Syntézu Kolagenu
Nařízení Kostní Syntézu Kolagenu
syntézu Kolagenu v orgánových kulturách hlodavce calvariae a buněčné kultury byly hodnoceny pomocí několika různých testech . V nejpoužívanějším testu jsou Kalvárie a buňky inkubovány radioaktivně značeným prolinem několik hodin před koncem kultury. Inkorporace radioaktivně značeného prolinu do kolagenázy stravitelného proteinu (značení CDP) a nekolagenního proteinu (značení NCP) se měří v extraktech kultur za použití vysoce purifikované bakteriální kolagenázy . Procentuální syntéza kolagenu se vypočítá z hodnot CDP a NCP po korekci většího množství prolinu v kolagenu ve srovnání s nekolagenními proteiny . Produkce kolagenu může být také stanovena měřením obsahu hydroxyprolinu v buněčných nebo orgánových kulturách, protože hydroxyprolin je pro kolageny prakticky jedinečný. Tyto metody nerozlišují mezi různými typy fibrilárního kolagenu. Kolagen syntetizovaný kulturami kostních orgánů a většinou osteoblastických buněčných kultur je však z velké části typu I (>95%), takže hodnota značení CDP obvykle odráží syntézu kolagenu typu I. Pokud je to žádoucí, výroba různých kolagenu typy mohou být rozlišeny podle ion-exchange chromatography a polyakrylamidovém gelu elektroforéza značeného výtažky z buňky nebo orgánu kultur . Exprese kolagenu typu I v kulturách lidských buněk byla také hodnocena měřením sekrece Propeptidu C-terminálního prokolagenu I . Konečně, specifické cDNA sondy v Severní blotting a alel-specifické primery v reverzní transkriptáza-polymerázová řetězová reakce testy byly použity k posouzení kolagenu expresi mRNA v kostní modely. Měření účinku 1,25 (OH) 2D3 na syntézu kolagenu a hladiny mRNA přineslo srovnatelné výsledky pomocí těchto různých testů.
1,25(OH)2D3 inhibuje syntézu kolagenu v orgánových kulturách 21-den plodu krysa calvariae a neonatální myši calvariae s malý nebo žádný vliv na noncollagen syntézu bílkovin. Maximální inhibice syntézy kolagenu 1,25 (OH) 2D3 u Kalvárií potkanů (asi 50%) nastává při 10 nM . 1,24 R,25 – (OH) 3D3 také inhibuje syntézu kolagenu, ale je méně účinný než 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 a 24R,25(OH) 2D3 nemění syntézu kolagenu pod 100 nM . Vitamin D metabolitů neinhibuje syntézu kolagenu a stimulují resorpci plodu krysa dlouhých kostí s podobnými relativními energiemi, které korelují s afinitou metabolitů pro kosterní záznamníků cestovních údajů . K určení buněčné selektivity 1,25(OH)2D3 inhibice syntézy kolagenu, orgánové kultury plodu krysa calvariae byly léčeny 1,25(OH)2D3 za 22 h a poté inkubovány s tritiated prolinu za poslední 2 h kultury. Centrální kost (zralé osteoblasty) byla disekována bez periostu (méně zralé osteoprogenitory a fibroblasty) a oba kompartmenty byly analyzovány odděleně pro začlenění tritiovaného prolinu. 1,25 (OH) 2D3 snižuje syntézu kolagenu v centrální kosti, ale ne v periostu, což naznačuje selektivitu účinku 1,25 (OH) 2D3 pro zralé osteoblasty . Pomocí in vivo protokol, ve kterém novorozených potkanů byly uvedeny více injekce tritiated prolin značení nově syntetizovaných kostní matrix, 25 ng 1,25(OH)2D3 uvedeny na dny 1, 3 a 5 inhibuje syntézu kostní matrix, jak je hodnotí histomorphometry z autoradiographs z holenní a calvariae .
1,25(OH)2D3 inhibuje také tvorbu kolagenu v rat osteoblastické osteosarkom ROS 17/2.8 buněk , primární a myš osteoblastické buňky , a imortalizované myší buněčné linie osteoblastů (MMB-1) . 1,25(OH)2D3 má větší inhibiční vliv na syntézu kolagenu typu I v log fázi růstu primárních myších osteoblastické buňky než na soutoku, snad proto, že proliferující buňky obsahoval více záznamníků cestovních údajů . Podobně inhibice syntézy kolagenu 1,25(OH)2D3 je větší v řídkých kulturách buněk MMB-1, které mají vyšší hladiny VDR než konfluentní buňky MMB-1 . 1,25(OH)2D3 inhibice syntézy kolagenu je ekvivalentní v řídké a splývající krysa primární osteoblastické buňky , ale VDR počet nezměnil během růstu buněk . Společně tyto údaje ukazují, že rozsah inhibice syntézy kolagenu 1,25 (OH) 2D3 je do značné míry určen buněčným množstvím VDR. 1,25(OH)2D3 inhibuje kolagenem mRNA během proliferační fáze dlouhodobých kultur krysa primární osteoblastické buňky a zabraňuje tvorbě mineralizované kosti, uzliny těmito kulturami . Tyto studie ukazují, že 1,25 (OH) 2D3 inhibuje diferenciaci osteoprogenitorů, které tvoří mineralizované uzliny v primárních kulturách osteoblastických buněk potkanů . Inhibice tvorby uzlů 1,25 (OH) 2D3 však může být sekundární k potlačení syntézy kolagenu typu I v kulturách.
na rozdíl od inhibiční účinky popsané výše, 1,25(OH)2D3 přechodně stimuluje kolagen a noncollagen syntézu bílkovin (asi dvojnásobně), což vrcholy mezi 12 a 24 h, v imortalizované myší buněčné linie osteoblastů MC3T3-E1 . V této studii nebylo hlášeno procento kolagenu syntetizovaného kulturami (kolagen ve vztahu k celkové syntéze proteinů) ; v důsledku toho nebylo možné určit selektivitu účinku 1,25(OH)2D3 pro syntézu kolagenu. 1,25 (OH) 2D3 také zvyšuje expresi kolagenu v lidské osteoblastické buněčné linii osteosarkomu MG-63 A primárních kulturách lidských osteoblastických buněk . Zajímavé je, že zvýšení kolagenu syntézu 1,25(OH)2D3 v MG63 buněk je blokován inzulín-jako růstový faktor vázající protein 5, která interaguje přímo na VDR a zabraňuje heterodimerization s retinoid X receptor RXR . V jiných studiích však bylo prokázáno, že 1,25 (OH) 2D3 snižuje procentuální syntézu kolagenu v buňkách MC3T3-E1 . MC3T3-E1 a MG-63 představují preosteoblastic buňky, které podstupují in vitro osteogenní diferenciace s kyselinou askorbovou; 1,25(OH)2D3 inhibuje růst buněk a zvyšuje osteokalcin exprese a aktivity alkalické fosfatázy v obou buněčných liniích. Buňky MC3T3E1, stejně jako většina zvěčněných osteoblastických buněčných linií, vykazují významnou fenotypovou variaci . Proto některé z těchto rozporných výsledků mohou být způsobeny změnami v buňkách použitých pro experimenty. Souhrnně tato data naznačují, že 1,25(OH)2D3 může působit jako diferenciační hormon na začátku buněk osteoblastické linie, což vede ke zvýšení kolagen typu I výrazu. Naproti tomu 1,25 (OH) 2D3 inhibuje expresi kolagenu typu I u zralých osteoblastů.
