(a) den seksuelle livscyklus for Chlamydomonas reinhardtii består… / Hent Videnskabeligt Diagram

… arten af de genetiske stoffer, der trodsede Mendels lov. Omfattende undersøgelser i løbet af det sidste århundrede ved hjælp af adskillige teknikker, herunder elektronmikroskopi, genetik, molekylærbiologi og biokemi, har afsløret, at de genetiske stoffer faktisk er genomer inden for kloroplaster og mitokondrier (1991; Birky 1995). Kloroplaster (cp) og mitokondrier (mt) menes at være opstået fra forfædres endosymbiotiske forhold mellem nukleerede celler og frie levende bakterier-henholdsvis cyanobakterier og alfa – lilla bakterier. De indeholder deres egne genomer, som formodentlig er rester fra deres forfædre (grå 1992). I dag ved vi, at CP-og mt-gener overføres til afkom udelukkende fra moderens forælder i de forskellige takser af højere planter, bregner, moser, alger (Kuroiva 1991), svampe (Mitchell og Mitchell 1952; Kavano et al. 1987), og dyr (Hutchison et al. 1974), herunder mennesker. Den uniparental arv af cp / mt genomer blev længe anset for at være et passivt resultat baseret på det faktum, at æg indeholder flere antal organeller, mens mandlige kønsceller i bedste fald kun bidrager med få (Gyllensten et al. 1991). Imidlertid vil processen med uniparental arv sandsynligvis være mere dynamisk. Et klassisk og slående eksempel ville være forekomsten af ikke-Mendelsk arv i de encellede grønne alger, Chlamydomonas reinhardtii , der producerer kønsceller i identiske størrelser (isogamous) (Sager 1954). Livscyklussen for C.reinhardtii er udsøgt enkel. Der er to parringstyper af C. reinhardtii , parringstype plus (mt+) og parringstype minus (mt ), kontrolleret af en enkelt kompleks parringstype loci på koblingsgruppe VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii gennemgår en seksuel livscyklus, som omfatter definerede stadier af differentiering (Figur 1). Vegetative celler differentierer sig til kønsceller under betingelser med kvælstofsult og lysbestråling (Pan et al. 1996). Inden for få minutter efter at være blandet, kønsceller af modsatte parringstyper klæber til hinanden ved deres flagella og smelter sammen for at danne gygoter. Efter en obligatorisk hvileperiode gennemgår gygoten meiose og spiring for at producere fire haploide afkom. Mere end 90% af afkommet, der dannes, arver chloroplast (cp) træk, fortrinsvis fra mt + – forældrene, et fænomen, der først blev beskrevet for mere end 50 år siden (Sager 1954). Sager beskrev arvemønstrene for to UV-inducerede mutationer, sr1 og sr2 . Sr1-mutationen giver resistens over for lave niveauer af antibiotikumet streptomycin, og sr2-mutationen giver resistens over for høje niveauer af streptomycin. Da sr1 blev krydset til en streptomycinfølsom stamme, blev lave niveauer af streptomycinresistens arvet efter Mendels lov. I modsætning hertil, når en mt+ – forælder, der bærer sr2-mutationen, blev krydset til en følsom mt-forælder, var alle de meiotiske afkom resistente over for høje niveauer af streptomycin. I det gensidige Kors var det meiotiske Afkom alle streptomycinfølsomme (Sager 1954). I 1962 kom bevis for eksistensen af cpDNA fra lys og elektronmikroskopisk arbejde af Ris og Plaut (Ris og Plaut 1962). Bare et år senere beskrev Sager og Ishida isoleringen af cpDNA ved cæsiumchlorid (CsCl) densitetsgradientcentrifugering (Sager og Ishida 1963). I 1989 blev sr2-mutationen vist at lokaliseres inden for rps12-genet i cp-genomet (Liu et al. 1989). I 1972 viste en biokemisk undersøgelse, at mængden af mt – cpDNA faldt i forhold til mt + cpDNA, 6-24 timer efter parring (Sager og bane 1972). DNA ‘ et fra mt+ og mt – gameter blev mærket med enten 14 N – eller 15 NH 4 Cl, og CSCL – densitetsgradientcentrifugering blev brugt til at overvåge skæbnen for nukleart DNA og cpDNA i 6-og 24-h-gsygoter. Signal, der repræsenterer mt-cpDNA, var klart lavere end mt+ cpDNA, hvilket indikerer en præferentiel reduktion af mt – cpDNA i forhold til mt+ cpDNA. I 1980 blev det første molekylære bevis for den præferentielle reduktion af mt – cpDNA leveret af Grant et al. (Grant et al. 1980). Forfatterne overvågede opførelsen af mt+ og mt – cpDNA ved at drage fordel af restriktionsfragmentlængdepolymorfier (RFLP ‘ er) i en C. reinhardtii mutant stamme ac-u-g-23, der bærer to små sletninger i dets chloroplast-DNA. Forfatterne fandt ud af, at både sletningerne i cpDNA og den ikke-fotosyntetiske fænotype blev arvet ensartet. 203-kb chloroplastgenomet af C. reinhardtii (Maul et al. 2002) er til stede ved ~80-100 kopier pr. celle og er organiseret i 5-10 DNA–proteinkomplekser, der kaldes chloroplastnukleoider. 1981). I 1982, Kuroiva et al. fandt, at DAPI (dsDNA-specifik fluorochrom,4’, 6-diamidino-2-phenylindol) – farvede mt-CP-nukleoider forsvandt fortrinsvis i unge gygoter inden for 50 minutter efter parring. 