Transformace vzpurné pesticidů látky chlordekon tím, Desulfovibrio sp.86 s přechodem od dechlorace otevírající prstenec k redukční sulfidační aktivitě

izolace Desulfovibrio sp.86

izolace Desulfovibrio sp.86 bylo dosaženo z konsorcia 865 degradujícího chlordekon za použití podmínek snižujících síran. Jako bakteriální konsorcium 86, který je schopen přeměnit látky chlordekon, byl získán z obohacen minerálním médiu (v MM) jmenoval MM + 5, doplněné látky chlordekon, hlavní chemické složení bylo stále ale elektronový dárce a akceptory byly upraveny. Několik médií přípravky používané k obohacení sulfát-redukující bakterie využívají organické kyseliny např. laktát, jako uhlíku a zdrojů energie elektronu (dárce) a síran sodný, který se používá jako eletron-akceptor pro growth15,16,17,18. V této souvislosti byl pyruvát v kapalném médiu MM + nahrazen laktátem a přidán síran (kapalné médium MMD, viz část” metody”). Obohacení bylo rozšířeno na agar MMD a hnědé bakteriální kolonie podobné vibrio (pozorované pod optickým mikroskopem)byly dále čištěny dvěma dalšími pruhy desek (obr. S1). Bylo zjištěno, že izolovaný bakteriální kmen je identický s Desulfovibrio sp.86 z konsorcia 86 na základě 100% identit jejich 16S rRNA genů (každý 1538 bp).

genomová analýza Desulfovibrio sp.86

celý genom se skládá z jediného kruhového chromozomu 3 464 070 bp. CheckM analysis19 provádí s 61 genů a 284 linií ukazuje, že genom patří do Deltaproteobacteria a CheckM Úplnost je 100% (žádné základní marker chybí). Průměrný obsah G + C pro DNA je 58,06%. Celkem bylo předpovězeno 3 342 kódujících sekvencí DNA (CDSs) pro chromozom, 4 pseudogeny a 10 různých RNA (misc-RNA), 3 rRNA operony a 54 tRNA genů.

tři 16S rRNA geny Desulfovibrio sp.86 jsou identické. Jejich nejlepší BLAST hits (NCBI) byly od uncultured Desulfovibrio sp. klony z mikrobiálních palivových článků, jako je MFC63A04 (přístupové číslo Genbank : FJ823865; pokrytí 98%; identita 99,87%)20. Fylogenetický strom s použitím dostupné 16S rRNA kultivovatelných bakterií potvrdil podobnost mezi Desulfovibrio sp.86 a Desulfovibrio simplex DSM4141 (přístupové číslo Genbank 16S rRNA: NR_117110; pokrytí 99%; identita 99, 22%; genomová sekvence není k dispozici) (obr. S2) 21. Na genomické úrovni Desulfovibrio sp.86 se řadí na první místo s Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27,774 genom (GenBank:NC_011883). Nicméně, Desulfovibrio sp.86 sdílí pouze 1 408 genů (43%) S D. desulfuricans (přes 80% identita aminokyselin a 80% pokrytí zarovnání). Kromě toho průměrné nukleotidové identity (ANI) mezi Desulfovibrio sp.86 a sekvenované Desulfovibrio genomy jsou nižší než 95% ani mezní hodnota obecně přijímaná pro vymezení druhů (obr. S3) 22. Tyto výsledky naznačují, že Desulfovibrio sp.86 je s největší pravděpodobností nový druh kmene Desulfovibrio. Přítomnost dvou superoxid dismutáz a jednoho katalázového genu odpovídá jeho relativní toleranci kyslíku. Jak se očekávalo, Desulfovibrio sp.86 genomu vykazuje rozsáhlou genovou doplňkem pro metabolismus síry, zahrnující síry dýchání cesty s anorganické zdroje, jako je síran sodný, vápenatý, bisulfite a tetrathionate jako elektronové akceptory. Organické síry zdroje mohou být poskytovány produkty fermentace síry biomasy (sulfoquinovose z sulfoquinovosyl lipidy) sulfoacetate, síry non-proteogenic aminokyselina taurin přes sulfoacetaldehyde, nebo alkanesulfonates23.

