Alpha CETSA vidensdatabase

• CETSA karrus
• Target/prøve typer
• Cetsa karsassay betingelser
• Alpha cetsa Kars Immunoassays
• Cetsa Kars Data Analyse og fortolkning

ansvarsfraskrivelse: kun til forskning brug. CETSA er et registreret varemærke tilhørende Pelago Bioscience AB. Bemærk, at der kræves et gyldigt cetsa-abonnement til brug af kit.

selve cetsa-kursmetoden

spørgsmål : Hvad er CETSA-kur?

A : Det cellulær termisk Skift Assay er en metode, der tillader kvantificering af en forbindelses Målengagement (TE) i levende celler eller i forstyrrede celler. Cetsa-analyseprincippet er baseret på ændringen i termisk denatureringsprofil af målproteinet, der opstår efter bindingen af en forbindelse. Cetsa-analysen udføres ved at inkubere cellerne med testforbindelsen efterfulgt af opvarmning af de sammensatte behandlede celler og derefter ved at måle det resterende opløselige målprotein.

spørgsmål: Hvad er termisk Skift

A: Ved opvarmning vil et protein støde på en temperatur, hvor det denaturerer (undertiden benævnt smeltepunktet). Denne smeltetemperatur er en fysisk egenskab og en konstant for et givet sæt betingelser (pH, tryk, salte). Forbindelser, der interagerer med et protein, ændrer smeltetemperaturen (termisk skift). For et givet bindingssted inden for et protein kan størrelsen af det termiske skift måles ved forskellige forbindelseskoncentrationer (dosis-respons), og EC50-værdierne afledt af sådanne kurver kan bruges til at etablere en rangordningsrækkefølge for styrken af en række forbindelser, som direkte korrelerer med rangordningsrækkefølgen for Forbindelserne . Der er flere variationer på In vitro termisk Skiftassay, men nøgleteknikken blev først beskrevet af Semisotnov et al. (1991). Ved denne metode udsætter det smeltende og udfoldede protein hydrofobe overflader, der gør det muligt for SYPRO orange at binde. Dette farvestoffer fluorescens slukkes i vand, så bindingen til disse hydrofobe overflader vender dette og får fluorescens til at toppe, når proteinet er fuldt udfoldet. Denne type termisk Skiftassay kan kun anvendes på stærkt oprensede proteiner, og for arter med lav overflod kan dette betyde, at der kræves et overekspressionssystem for at generere tilstrækkelige mængder.

Termofluor – temperaturfølsomt farvestofsystem (ved hjælp af Sypro Orange)

Differentialscanning fluorimetri (DSF) – alternative farvestofbaserede metoder

kvantitative PCR-systemer (f. eks. Roche Light cycler) : disse bruges til at levere opvarmningsbegivenheden og kan måle fluorescensændringer

Nanotemper – er et firma, der fremstiller dedikeret instrument, der opvarmer prøven og måler fluorescensen. Det giver bedre ydelse end de tilpassede PCR-systemer.

spørgsmål : Hvorfor er det vigtigt at måle Målengagement?

A : i mangel af bekræftelse af, at en forbindelse faktisk interagerer med det ønskede mål, kan lægemiddeludviklere miste dyrebar tid og ressourcer, der bevæger sig i den forkerte retning. Af den grund er bekræftelse af en forbindelses Målengagement længe blevet betragtet som væsentlig i lægemiddelopdagelse. Sådanne analyser muliggør direkte sammenligninger af en forbindelses affinitet for dens mål, som sådan er det en vigtig foranstaltning at vælge, hvilke forbindelser der skal gå videre i alle faser af blygenerering og optimering. Fordi Målengagement kan korreleres med affinitet, gør det det muligt for forskere at vælge forbindelser, der har de højeste affinitetsværdier. Som sådan er det en yderst nyttig foranstaltning til at sikre den korrekte sammensatte prioritering på hvert trin i lægemiddelopdagelsesprocessen.

spørgsmål: Hvordan adskiller CETSA Karra sig fra andre termiske Skiftanalyseteknologier?

