňky byly následně dehydratovány v odstupňované sérii ethanolů, permeabilizovány a vloženy do LOWICRYLOVÉ pryskyřice HM20. Oddíly (200 nm) byly získány a zobrazen s Duchem transmisní elektronový mikroskop (FEI Company) působící na 100 kV.

Imunofluorescenční barvení

Buňky nasazené na coverslips (Thermo Fisher Scientific) byly promyty dvakrát s PBS. Poté byly buňky fixovány 4% PFA po dobu 30 min, permeabilized s 0,4% Triton X-100 v PBS po dobu 30 min a blokovány s 10% oslí sérum v PBS (Jackson Immuno Research) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Po blokování byly buňky inkubovány s primárními protilátkami při 4 °C přes noc. Následně byly buňky třikrát promyty PBS, inkubovány se sekundárními protilátkami při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a třikrát promyty PBS. Jádra byla obarvena Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Zobrazování bylo provedeno pomocí konfokálního systému Leica SP5. Statistická analýza počtu, intenzity a plochy fluorescenčních signálů byla kvantifikována pomocí softwaru Image J (NIH). Buňky byly odebrány ze tří biologických replikátů. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test. 3D rekonstrukce barvení H3K9me3, jak je znázorněno na obr. 2f byla provedena podle sériových z-stack řezů o 50 nm intervalech na konvenční režim pro až 50 snímků s Leica SP5 konfokální systém a dále zpracovávány pro 3D rekonstrukci Imaris software (verze 7.4.2), jak bylo dříve popsáno.90

sa-β-gal barvicí test

sa-β-gal barvení bylo provedeno tak, jak je popsáno v předchozích studiích.33,34 stručně řečeno, buňky byly fixovány fixačním pufrem (2% formaldehyd a 0.2% glutaraldehydu) po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Poté byly fixované buňky obarveny čerstvým barvicím roztokem při 37 °C přes noc. Zorné pole byla náhodně vybrána v každé jamce a procento sa-β-gal-pozitivních buněk bylo stanoveno pomocí softwaru ImageJ. Každá skupina měla tři biologické repliky. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

klonální expanzní test

byl proveden klonální expanzní test, jak bylo dříve hlášeno.34,65 Ve zkratce, 6000 buněk na jamku byly nasazeny do 6-destičky a kultivovány po dobu 9-12 dní. Buňky byly dvakrát promyty PBS, fixovány 4% PFA a obarveny 0,2% krystalově fialovou po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Zorná pole byla skenována skenerem a dále měřena softwarem ImageJ (NIH). Každá skupina měla tři biologické repliky. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

Co-IP

HEK293T buněk transfektovaly s plasmidy vyjádření Vlajky-Luc nebo Vlajky-HODINY a hMSCs jsou lyžují v CHAPS lysis buffer (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7.5), a kompletní koktejl inhibitoru proteázy (Roche)) při 4 °C po dobu 4 h a poté byly odstředěny při 14,500 × g a při 4 °C po dobu 40 min. Pro Co-IP s exogenní bílkoviny, supernatanty byly smíchány s anti-Flag protilátkou-spolu korálky (A2220, Sigma) a otáčet přes noc při 4 °C. Pro Co-IP s endogenní proteiny, supernatanty byly smíchány s uvedenými protilátkami přes noc při 4 °C s rotací a poté byly inkubovány s Protein A/G-PLUS Agarózového korálky (sc-2003, Santa Cruz) pro další 4 h při teplotě 4 °C s rotací. Kuličky byly šestkrát promyty CHAPS pufrem a poté eluovány peptidy vlajky nebo vařením v 1× SDS nakládacím pufru po dobu 10 minut pro západní blotování.