Desulfovibrio sp.86 degraduje chlordekon na známé transformační produkty, stejně jako neočekávanou sloučeninu obsahující síru

schopnost degradovat chlordekon izolovaného Desulfovibrio sp.86 kmen byl zkoumán pomocí technik GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) a LC-HRMS (Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry) v podmínkách růstu úspěšně aplikovaných pro Desulfovibrio sp.86 izolace (MMD kapalné médium). Na2S byl použit jako reduktant a anaerobní N2/H2 (98/2; V/V) atmosféra byla aplikována pomocí systému rukavicového boxu. Tyto podmínky inkubace vedla k úplnému vymizení látky chlordekon signál v GC–MS a LC-HRMS, a vyústily v podobné GC–MS a LC-HRMS TP profily jako ty získané s Citrobacter sp.866: monohydrochlordekon A1, pentachlorinden B1, tetrachlorindeny B3-B4 a polychloroindenkarboxylové kyseliny C1-C2 a C3-C4 (obr. 1a,b). V přihrádce systému, bakteriální kultury byla provedena pomocí 100 mL skleněných injekčních lahvičkách s hydrofobní porézní fólie umožňující výměnu plynů a vyhnout se kontaminaci. Tento inkubační stav byl považován za stav “obnovené atmosféry” (RA). V tomto systému, atmosféra byla pravidelně obnovována s N2/H2 (98/2; V/V) a box nebyl termostaticky řízené, takže teplota se pohybovala mezi 25 a 33 °C. Pro lepší kontrolu růstu a degradace podmínky, Desulfovibrio sp.86 kultury byly umístěny v MMD médium pomocí 100 mL skleněné injekční lahvičky uzavřené pryžovou septa, v troubě na 30 °C. Uzavřené lahvičky byly původně propláchne N2/H2 (98/2; V/V) plynu, aby se ujistili, anaerobiosis. Tento inkubační stav byl považován za podmínky “uzavřené atmosféry” (CA).

GC–MS a LC-HRMS sledování ve full-scan módu (libovolné jednotky), z látky chlordekon transformace Desulfovibrio sp.86 v RA podmínky (v přihrádce, anaerobiosis (N2/H2, 98/2, V/V), teplota v místnosti, otevřené lahvičky s porézní film, v MMD střední doplněna 40 mg/L látky chlordekon), a CA podmínky (v troubě, anaerobiosis (původně propláchne N2/H2, 98/2, V/V), 30 °C, v uzavřených lahvičkách, v MMD střední doplněna 40 mg/L látky chlordekon); a identifikace TP F1. a) GC-MS monitorování transformace chlordekonu pomocí Desulfovibrio sp.86 v podmínkách RA. b) LC-HRMS monitorování transformace chlordekonu pomocí Desulfovibrio sp.86 v podmínkách RA. c) GC-MS monitorování transformace chlordekonu pomocí Desulfovibrio sp.86 v CA podmínky. d) LC-HRMS monitorování transformace chlordekonu pomocí Desulfovibrio sp.86 v CA podmínky. In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.