A: ved siden af cetsa Kris er der adskillige metoder til vurdering af Målindgreb (f.eks. Overfladeplasmonresonans, Fluorescenspolarisering og termisk Skift). Imidlertid er alle disse metoder afhængige af, at oprenset protein er tilgængeligt og kun kan anvendes in vitro, hvilket betyder, at de afledte affinitetsværdier muligvis ikke er forudsigelige for faktisk affinitet eller bindingspotentiale i levende celler. At være i stand til at køre termiske Skiftassays i en relevant cellulær kontekst, hvor proteinet er i sit oprindelige miljø, i nærværelse af dets naturlige partnerproteiner, med fysiologiske koncentrationer af dets cofaktorer og substrater, giver meget mere relevante data, der bedre kan oversættes til dyremodeller og kliniske forsøg.

mens det cellulære termiske Skiftassay er en metode baseret på det samme biofysiske princip som standard termiske skiftassays (dvs.at specifikke proteiner denaturerer ved en bestemt temperatur), måler den ikke direkte den specifikke temperatur for udfoldning, men er i stedet afhængig af det faktum, at tilstedeværelsen af en forbindelse på proteinet vil påvirke mængden af opløseligt protein, der er til stede efter opvarmning til en bestemt temperatur. Som sådan er CETSA karrus i det væsentlige et totalt proteinassay udført efter en bestemt opvarmningsbegivenhed. Forbindelser med forskellige målengagementstyrker vil ændre de relative mængder protein, der overlever opvarmningsbegivenheden. Fordi analysen måler dette restprotein snarere end den faktiske smeltehændelse, kan det anvendes på mere komplekse in vivo-systemer såsom celler og lysater (og i nogle cetsa-larsatformater endda fast væv). Derudover kan CETSA karrus identificere forbindelser, der destabiliserer et protein (dvs.reducere dets smeltetemperatur), dette er mindre ligetil med de andre termiske skiftmetoder.

e: Hvordan adskiller Alpha cetsa Lars sig fra andre cellulære termiske Skiftanalyseteknologier eller andre cellulære Målengagementanalyser?

A: som nævnt ovenfor er CETSA karrus dybest set et totalt proteinassay udført efter varmechok. Alpha cetsa karrus bruger et dobbelt antistof nærhedsbaseret detektionssystem. Andre metoder undgår brugen af et antistofbaseret system ved at modificere målproteinet:

• Promega nanoluciferase thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc Luciferase fusioneret til målproteinet (rekombinant udtrykt protein); Når proteinet mål med Nanoluc tag aggregater, vil luciferasesignalet falde.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : Luciferase Fusion Tag kombineret med mærkede sporforbindelser, som, når de er tæt på luciferasen, vil føre til bioluminescens resonans energioverførsel (BRET). Forbindelse binding i samme lomme vil fortrænge sporstof og BRET signal vil falde. Dette er ikke en varmechokmetode.
• Opdag InCELL Pulse : baseret på EFC-teknologi : et lille fragment af et donorfragment af karrusol-galactosidase (karrusol-gal). Et tilsat reporterprotein vil binde til dette fragment for at rekonstituere et aktivt stof, som hydrolyserer et substrat og genererer et kemiluminescerende signal, der tillader kvantificering af proteinoverskud. Efter varmedenaturering vil proteinet aggregere og begrænse adgangen til den større luciferase-komponent til sin partner på proteinmålet.

nøgleforskellen mellem disse “rekombinante cetsa-Karr” – eller “rekombinante målengagement” – systemer og Alpha cetsa-Karr, er, at de ikke kan anvendes på native og umodificerede celler. Dette har en række negative konsekvenser:

1. mens omkostningerne ved at udvikle et nyt antistofpar og de efterfølgende omkostninger pr.brønd kan være højere end blot at transficere en enkelt cellelinie, er det sandsynligt, at ethvert opdagelsesprogram vil blive testet med en række modelcellelinjer, hver transfektion kommer med sine egne omkostninger, og kloning af de efterfølgende cellelinjer vil tage yderligere uger.
2. generering af et mærket protein vil altid have fysiologiske konsekvenser for cellen, og det mærkede protein kan være (i) overudtrykt (forkert støkiometri vs. partnere), (ii) ikke placeret i det korrekte cellulære rum eller (iii) ikke forbundet med nøglepartnerproteiner og (iv) kan have en anden smelteadfærd end det native protein. Det betyder, at den tilsyneladende virkning af en forbindelse muligvis ikke afspejler dens reelle opførsel i patientens væv. Disse problemer kan forstørres i ethvert midlertidigt transfektionssystem.
3. Luciferasehæmmere kan resultere i falske positive hits.
4. i senere stadier af blyoptimering, når der kræves mere komplekse og fysiologisk mere relevante cellulære modeller (primære, native cellelinjer og væv), er mærkede proteinmetoder simpelthen ikke anvendelige.

spørgsmål: Hvilke oplysninger leverer et cetsa-masseassay?

A: CETSA Kurt giver et unikt mål for en forbindelse ‘på måltilstedeværelse’ og kan betragtes som målbelægning. Denne belægning vil blive påvirket af både forbindelsens evne til at engagere målet og forbindelsens evne til at være til stede på det rigtige sted (dvs. har den den rigtige opløselighed, permeabilitet, metabolisk stabilitet og tilgængelighed i det rigtige cellulære rum). Ikke-cellulære Målengagementanalyser tilbyder målinger af affinitet, der kun korrelerer med proteinets opførsel i meget kunstige miljøer, der ofte bruger oprensede rekombinant udtrykte målproteiner.

spørgsmål: kan CETSA krora bruges til SAR-analysestudier?

A: der er endnu ingen offentliggjorte eksempler, hvor CETSA karrus er blevet brugt til sammensat optimering. Imidlertid, potentialet og anvendeligheden af CETSA Kurt, der skal bruges til SAR-analyse og hit-bekræftelse, blev tydeligt demonstreret af Shav et al. ved sammenligning af data fra cetsa-karrusassayet med almindeligt anvendte biokemiske og cellebaserede analysedata. 2018 SLA ‘ er opdagelse 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). Publikationen viser merværdien af cetsa karrus til screening, hit bekræftelse, og SAR generation for to protein mål: B-Raf og PARP1.

mål – /prøvetyper

spørgsmål: Hvor mange mål er hidtil blevet valideret i cetsa-kur?

A: I CETSA-Karr HT (de fleste er Alfa-Karr , nogle bruger HTRF) er mere end 30 mål blevet valideret med succes, herunder mål med nuklear, mitokondriel, cytoplasmatisk og plasmamembranlokalisering.

mere end 100 mål er blevet valideret indtil videre i cetsa Kristian Classic (vestlig Blot-baseret detektion).

CETSA Kurt m/s genererer information for 6000 til 7000 mål på en gang.

spørgsmål: kan alle målproteiner testes i cetsa-kur?

R: nogle mål er “blinde” i cetsa krist , dvs. forbindelse binding vil ikke ændre deres termiske stabilitet. Dette kan ske, når proteinet har flere domæner, og forbindelsen er kun bindende til et domæne, og hvis stabilisering af dette enkelt domæne Ikke globalt påvirker den termiske stabilitet af hele proteinet. Der er et par proteiner, der ikke smelter i typisk temperaturområde, der anvendes i cetsa-kursforsøg.

Pelago har adgang til en stor database med termiske stabilitetsdata fra projekter med massespektrometrisk aflæsning (CETSA-Karr MS), og disse oplysninger tages i betragtning, når Pelago vurderer “CETSA-Karr-biliteten” af et proteinmål, inden der udvikles et Alfa-Karr-Karr-assay. Kontakt venligst Pelago for at anmode om sådanne oplysninger.

spørgsmål: er GPCR ‘ er modtagelige for CETSA-kr ?