LC-MS/MS analýza a identifikace bílkovin

eluované proteiny získané immunoprecipitation byly podrobeny 10% SDS-PAGE a obarveny pomocí Coomassie brilliant blue (WB-0101, Peking Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Gel kapely obsahující protein vzorky byly vyříznuty, nakrájíme na malé svíčky, dehydrované (100% acetonitril), snížení (10 mM DTT v 25 mM NH4HCO3 za 45 min v 56 °C) a alkylovaných (40 mM iodoacetamide v 25 mM NH4HCO3 45 min při pokojové teplotě ve tmě). Další, gelové svíčky byly sušené a stravitelné s sequencing grade modified trypsin (40 ng na kapely) v 25 mM NH4HCO3 přes noc při 37 °C. Nakonec, kyseliny mravenčí na 1% konečná koncentrace byla použita k ukončení enzymatické reakce. Výsledný roztok byl poté přenesen do injekční lahvičky se vzorkem pro analýzu LC-MS/ms.

nanoLC-MS/MS experimenty byly provedeny na Q Exactive hmotnostního spektrometru (Thermo Scientific) v datech závislé na režimu, který dovolil, MS pro sběr dat ve vysokém rozlišení 70.000 (m/z 200) přes m/z rozsahu 300 až 1,600. Raw data z Q Exactive analýzy byly analyzovány s Proteomu Objev (verze 1.4) pomocí Sequest HT vyhledávač pro protein identifikace a Překapávač na false discovery rate (FDR) analýzy. Data byla prohledána v databázi lidských proteinů UniProt (Aktualizováno 06-2013). FDR analýza byla provedena pomocí Perkolátoru a FDR < 1% byla stanovena jako prahová hodnota pro identifikaci proteinu. Peptidová důvěra byla nastavena na vysokou pro filtraci peptidů.

RT-qPCR a RNA-Seq

Celková RNA byla extrahována z kultivované lidské buňky nebo myš kloubů pomocí TRIzol (Thermo Fisher Scientific), a genomické DNA byla odstraněna pomocí DNA-free kit (Thermo Fisher Scientific). cDNA byla generována pomocí reverzního transkripčního systému Go Script (Promega). RT-qPCR byl proveden pomocí qPCR Mix (Toyobo) v systému CFX384 Real-Time (Bio-Rad). Každá skupina měla čtyři dobře replikuje. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test. Všechny experimenty RT-qPCR byly provedeny s nejméně třemi experimentálními replikáty a nezávisle opakovány nejméně dvakrát. Pro myš společné RNA-seq, kolenního kloubu RNA vzorky od stejné zacházení skupinu ve věku myším injekčně s lentiviruses vyjádření Luc (n = 12 myší) nebo HODINY (n = 12 myší) byly smíchány rovnoměrně ve hmotě, a RNA-seq byla provedena s dvou technických replikátů. Pro hMSC RNA-seq byly zkoumány dva biologické repliky. Sekvenční knihovna byla vytvořena pomocí NEBNext Ultra RNA Knihovna Prep Kit pro Illumina podle protokolu výrobce. Generované knihovny byly sekvenovány na platformách Illumina HiSeq X-Ten s párovým sekvenováním s délkou čtení 150 bp. Kontrola kvality a sekvenování byly prováděny technologií NoVo genové bioinformatiky. Primery použité pro qPCR byly uvedeny v doplňujících informacích v tabulce S2.