po šestitýdenní inkubaci chlordekonem již nebyl pesticid detekovatelný stejnými analytickými technikami. Současně se objevila jediná neznámá chlorovaná sloučenina s názvem F1. Bylo detekovatelné pouze pomocí GC-MS (25,6 min) (obr. 1c). Stejně jako v dříve hlášených kulturách degradace chlordekonu5, 6 se hlavní transformace chlordekonu objevila během stacionární fáze (obr. 1e). Protože v LC-HRMS nebyl pozorován žádný viditelný chlorovaný vrchol (obr. 1d), strukturální objasnění F1 jsme založili na interpretaci dat GC-MS (obr. 1f). Za předpokladu, že vyšší izotopový vzorec soustředěný na m / z 507.8 obsahoval molekulární iont, předpokládali jsme dva možné neutrální vzorce pro F1, C10Cl10O2H2 a C10Cl10SH2. V-source fragmenty byly velmi podobné těm, které byly pozorovány v polychlorované bishomocubane na bázi struktur, včetně látky chlordekon, hydrochlordecones, chlordecol a mirex5,6,24. Ve skutečnosti izotopové vzory na m / z 201.0, 235.9 a 271.9 pravděpodobně vznikl ze známé in-source bishomokubanové retrocyklodimerace a odpovídal kladně nabitým C5-fragmentům. Srovnání s izotopovými simulacemi omezilo možnost na následující radikálové ionty: + * + · a+·, S n = 0,1. Ta bis-okysličená obecný vzorec ukázalo být vysoce nepravděpodobné, protože je nutná přítomnost gem-diol funkce nebo gem-chlorohydrin skupinu na cyklopentenylový kruh, který musel odolávat drsnému GC chromatografické podmínky (> 200 °C). Místo toho jsme dospěli k závěru, že část síry, tj. thiolová funkce byla pravděpodobně přítomna na polycyklu bishomokubanu. Pro F1 jsme navrhli strukturu znázorněnou na obr. 2a a navrhl název chlordektiol, sírový Analog chlordekolu(chlordekonový alkohol).

Syntéza chemických standardní chlordecthiol a jeho úplné charakterizaci. a) schéma chemické reakce syntézy chlordektiolu a posunů NMR v CD2Cl2: 1H NMR shift, kurzívou a podtrženo a 13C NMR shift, tučně; podobně barevné kruhy označují ekvivalentní atomy uhlíku. (b) m/z simulace C10Cl10O2H-, (c) m/z simulace C10Cl10SH-, (d) extrahovaný vysokým rozlišením hmotnostní spektrum syntetických chlordecthiol v negativním módu (LC-HRMS).

Syntéza chlordecthiol standardní a potvrzení, že transformace produktu F1 je totožný s chlordecthiol

Za účelem potvrzení struktury F1, standardní chlordecthiol byl chemicky syntetizován a plně charakterizovány. K dosažení chemické reduktivní sulfidace chlordekonu byly zapotřebí dva kroky. První spočívala v konverzi gem-diol funkce látky chlordekon v rovnováze s odpovídající keton form20,25 do sirných analog, tj. gem-thiol/thiocarbonyl skupinu. K provedení tohoto kroku se obecně použijí činidla obsahující síru obsahující26,27. Zde jsme použili fosforu decasulfide (P4S10), nazývaný také Berzelius reagent27,28 podle protokolu Zaidi a spolupracovníky, kteří úspěšně syntetizován camphorthiol29 (Obr. 2a). Druhý krok spočíval v redukci Gem-thiolového meziproduktu za použití NaBH4. Po čištění byla získána bílá pevná látka v celkovém výtěžku 73% (obr. 2a). 1D – a 2D-NMR analýzy potvrdily chlordecthiol struktura: (i) dva 1H signály integrující každý pro jeden proton a spolu dohromady (δ 3.78 ppm, d, J = 5.5 Hz a δ 2.01 ppm, d, J = 5.5 Hz), s jedním na δ 3.78 ppm souvisí s 13C signálu posunutého hřiště (δ 55.1 ppm) v HSQC experiment, který perfektně účet na CH skupinu vedle thiol funkce a (ii) celkem šest viditelné 13C signály odrážející rovinou symetrie zachovaná v současné bishomocubane strukturu (Obr. 2a, obr. S19-23). Ačkoli při mikrobiální transformaci nebylo možné F1 detekovat pomocí nástroje LC-HRMS ve vyvinutých podmínkách, koncentrovaný vzorek syntetického standardního chlordektiolu poskytl významný signál. Byla potvrzena přítomnost atomu síry a očekávaného neutrálního vzorce C10Cl10SH2 (obr. 2c, d)a surový vzorec C10Cl10O2H2 byl vyloučen (obr. 2b). Nakonec analýza GC–MS prokázala dokonalou shodu (tj. stejný retenční čas 25,6 min a stejná hmotnostní spektra ve zdroji obr. S6) mezi syntetickým standardem a TP F1, čímž je definitivně přiřazen jako chlordecthiol. F1 skutečně představuje prvního člena nové rodiny chlordecone TPs, který poprvé vlastní atom síry.