A: et par eksempler på GPCR ‘ er er blevet testet i CETSA Kurt . Chem Biology 2019) blev der etableret cetsa-klassikerassays for et sæt membranbundne proteiner inklusive et GPCR-proteinmål. En potentiel udfordring med cetsa karrus på GPCR ‘ er kan være begrænset tilgængelighed af antistoffer til påvisning. Derudover kan den integrerede membranlokalisering af GPRC ‘ erne føre til uforudsigelig smelteadfærd.

spørgsmål : hvilken type prøver kan testes i cetsa-kar?

A : Der er eksempler på cetsa-larrus-analyser, der bruger mange forskellige typer matricer, herunder udødelige cellelinjer, primære celler, iPS-celler, patientafledte Pbmc ‘ er, sfæroider, nukleare fraktioner fra dyrkede celler, tidligere behandlet væv, væv fra in vivo dyreforsøg, bakterier, gær, sebrafisk og insekter.

spørgsmål : kan prøverne fryses efter opvarmningstrinnet?

A : Dette er muligt, men dette kræver en validering fra sag til sag, da fryseprocessen kan denaturere nogle proteiner.

spørgsmål: mine celler har brug for kulturpladebelægning med nogle proteiner (f. eks. kollagen eller Matrigel); er der behov for særlig pleje for at undgå prøveforberedelse?

A: Vi har ikke stødt på nogen problemer med celler dyrket på coatede plader.

Cetsa-assaybetingelser

spørgsmål: Hvad er de typiske Alfa-cetsa-optimeringspunkter for masseanalyse?

A: hvis man starter fra bunden, skal immunanalysen først udvikles og optimeres. Det er vigtigt og umagen værd at investere i at udvikle et meget følsomt Alfa-assay, da det vil gøre det muligt at reducere celletallet pr. Fordi cetsa-cholesterol-analysen ødelægger en del af proteinet, der skal detekteres, er der typisk behov for flere celler/brønde i et cetsa-cholesterol-assay sammenlignet med andre cellebaserede assays. Der henvises til PerkinElmer guides for alpha assay development for, hvordan man går videre og for nyttige tip, og til cetsa-værktøjskassehåndbøgerne, hvis du bruger værktøjskassen (anti mouse ig anti rabbit ig beads) tilgang.

så omfatter cetsa-analyseoptimeringspunkterne:

• titrering af Celletæthed
• valg af cellelysbuffer
• inkubationstid for celler med testforbindelsen
• temperatur til inkubation af celler med testforbindelsen
• etablering af smelte-og skiftkurver
• valg af temperatur til isotermiske dosis-responsforsøg
• arbejdsgangs-og automatiseringsindstillinger

spørgsmål: hvorfor leveres forskellige cetsa-LARP-cellelysbuffere, og hvad er virkningen af at bruge forskellige cellelysbuffere?

A: Lysisbufferen er vigtig med hensyn til flere aspekter af analysen. Dens rolle er multiple: lysering af cellerne og potentielt frigør målproteinet fra partnerproteiner, der kan forstyrre antistofgenkendelse, for at gøre målet tilgængeligt til påvisning af antistofferne; stabilisering af målproteinet for at gøre analysen stabil; undgå eller minimere potentiel epiturbance-effekt; tilvejebringelse af de rigtige fysisk-kemiske forhold (ph, ionstyrke og natur af salte, vaskemiddeltype og koncentration,…) til immunanalysen, … da forskellige immunanalyser kan have forskellige optimale betingelser, og som forskellige proteinmål, og forskellige celletyper kan have forskellige krav til optimal analyseydelse, gør vi 5 forskellige cellelysbuffere tilgængelige. Disse tilvejebringer en række cellelysebetingelser. Dette betyder dog ikke, at yderligere komponenter kan tilsættes i særlige tilfælde, som yderligere vaskemiddeltyper, for at forbedre yderligere analyseydelse.

spørgsmål: er der proteasehæmmere i cetsa-oprensningscellelysebuffere?