zpracování dat RNA-seq

potrubí pro zpracování dat RNA-seq bylo hlášeno již dříve.34 Raw spárovaných koncových čtení bylo oříznuto v softwaru Trim Galore (verze 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Čistá čtení byla mapována na lidský genom UCSC hg19 nebo myší genom mm10 pomocí hisat2 (verze 2.0.4).91 soubory sam byly převedeny na soubory bam pomocí SAMtools s parametrem “- S-b-q 10”.92 poté byly počty čtení vypočteny pomocí HTSeq (verze 0.11.0) a zachovány byly pouze vysoce kvalitní mapované čtení (kvalita mapování > 20).93 hodnota fragmentů na Kilobázu na milion (FPKM) pro každý gen byla vypočtena pomocí StringTie (verze 1.2.3).94 Rozdílně vyjádřené geny (DEGs) byly vypočteny pomocí DESeq2 balíčku (verze 1.22.2) s cutoff “q hodnota (nastavená hodnota p, padj) < 0,05 a |log2 (násobnou změnu)| > 1 pro hMSCs nebo |log2 (násobnou změnu)| > 0.5 pro myš kloubů”. Analýza obohacení genové ontologie (GO) byla provedena s ToppGene.95 analýza obohacení genových sad byla provedena společností GSEA (verze 2.2.4). SASP genová sada byla získána z předchozí studie.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam a pLgw EcoDam-V5-EMD byly dary od Prof. Bas van Steensel (The Netherlands Cancer Institute (NKI)). DamID-seq byl proveden tak,jak je popsáno, 58 s úpravami. Ve zkratce, Přehrady a Přehrady-EMD lentiviruses generovány z HEK293T buňky byly soustředěny ultracentrifugation na 19,400× g po dobu 2,5 h. Virus pelety byly resuspendovány v PBS. Hodiny+/+ a hodiny− / − HMSC byly naočkovány do šesti jamek na 2 × 105 buněk na jamku. Každá skupina měla tři biologické repliky. Následující den bylo kultivační médium nahrazeno 2 mL čerstvého kultivačního média obsahujícího buď Dam nebo Dam-EMD lentivirus. Po 72 hodinách po transdukci byly buňky odebrány a genomová DNA byla izolována pomocí tkáňové sady DNeasy Blood & (69504, Qiagen). Trávení DpnI (R0176S, New England Biolabs), ligace adaptéru, trávení DpnII (R0543S, New England Biolabs), amplifikace a čištění PCR byly provedeny, jak bylo popsáno výše.58 adaptér Pro ořezávání, amplifikované DNA byla ozvučují a stravitelné s AlwI (R0513S, New England Biolabs). Knihovna DNA byla vytvořena pomocí NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit pro Illumina (E7370S, New England Biolabs). Knihovny byly sloučeny a podrobeny spárovanému sekvenování s délkou čtení 150 bp na sekvencerech Illumina NovaSeq.

DamID-seq zpracování dat

surové čtení dat Dam a Dam-EMD pro hodiny+ / + a hodiny−/− HMSC byly oříznuty v softwaru Trim Galore (verze 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Zdobené čtení byly mapovány na lidský genom UCSC hg19 pomocí Bowtie 2 (verze 2.2.9).96 PCR duplikáty byly odstraněny s Markduplikáty.jar program v Picard tools. Poté byly čtení seřazeny pomocí SAMtools (verze 1.6). Aby se minimalizoval účinek zkreslení a hloubky sekvenování, byly sloučeny zpracované čtení ze tří replik pro každý vzorek. Poté byl náhodně vybrán stejný počet (110 milionů) vysoce kvalitních čtení pro každý typ buňky pro následnou analýzu. K vizualizaci DamID signály, jsme vypočítali log2 poměru Čte Za Kilobase za Miliony mapované čte (RPKM) Přehrady-EMD a Dam signály (log2 (Dam-EMD/Přehrada)) HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs pro každého 10-bp bin pomocí bamCompare program v deepTools (verze 2.5.4-2-5ee467f) software.

Pro identifikaci CHLAPEC regiony HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs, jsme vypočítali DamID signály (log2 poměru RPKM Přehrady-EMD a Dam signály (log2 (Dam-EMD/Přehrada)) HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs pro každý 2-kb bin pomocí bamCompare program v deepTools (verze 2.5.4-2-5ee467f) software. Poté jsme implementovali balíček R pro skryté modely Markov s emisemi t (HMMt) (Verze 0.1), abychom identifikovali chlapce (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

porovnat DamID signály v LAD mezi regiony HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs, jsme sloučili CHLAPEC regiony uvedené v HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs do unie a vypočítané relativní DamID signál (DamID signál do HODINY−/− hMSCs minus DamID signál do HODINY+/+ hMSCs) pro každou unie CHLAPEC regionu. Poté byly pomocí R package Rideogramu (verze 0.2.2) vyneseny relativní Damidovy signály pro oblasti LAD, jak je znázorněno v doplňujících informacích, obr. S4d.97

