Typ III je kolagen je zásadní pro kolagen jsem fibrillogenesis a pro normální kardiovaskulární rozvoj

VÝSLEDKY A DISKUSE

ES (J-1) buněk (22) byli transfektovaly s cílení vektor obsahující genu Col3a1 genomické DNA fragment, ve kterém promotorové oblasti genu a první exon kódující signální peptid byly odstraněny (Obr. 1A). Cílené klony es buněk byly identifikovány analýzou Southern blot a použity pro injekci blastocysty (obr. 1b Horní). Mutantní myši byly odvozeny ze dvou nezávisle cílených klonů ES buněk a identifikovány analýzou Southern blot (obr. 1b nižší). Proteinová analýza kolagenu ocasu a kůže ukázala, že heterozygotní mutantní myši mají asi 50% snížení kolagenu typu III, zatímco u homozygotních mutantů nebyl detekován kolagen typu III (obr. 1C).

mutantní zvířata byla plodná, ale pouze heterozygotní myši byly fenotypicky normální. Homozygotní mutantní myši vykazovaly průměrnou míru přežití 5% ve věku odstavení, přičemž většina úmrtí nastala během prvních 48 hodin po narození (Tabulka 1). Přesná příčina novorozenecké letality není jasná, protože mrtvá mláďata byla kanibalizována dříve, než mohla být vyšetřena, a lehká mikroskopická histologická analýza živých novorozených homozygotních mutantů nezjistila žádnou hrubou abnormalitu. Dospělý homozygotní mutantní myši se objevil normální, s výjimkou, že jsou o 15% menší, než jejich wild-type sourozenci stejného pohlaví (údaje nejsou uvedeny). Průměrná délka života homozygotních mutantních myší však byla asi 6 měsíců nebo jedna pětina normální délky života. Pitva ukázala, že prasknutí krevních cév bylo hlavní příčinou zkrácené životnosti těchto myší (Tabulka 2). Místa prasknutí byla sporadická a většinou spojená s velkými krevními cévami. Byla provedena histochemická analýza, aby se zjistila vada, která způsobila křehkost stěny krevních cév. Obr. 2 A A B ukazují průřez normální břišní aorty. Stěna aorty se skládá z intimy a médií (obr. 2A, šipka) a adventitia (obr. 2 A A B, šipky). Médium se skládá z elastických vláken (obr. 2B, velké šipky) a buňky hladkého svalstva (obr. 2B, malé šipky) a poskytuje elasticitu aorty, zatímco adventitia obsahuje většinou kolagenové fibrily typu I a omezuje dilataci aorty. Obr. 2C ukazuje průřez pitevní aneuryzmy břišní aorty od homozygotní mutantní myši. Prasknutí překročil média (šipka), což vedlo k plné krve channel (star) mezi media a adventitia (šipky) a částečně se zhroutil lumen aorty. Adventitia nakonec praskla jinde a krev unikla do peritoneální dutiny, jako je tomu u lidí se smrtelnou aneuryzmou aorty (20). Celkové uspořádání elastických vláken a buněk hladkého svalstva (obr. 2D) byl podobný jako u ovládacích prvků (obr. 2B). Intenzita a distribuce materiálu extracelulární matrice a tmavší barvení v adventitii a mezi elastickými vlákny a buňkami hladkého svalstva v intima mutantních myší (obr. 2D) byly srovnatelné s kontrolami divokého typu (obr. 2B). Pod světelným mikroskopem nebyly pozorovány žádné zjevné vady srdce a středně velkých a malých tepen u mutovaných zvířat(údaje nejsou uvedeny).

kromě aneurysma, mutantních myších ukázaly, časté střevní rozšíření a občasné střevní prasknutí, což vede k smrti (Tabulka 2). Asi 60% homozygotní mutantní myši zobrazí kožní léze, z nichž nejtěžší prezentována jako otevřená rána, z ≈1 cm délky v oblasti ramen, které zcela pronikla do pokožky a vystaveny podkožní tkáně (Obr. 3). Rány nebyly způsobeny bojem mezi zvířaty, protože byly pozorovány u zvířat v kleci odděleně. Světelná mikroskopická analýza kůže, střeva a dalších vnitřních orgánů včetně jater a plic nezjistila zjevnou abnormalitu u mutantních zvířat (údaje nejsou uvedeny).

pro definování strukturálních defektů u mutantních zvířat byly provedeny elektronové mikroskopické analýzy aorty a srdce. Obr. 4 ukazuje, že kolagenové fibrily umístěné mezi buňkami hladkého svalstva nebo mezi buňkou hladkého svalstva a elastickými vlákny (obr. 4A, šipky) chyběly nebo byly vážně sníženy v médiu mutantní aorty (obr. 4B, šípy). Nejvýrazněji v adventitii, kde je většina kolagenu typu I, byl průměr kolagenových fibril mutantní aorty vysoce variabilní (porovnejte obr. 4 D až C). Když fibril byly počítány a průměr těchto vláken měřená v dané oblasti adventitia, zjistili jsme, že počet vláken v mutanti byla snížena na přibližně jeden-třetina z wild-type, zatímco střední průměr vláken v mutanti byl přibližně dvakrát větší než u wild-type myší (Obr. 5). Podobné aorty, kolagenních fibril, mezi epikardu a myokardu byly sníženy nebo chybí a mikroklky z epikardu byly rozvinuty v centru mutantních myší (údaje nejsou uvedeny).

kromě kardiovaskulárního systému byla kůže, střeva, játra a plíce mutantních myší vyšetřena elektronovou mikroskopií. Stejně jako u adventitie aorty fibriluje kolagen I v mutantní kůži (obr. 4F, šípy a šípy) byly dezorganizované a měly vysoce variabilní průměr ve srovnání s průměrem myší divokého typu (obr. 4E, šipky). Tato změna byla také pozorována u jater a plic mutantních myší (údaje nejsou uvedeny). Navíc, vlákna kolagenu jsou chybí nebo velmi snížil v podslizničního vaziva a blány z mutant střeva (údaje nejsou uvedeny) vyplývá, že vlákna kolagenu v těchto oblastech jsou většinou typ III vlákna kolagenu.

Předchozí studie zavedení cílených mutací v Col1a1, Col2a1, Col5a2, a Col9a1 geny přinesly důležité poznatky do funkce těchto kolagenů (24-27). Zde ukazujeme, že kolagen typu III má rozhodující roli ve fibrillogenezi, která je důležitou součástí vývoje takových orgánů, jako je kardiovaskulární systém, střevo a kůže. Nedostatek kolagenu typu III narušil fibrillogenezi a vedl k vadnému vývoji a funkčnímu selhání těchto orgánů. Za fyziologických podmínek, kolagenu typu III je nejen nezbytnou složkou vláken v tkáních, jako jsou média z aorty, ale také důležitým regulačním prvkem v kolagenu typu I fibrillogenesis. Naše výsledky naznačují, že typ III kolagenu, reguluje průměr vlákna kolagenu typu I, který slouží jako mechanismus pro uspokojení fyziologických požadavků různých tkání nebo tkání v různých vývojových stádiích. Fenotyp kolagenu typu III deficientní myši podobá klinické projevy Ehlers–Danlosův syndrom typu IV u pacientů, u nichž smrt výsledků z cévní nebo střevní prasknutí (20). Tyto mutantní myši by se proto měly ukázat jako dobré zvířecí modely pro pochopení tohoto onemocnění a případně testování terapeutických přístupů.