schopnost Desulfovibrio sp.86 rozkládat látky chlordekon transformační produkty

Sloučeniny A1, B1, C1-C2 a F1 zástupce ze čtyř rodin, TPs případně vytvořené v přítomnosti Desulfovibrio sp.86 byly syntetizovány podle chemických protokolů, které byly dříve uvedeny6 a zde byly vyvinuty pro F1. Každá z nich byla inkubována v přítomnosti Desulfovibrio sp.86 kultur v podmínkách, u nichž bylo prokázáno, že podporují redukční sulfidaci (uzavřená lahvička; podmínky CA) nebo dechloraci s otvorem kroužku(otevřená lahvička; podmínky RA). Bylo provedeno duální monitorování GC–MS a LC-HRMS všech vzorků.

Po měsíční inkubační pod CA podmínky, 10-monohydrochlordecone A1 byla zcela přeměněna na dva neznámé chlorovaných sloučenin, sotva odděleny pomocí GC–MS (retenční časy: 24.3 min F2 a 24.5 min F3, Obr. 3, obr. S7-S11). Vykazovaly identické hmotnostní spektrum ve zdroji, které bylo velmi podobné vzorci fragmentace F1 (obr. S8). Všechny zjištěné fragmenty ve zdroji mají o jeden atom chloru méně než jejich analogy v hmotnostním spektru F1. Sloučeniny F2 a F3 byly tedy považovány za diastereoizomery 10-monohydrochlordekthiolu (obr. 3c). To bylo potvrzeno chemickou syntézou dvou 10-monohydrochlordecthiol normy od 10-monohydrochlordecone A1 postupem již dříve použita pro syntézu chlordecthiol F1 (Fíky. S24-27). Tyto chemické normy měly stejné retenční časy (24,3 a 24,5 min) a stejná hmotnostní spektra ve srovnání s biologickými F2 a F3 (obr. S8). TPs B1, C1-C2 a F1 zůstaly nezměněny i po šestiměsíční inkubaci s Desulfovibrio sp.86 za podmínek CA.

Osudy látky chlordekon transformačních produktů s Desulfovibrio sp.86 v závislosti na inkubačních podmínkách. a) přeměna chlordekonu za podmínek RA a b) za podmínek CA. Transformace (c) A1, (d) F1, (e) B1 A (f) C1–C2.

Po šesti-měsíční inkubační pod RA podmínky, chlordecthiol F1 byl částečně převedeny do 10-monohydrochlordecthiols F2 a F3, a další dva neznámé chlorované druhy detekovány pomocí GC–MS, s názvem F4 (retenční čas: 17.9 min) a F5 (retenční čas: 26.6 min) (Obr. 3d, obr. S12). Žádná z těchto dvou sloučenin neposkytla žádný detekovatelný signál v LC-HRMS. GC-MS analýza umožnila navrhnout C10Cl6SH4 jako surový vzorec pro F4 (obr. S14) a C11Cl10SH4 pro F5 (obr. S15). Methyl chlordecsulfid byl chemicky syntetizován a plně charakterizován NMR (obr. S28-31). Dokonalá korespondence retenčních časů GC a hmotnostních spekter GC methyl chlordecsulfidu a biologického F5 (obr. S13) potvrzuje svou předpokládanou totožnost. Pozoruhodné je struktura F5 (obr. 3d) představuje S-methylovanou formu F1. Přesná povaha F4 zůstává jasná (viz doplňkový Text SI). Všechny ostatní TPs zůstaly za podmínek RA nezměněny.

stručně řečeno, A1 (vznikla v RA podmínky) podstoupil redukční sulfidation jen jako látky chlordekon; v obou inkubační podmínky polychloroindenes (B1 a C1-C2) se nezdá být rozložitelné tím, Desulfovibrio sp.86, zatímco F1 (vyrobená za podmínek CA) by mohla být transformována za podmínek RA (obr. 3).