ChIP-qPCR a ChIP-seq

Ve zkratce, 1 × 106 HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs byly zesítěny v 1% (obj./obj.) formaldehydu v PBS po dobu 8 min při pokojové teplotě, a reakce byla ukončena inkubací s 125 mM glycin po dobu 5 min při pokojové teplotě. Vzorky byly poté lyzovány na ledě dalších 10 minut. Po ultrazvuku v Covaris S220 zaměřen-ultrasonicator (Covaris) a centrifugace po dobu 10 min při 12000 × g a při 4 °C, supernatanty byly inkubovány přes noc při teplotě 4 °C se Bílkoviny Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) konjugovaná s anti-HODINY protilátky, anti-H3K9me3 protilátek nebo králičí IgG. Následně se eluce a zpětné zesítění prováděly při 68 °C po dobu 2 h v termomixéru. Poté byla DNA izolována extrakcí fenol-chloroform-isoamylalkoholu a srážením ethanolu. Čištěná DNA byla podrobena qPCR pro vyhodnocení okupace hodin nebo h3k9me3 v opakujících se sekvencích. Obohacený fragmenty byly postaveny do knihovny bez začlenění spike-v ovládání prostřednictvím KAPA Hyper Prep Kit s PCR Knihovna Zesílení/Illumina Série (KK8504, New England Biolabs) podle pokynů výrobce. Všechny experimenty byly provedeny nejméně dvakrát s podobnými výsledky. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

zpracování dat ChIP-seq

pro zpracování dat H3k9me3 ChIP-seq byly surové čtení oříznuty softwarem Trim Galore (verze 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Zdobené čtení byly mapovány na lidský genom UCSC hg19 pomocí Bowtie 2 (verze 2.2.9).96 duplikovaných čtení bylo odstraněno se Značkouduplikáty.jar program v Picard tools. Poté byly čtení seřazeny pomocí SAMtools (verze 1.6). Aby se minimalizoval účinek zkreslení a hloubky sekvenování, byly sloučeny zpracované čtení ze tří replik pro každý vzorek. Poté byl náhodně vybrán stejný počet (130 milionů) vysoce kvalitních čtení pro každý typ buňky pro následnou analýzu. Pro vizualizaci signálů ChIP-seq jsme vypočítali normalizované počty čtení stanovením hodnot RPKM pro každý zásobník 10 bp. Pro h3k9me3 peak volání, SICER (verze V1.1) byl použit s parametrem “-w 200-g 3”.98 byly zachovány pouze píky H3K9me3 s mezní hodnotou FDR 1% nebo vyšší.

pro identifikaci “hor h3k9me3” byl vypočítán signál H3K9me3 v počtech na milion (CPM) v každém vrcholu H3K9me3. Pak jsme zařadil H3K9me3 vrcholy v pořadí rostoucí H3K9me3 signál a vynesou na H3K9me3 ChIP-seq kapacita HODINY+/+ a CLOCK−/− hMSCs, jak je znázorněno na Doplňující informace, Obr. S4f. tyto pozemky ukázaly jasný bod, kde se signál obsazenosti H3K9me3 začal rychle zvyšovat. Poté byly stanoveny inflexní body těchto křivek. Dále jsme definovali vrcholy H3K9me3 nad inflexními body jako “hory H3K9me3” a vrcholy H3K9me3 pod těmito body jako typické vrcholy H3K9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq byl proveden tak, jak bylo popsáno výše.99 Ve zkratce, celkem 50.000 buňky byly promyty dvakrát PBS a resuspendovány v 50 µL lyzačního pufru (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, o 0,1% (v/v) Nonidet P40 náhradník). Pozastavení jádra byla poté centrifugována při 500 × g po dobu 10 min při 4 °C, následovalo přidání 50 µL provedení reakční směs (10 µL 5 × TTBL vyrovnávací paměti, 4 µL TTE mix a 36 µL nuclease-free H2O) z TruePrep DNA Library Prep Kit V2 pro Illumina (Vazyme Biotech). Vzorky byly potom inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut. Knihovny byly poté amplifikovány a vyčištěny pomocí TruePrep DNA Library Prep Kit V2 pro Illumina (Vazyme Biotech). Kvalita knihovny byla hodnocena pomocí analyzátoru fragmentů. Nakonec byly knihovny sekvenovány na platformách Illumina HiSeq X-Ten s párovým sekvenováním s délkou čtení 150 bp.