1982). I 1999 blev den præferentielle forsvinden af mt-cp-nukleoider observeret i en levende kindtand ved anvendelse af SYBR Green i (dsDNA-specifik fluorokrom, der kan trænge ind i levende celler) (Figur 1) (Nishimura et al. 1999). Fortolkningen af dette dramatiske fænomen var imidlertid kontroversielt, fordi den præferentielle forsvinden af fluorescerende mt – cp-nukleoider forekom længe før DNA-reduktion blev påvist ved biokemiske eller molekylærbiologiske metoder (6-24 timer efter parring) (Sager og Lane 1972). To primære muligheder blev foreslået for at forklare dette. En mulighed var, at opløsningen af CP-nukleoider kunne føre til spredning af cpDNA-molekyler, og den anden mulighed var, at den hurtige fordøjelse af cpDNA-molekyler kunne føre til forsvinden af cpDNA-nukleoider. Et problem med at løse dette spørgsmål er, at parringsreaktionen udføres ved hjælp af millioner af mt+ og mt – gameter (figur 2). Cellepopulationen er uundgåeligt en heterogen blanding af celler, såsom umaterede mt+ og mt – gameter, gygoter med eller uden mt – cp-nukleoider og ekstraordinære meitotiske gygoter (1~5%), der ikke danner meitotiske gygoter (Ebersold 1967). Generelt, molekylære og biokemiske metoder kræver store mængder homogene prøver til præcise analyser, og enhver heterogenitet i prøverne ville forvirre resultaterne. Med andre ord ville “personlighederne” af individuelle celler eller organeller i en population blive fortyndet og sandsynligvis tabt i analyseprocessen. På den anden side kan mikroskopi afsløre “personlighederne” på det morfologiske niveau, men ikke på molekylært niveau. For at studere tilstanden af cpDNA-molekyler under forsvinden af mt-CP-nukleoider var det nødvendigt at indsamle gygoter baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af mt – CP-nukleoider og at analysere de enkelte gygoter ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker. For at opnå dette blev der anvendt optiske pincet (figur 3). Brugen af optisk pincet er en ny teknik til manipulation af levende celler eller organeller under direkte mikroskopisk observation (Ashkin et al. 1987). Med eller uden CP – nukleoider blev opsamlet ved hjælp af optisk pincet, og tilstedeværelsen eller fraværet af mt-cpDNA-molekyler blev bestemt ved indlejret PCR-analyse. De individuelle skæbner af mt+ og mt – gygotisk cpDNA blev fulgt separat under anvendelse af et chloroplasttransformant LO3c, som huser bakteriegenet Aada (aminoglycosid adenyltransferase). De enkelte gygoter, der blev opnået med den optiske pincet, blev udsat for meget følsom indlejret PCR-analyse for Aada (figur 4)(Nishimura et al. 1999). Når l03c mt + – kønsceller blev krydset med vildtype mt-kønsceller, Aada – gensekvenser blev påvist i alle de gygoter, der blev undersøgt. Tværtimod, da l03c mt – gameter blev krydset med vildtype gameter, blev aadA-sekvenserne kun forstærket i yngre gygoter (10 og 30 minutter efter dannelse af gygote). Efter at de fluorescerende mt-cp-nukleoider forsvandt, blev Aada-sekvenserne ikke længere detekteret i gygoterne (90 og 120 minutter efter dannelse af gygot). Disse resultater indikerer, at mt – cpDNA – molekylerne fordøjes fuldstændigt i 10 minutter, hvor mt – cp-nukleoiderne forsvinder, og også at mindst en meget effektiv nuklease aktiveres i mt-chloroplasten lige efter dannelsen af gygot. Denne aktive fordøjelse af mt-cpDNA er sandsynligvis grundlaget for moderens arv af cpDNA. Den enkleste model for uniparental arv af cpDNA er, at processen består af to forskellige begivenheder, der sandsynligvis vil forekomme på forskellige stadier af livscyklussen: en “beskyttelse” af mt+ cpDNA, måske under gametogenese, og en “ødelægger” af ubeskyttet mt – cpDNA under tidlig udvikling. I 1972 foreslog Sager og kolleger, at mt – cpDNA blev fordøjet af virkningen af restriktionssymmer, mens mt+ cpDNA blev beskyttet af methylering – en model, der var analog med det bakterielle restriktions-methyleringssystem (Sager and Lane 1972). Sager og kolleger akkumulerede hurtigt overbevisende beviser, der viser en stigning i methyleringsniveauet for mt+ cpDNA, som blev påvist 7 timer efter parring (Burton et al. 1979; Royer og Sager 1979; Sano et al. 1980). Desuden er oprensningen af mt+ gamete-specifikke DNA-methyltransferaser med molekylvægte på 60 kDa og 20 kDa rapporteret (Sano et al. 1981). Denne mt + gamete-specifikke methyleringshændelse var tilsyneladende reversibel, som man kunne forvente for beskyttelse (Sano et al. 1984). Genet for den chloroplast-residente DNA-methyltransferase blev endelig identificeret i 2002, og dets mt+ gametespecifikke ekspression og kloroplastlokalisering blev bekræftet (Nishiyama et al. 2002). På den anden side har en række papirer fra uafhængige grupper efterfølgende hævdet, at methylering af mt+ cpDNA ikke kunne forklare beskyttelsen tilstrækkeligt. Bolen et al. isoleret en nuklear mutant me1, der konstitutivt methylerer cpDNA på et højere niveau i både mt+ og mt – celler (Bolen et al. 1982). Når me1-kønsceller blev brugt til kryds, normale uniparental arvemønstre blev observeret, uforenelig med …