Vyšetřování inkubační podmínky, které vedou k bakteriální redukční sulfidation

Na otázku, fyzikálně-chemické nebo fyziologické parametry, které ovlivňují transformace drah látky chlordekon v kulturách Desulfovibrio sp.86 bylo zvoleno monitorování GC–MS (přítomnost B1 a F1 jako důkaz RA a CA podmínek).

v původním kapalném médiu MMD byly přítomny dvě anorganické sloučeniny obsahující síru, redukční činidlo Na2S a akceptor elektronů Na2SO4. První série experimentů v uzavřených lahvičkách s náhradou Na2S ostatní redukční činidla, sulfured, nebo ne, cysteinu a titanu(III) citrát (TiCi) led na srovnatelné úrovni chlordecthiol F1 (Tabulka 1). Stopy TP B1 byly také pozorovány ve všech experimentech, včetně na2s, pozitivní kontroly (Tabulka 1).

druhá sada experimentů byla navržena s použitím na2s jako redukčního činidla a alternativních akceptorů elektronů na bázi síry v uzavřených lahvičkách (Tabulka 2). Použití 90% 34S-obohaceného anorganického síranu vedlo k chlordektiolovému produktu vykazujícímu podobnou úroveň obohacení 34S (90% 34S-F1/10% F1, obr. S16). GC-MS analýza kulturního prostoru také odhalila přítomnost H234S a H3C34SH (obr. S16), což ukazuje, že Desulfovbibrio sp.86 vyrábí H2S ze síranu. Tyto plyny byly detekovány v kultivačním prostoru hlavy v podmínkách CA za použití MMD média, zatímco chyběly v kultivačním prostoru hlavy ve stavu RA, který odpovídal atmosféře odkládací schránky (obr. S17). Absence sulfátu Neinhibovala Desulfovibrio sp.86 růst, nicméně to vedlo ke vzniku B1 (Tabulka 2)5. Přemístění síranu siřičitanem, bisulfitem nebo thiosíranem vedlo ve všech případech k tvorbě chlordektiolu F1.

třetí série experimentů s použitím sklenic zkoumala účinek povahy plynné fáze v kontaktu s kulturou. Mezi RA stavu pomocí otevřené lahvičky v přihrádce a CA stavu pomocí uzavřených lahvičkách v troubě, několik parametrů lišily (atmosféra přírody a objem, teplota). Pomocí systému jar včetně několika lahviček, selektivně studujeme vliv obnovy atmosféry na transformaci chlordekonu pomocí Desulfovibrio sp.86 v MMD střední. V každém případě byly otevřené lahvičky s hydrofobními porézními filmy umístěny do nádob, které byly původně očištěny vybraným plynem. Všechny sklenice byly inkubovány při 30 °C. Některé z nich byly propláchnout několikrát, aby napodobit přihrádce systém, zatímco ostatní byly zavřené.

sklenice 1-4 obsahovaly dvě identické otevřené injekční lahvičky naplněné MMD, chlordeconem a Desulfovibrio sp.86 inokulum a jedna negativní abiotická kontrola. Mezi nimi byly dvě sklenice propláchnuty dvakrát týdně, jar 1 s (N2/H2 (98/2; V/V)), jar 2 S N2 (obr. 4a), zatímco sklenice 3 a 4, zpočátku očištěné N2 A (N2/H2 (98/2; V / V)) byly ponechány bez rozpuštění (obr. 4b).