zpracování dat ATAC-seq

pro zpracování dat ATAC-seq byly surové čtení oříznuty softwarem Trim Galore (verze 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Zdobené čtení byly mapovány na lidský genom UCSC hg19 pomocí Bowtie 2 (Verze 2.2.9) s parametrem “- X 2000-N 1-L 25-no-mixed-no-discordant-t”.96 duplicitních čtení bylo odstraněno s Označenímduplikáty.jar program v Picard tools. Poté byly čtení seřazeny pomocí softwaru SAMtools (verze 1.6). Poté byly sloučeny zpracované čtení ze tří replik pro každý vzorek. Pro vizualizaci signálů ATAC jsme rozšířili každé čtení o 250 bp a normalizovali počty čtení o hodnotu RPKM pro každý zásobník 10 bp. Pro atac peak volání byl použit MACS2 (verze 2.1.1.20160309) s parametrem “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summity”.100 pouze nazývané vrcholy ATAC s hodnotami q < 0,01 byly zachovány. Vrcholy ATAC identifikované v hodinách+/+, ale ne v hodinách – / – HMSC byly definovány jako “uzavřené” vrcholy ATAC; vrcholy ATAC identifikované v hodinách -/ -, ale ne v hodinách+ / + HMSC byly definovány jako” otevřené ” vrcholy ATAC. Odhad genomové distribuce použitých vrcholů ATAC annotatePeaks.pl program v homer software.101

Hodnocení reprodukovatelnost údaje o sekvenování

vyhodnotit reprodukovatelnost H3K9me3 ChIP-seq a ATAC-seq dat, Euklidovské vzdálenosti mezi opakováními byla vypočítána následovně: čtení byly počítány a normalizovány RPKM při velikosti zásobníku 2 kb. Poté byla euklidovská vzdálenost vypočtena v R (verze 3.5.1), aby se vyhodnotila Reprodukovatelnost. Nižší euklidovské vzdálenosti znamenají vyšší korelace. Pro vyhodnocení reprodukovatelnosti dat DamID-seq byla provedena analýza hlavních komponent (PCA) v R (verze 3.5.1). Pro vyhodnocení reprodukovatelnosti RNA-seq dat, scatter pozemky byly vypracovány na základě legalizovány logaritmus (rlog)-normalizované číst, počítat s DESeq2, a Pearsonův korelační koeficient mezi opakování byla vypočtena.

pokusy na zvířatech

pro analýzu tvorby teratomů myši NOD/SCID (6-8 týdnů staré, zakoupené od Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) byly injikovány 3 × 106 hodiny+ / + nebo hodiny−/− hESCs v roztoku Matrigel: mTeSR (1:4). Teratomy byly odebrány 8-12 týdnů po injekci pro další analýzu.