A: cetsa-cellelysbuffere 1, 4 og 5 indeholder nogle divalente kationchelatorer, som forventes at hæmme proteaser, der kræver sådanne divalente kationer for deres aktivitet (f.eks. Udover dette, ingen andre proteasehæmmere er inkluderet i cetsa-larr-cellelysebuffere, da disse generelt ikke er nødvendige for udførelsen af alfa cetsa-larrus-assays. For specifikke celletyper eller vævsprøver kan du dog tilføje typiske proteinasehæmmere, såsom leupeptin.

spørgsmål: Hvad er de typiske smeltetemperaturer?

A: smeltetemperaturen (Tm) er defineret som den temperatur, ved hvilken halvdelen af målproteinpopulationen er blevet denatureret (dvs.i Alfa cetsa-kur, hvor halvdelen af Alfasignalet er gået tabt). Afhængigt af målet, smeltetemperaturer er oftest mellem 40 kg C og 60 kg C, med en gennemsnitlig smeltetemperatur på 52 kg C. nogle proteiner, som membranassocierede proteiner, er normalt mere stabile og kan have en højere smeltetemperatur. Cetsa-analysedata for proteiner med en smeltetemperatur over 65 C-celler kan påvirkes af, at membranpermeabiliteten og celleintegriteten forstyrres, når cellerne opvarmes, hvilket påvirker den fysiologiske betydning af analysen.

efter vores erfaring er smeltetemperaturen målspecifik og afhænger af analysematricen og af den anvendte lysisbuffer.

spørgsmål: forventes Tm at være den samme, når man arbejder med intakte celler og forstyrrede celler?

A: ikke nødvendigvis, som ved forstyrrelse af celler, kan protein-protein-interaktioner, der stabiliserer proteiner, gå tabt, hvilket kan føre til en ændret smeltetemperatur sammenlignet med intakte celler. For et eksempel henvises til Alpha CETSA KURR MEK1 assay data.

spørgsmål: hvilken opvarmningstemperatur skal jeg vælge til test af forbindelser?

A: Til stabilisering af forbindelser anbefales det at vælge den laveste temperatur med det største analysevindue, da det forventes at give det mest følsomme assay (lavere EC50-værdier). For destabiliserende forbindelser anbefales det at vælge den højeste temperatur med det største assayvindue. Temperaturer over 65 liter C kan have indflydelse på den cellulære permeabilitet og reducere betydningen af dataene.

spørgsmål: skal jeg forvente den samme smeltetemperatur i Cetsa Luther Classic (vestlig plet) og Alpha Luther?

A: ikke nødvendigvis: den tilsyneladende smeltetemperatur kan variere mellem begge metoder, fordi detektionsmetoderne er forskellige.

spørgsmål: er det vigtigt at have en streng kontrol med prøveopvarmningstider?

A: Ja Dette er ekstremt vigtigt at kontrollere, da længere opvarmningstider kan resultere i et højre skift af dosis-responskurven (se nedenstående kommentarer om opholdstid). Standard opvarmningstiden er 3 minutter.

forbindelser med kort opholdstid (dvs. høj dissociationshastighedskonstant koff; opholdstid T er lig med 1 / koff) vil adskille sig hurtigere fra målet, når det opvarmes, sammenlignet med forbindelser med lang opholdstid. Derfor forventes EC50-eller ITDRF50-værdien at stige med stigende opvarmningstider. For flere forklaringer på cetsa-kristikteorien se see-Ludlav B, Aksels H, Almkvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundb Kristick T. (2018) kvantitativ fortolkning af intracellulær Lægemiddelbinding og kinetik ved hjælp af det cellulære termiske Skiftassay. Biokemi 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. I teorien kunne detektion af forskellige forbindelsers opholdstider ved målet ved at variere opvarmningstiden være mulig, men der er endnu ingen offentliggjorte rapporter tilgængelige om, at dette er blevet gjort.

spørgsmål: manualen instruerer enten at afkøle på is eller i 3 minutter ved 25 liter C efter varmechoket. Er dette køletrin vigtigt, og er det vigtigt at have en streng kontrol med køletiden?