Schematické znázornění plynu-řízené experimenty. a) propláchnuté sklenice, b) nevyplněné sklenice, c) propláchnuté nádoby s Desulfovibrio sp bez obsahu síranů.86 kultur.

poslední dvě sklenice (jar 5 a 6) obsahoval tři otevřené lahvičky naplněné s MMD, látky chlordekon a Desulfovibrio sp.86, plus jedna kultura bez síranu. Tyto sklenice byly zpočátku propláchnuty (N2/H2 (98/2; V / V)) a ponechány bez spláchnutí po dobu 2 měsíců (obr. 4c).

paralelně s nádobami jsou dvě uzavřené injekční lahvičky naplněné MMD bez síranu, chlordekonu a Desulfovibrio sp.86 byly propláchnuty časově syntetizovaným H2S (obr. S4).

Po dvouměsíční inkubaci při 30 °C, TP B1 byl zjištěn v lahvičkách umístěných v zrudl sklenice 1 a 2 (Tabulka 3a), vzhledem k tomu, že TP F1 byl nalezen pouze v lahvičkách umístěných v unflushed sklenic 3 a 4 (Tabulka 3b). U abiotických kontrol nebyl přítomen žádný TP. Ve sklenicích 5 a 6, F1 byl přítomen v obou síran sodný a sulfát-zdarma Desulfovibrio sp.86 otevřené kultury (tabulka 3c). Stejným způsobem Desulfovibrio sp.86 kultury bez síranů, propláchnuté H2S, vykazovaly významné hladiny F1 TP, zatímco v negativní kontrole nebyla pozorována žádná transformace(tabulka 3d).

byl proveden další chemický experiment s cílem posoudit vliv H2S na transformaci chlordekonu. Byl aplikován klasický chemický protokol umožňující tvorbu B A C TPs (chlordekon, citrát titaničitý, vitamin B12, voda). V atmosféře N2 byly získány B A C TPs, avšak v atmosféře H2S byl vyroben pouze A1 (obr. S18).

tyto výsledky jasně ukazují, že tvorba chlordektiolu F1 vyžaduje uzavřený inkubační systém s redukční atmosférou. H2 jako počáteční plynná atmosféra však není povinná, zatímco je vyžadována přítomnost H2S. Chemicky přítomnost H2S zabraňuje procesu dechlorace otevírajícího prstenec.

Environmentální relevance látky chlordekon redukční sulfidation

Jsme znovu šetřeni naše předchozí kolekce Martinik Ostrov látky chlordekon-kontaminovaných vzorcích ze životního prostředí (osm půdy a dvě postele sedimentů), v němž různé úrovně látky chlordekon TPs byl reported6. Mezi román obsahující síru TPs zde uvádí, jsme zjistili značné množství F1 na dvě postele sedimenty vzorky (927 a 928) v koncentraci odhaduje kolem 50 µg/kg 20 µg/kg mokrého sedimentu, v tomto pořadí (Tabulka č. 1). Souběžně údaje o rozmanitosti bakteriální populace vydané z analýzy metabarkódování těchto vzorků (obr. 5, obr. S5) byly zpracovány za účelem obnovení hierarchického shlukování vzorků prostředí podle jejich taxonomického složení6. To bylo si všiml, že sulfát-redukujících bakterií jsou mnohem více přítomny v posteli sedimentech než v jiných prostorů, jako dříve reported30,31,32.

Dendrogram generovány z hierarchického shlukování vzorků životního prostředí podle bakteriální populace rozmanitosti (od R. balíček pvclust v. 1.3-2, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117). Pro každý vzorek prostředí bylo odebráno 200 000 sekvencí a normalizováno. Procento detekovaných kmenů byla zastoupena tady se zaměřením na sulfát redukující bakterie z Deltaproteobacteria třídy, Firmicutes a Nitrospirae kmenů. Červeně je reprezentována nezaujatá (au) p-hodnota a zeleně hodnota pravděpodobnosti bootstrapu (bp). SRB = bakterie snižující síran.