Pro hMSC transplantace testy, 1 × 106 HODINY+/+ nebo CLOCK−/− hMSCs transduced s lentiviruses vyjádření Luc byly injikovány do TA svalů nahých myší (6-8 týdnů). Myši byly poté ošetřeny D-luciferinem (LUCK-1G, GoldBio) a zobrazovány zobrazovacím systémem Ivis Spectrum (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Bioluminiscenční snímky byly získány v režimu” auto”. Každá skupina měla šest biologických replik. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

Pro stárnutí-související Clock úroveň detekce, myší, různých věkových kategorií (mladých, 1 měsíc, n = 5 myší; starý 15 měsíců, n = 10 myší) bylo utraceno a klouby byly shromážděny pro RT-qPCR analýzu. Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

posoudit, zda lentiviral správa HODINY by mohly zmírnit stárnutí-související syndromy, lentiviruses vyjádření Luc (n = 14 myši) nebo HODINY (n = 13 myši) byly injikovány do kloubní dutiny 18-měsíc-staré myši (zakoupené od SPF (Peking) Biotechnologie) a doplněn po 8 týdnů po injekci. Experiment na běžeckém pásu byl proveden v době 15 týdnů po první injekci lentivirů exprimujících Luc nebo hodiny. Podrobně byly myši trénoval na běžecký pás (SA101, SANS) na svahu o sklonu 5° více než 3 dny 20 min každý den, s rychlostí zrychlil od 0 do 20 m/min. V testovací den myši běžely na běžeckém pásu s počáteční rychlostí 0 m / min a poté byla rychlost zvýšena o 2 m/min na 20 m/min. Celá doba běhu byla stanovena na 20 min. Frekvence mírného podnětu elektrického šoku byla zaznamenána a analyzována (Luc, n = 14 myší; hodiny, n = 13 myší). Mikro-CT skenování bylo provedeno v době 16 týdnů po první injekci (Luc, n = 14 myší; hodiny, n = 13 myší). Myši pak byly utraceno, a klouby byly shromážděny pro histologické posouzení (Luc, n = 14 myši; HODINY, n = 13 myši) a kvantifikace mRNA (Luc, n = 12 myší, HODINY, n = 12 myší). Statistické významů posuzovala oboustranný nepárový studentův t-test.

Histologie a imunohistochemie

Pro histologickou analýzu, sklizené myši klouby byly fixovány 4% PFA po dobu 2 dnů a vložené do parafínu po odvápnění pro 14-21 dní. Sekce (5 µm)byly obarveny rychle zeleným FCF (0,02%) a safraninem O (0.1%) podle pokynů výrobce.

imunohistochemické barvení bylo provedeno metodou barvení DAB, jak bylo dříve popsáno, s některými modifikacemi.33,34,102 nejprve byly diapozitivy deparafinizovány a rehydratovány za použití xylenu a různých koncentrací alkoholu. Odběr antigenu byl proveden za použití trypsinu (ZLI-9010, ZSGB-BIO) trávení po dobu 20 minut při pokojové teplotě. Peroxid vodíku (3%) byl použit k blokování aktivity endogenní peroxidázy inkubací po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Snímky pak byly blokovány 10% oslí sérum pro 1 h při pokojové teplotě a inkubovány s anti-protilátky P16 (Ab54210, Abcam, 1:200) při 4 °C přes noc a se sekundární protilátkou (PV-6002, ZSGB-BIO) po dobu 1 h při pokojové teplotě před DAB-barvení (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Etické prohlášení

experimenty zapojen v této studii sledovali Zásady pro Použití Formátu pro Etické Schválení pro Výzkum Zahrnující Zvířata a byly předem schváleny Institucionální Animal péče a Používání Výboru Ústav Zoologie (Čínská Akademie Věd). Anestetizace myší byla provedena isofluranem a eutanizace byla provedena CO2 následovanou cervikální dislokací.

Statistická analýza

statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru Graph-Pad Prism. Data jsou prezentována jako prostředky ± SEM nebo SD. Srovnání bylo provedeno s dvouocasým nepárovým studentským t-testem. Hodnota P (p) < 0,05 byla definována jako statisticky významná.