A: afkøling af prøven sikrer hurtigt, at varmechokfasen styres godt. Blot at lade temperaturerne afkøle uden hjælp ville helt sikkert producere forskellige kølehastigheder i forskellige brønde og påvirke mængden af varmechok leveret til systemet. Kølefasen er ikke så kritisk som opvarmningsfasen, men skal udføres hurtigt og konsekvent.

spørgsmål: må jeg bruge PerkinElmer “biomarkør” og “SureFire” (ikke-cetsa-Kurt ) sæt til at udføre en cetsa-Kurt-analyse?

A: i teorien kan ethvert totalproteinassay være egnet til brug i en cetsa-Kurt-protokol, selvom hvert system skal optimeres og valideres. Imidlertid er cetsa Kurt-metoden patenteret, og der kræves tilladelse fra Pelago Bioscience. Desuden understøttes kun brugen af de udpegede målsæt af PerkinElmer. Brug af værktøjskassesættet understøttes af Pelago Bioscience og er kun tilgængelig for licensindehavere.

spørgsmål: er det muligt at læse Alfasignalet direkte fra PCR-pladen, der bruges til at opvarme prøverne?

R: Dette ville give fordele med hensyn til antal pipetteringstrin, prøveforbrug og let automatisering, men muligheden for at bruge PCR – plader til den fulde proces – fra prøvebehandling til detektion-er endnu ikke påvist. PCR-plader er ofte meget fleksible, hvilket fører til ikke-ensartet signal over pladen eller har ikke de rigtige dimensioner, så de kan håndteres af pladelæsere. Godt til godt cross-talk kan også være et problem i sådanne PCR-plader.

spørgsmål : kan kemisk denaturering (f. eks. ved brug af urinstof eller guanidin) anvendes i stedet for varme?

A: Fordelen ved at bruge temperatur til at levere varmechok er, at det gøres på en stærkt kontrolleret måde, der sandsynligvis vil være konstant mellem prøver og begrænset over en velkontrolleret tidsramme. En kemisk denatureringsproces kan fungere i et oprenset proteinekstrakt; men i det komplekse cellulære miljø, variation i cellevolumen, bufferkapacitet, lipidindhold osv.

da denaturering (opvarmningstid) er kritisk, kan dette være ret vanskeligt at kontrollere, hvis der anvendes kemisk denaturering. Derudover kan varme påføres uden at forstyrre celler, hvilket gør det muligt at teste i reel cellulær sammenhæng. Dette ville ikke være tilfældet med kemisk denaturering, da celler skulle forstyrres for at give måladgang til denatureringsmidlet og derfor miste intracellulære koncentrationer, proteinforeninger osv.. Derfor anbefaler vi ikke at udskifte varmechoket ved kemisk denaturering.

Alpha cetsa-immunoassay

K: Har jeg brug for monoklonale antistoffer, eller kan polyklonale antistoffer også bruges, når jeg udvikler et cetsa-larrus-assay?

A: både monoklonale eller polyklonale antistoffer kan anvendes, afhængigt af antistoffernes kvalitet. Monoklonale antistoffer udgør en fordel med hensyn til stabil reagensforsyning som for enhver anden detektionsmetode, der anvender antistoffer.

spørgsmål: når du bruger polyklonale antistoffer, vil det næste parti fungere på samme måde i en cetsa-reolassay?

A: Det er vores erfaring, at vi aldrig står over for en situation, hvor det næste parti af et polyklonalt antistof opførte sig anderledes i CETSA-analysen sammenlignet med tidligere partier. Imidlertid skal CETSA-re-assayet valideres med det næste parti af det polyklonale antistof.

spørgsmål: er der anden anbefaling til antistofvalg?

A: hvis det er tilgængeligt, skal antistoffer vælges, så de dækker forskellige epitoper af målproteinet for at maksimere chancerne for at finde et passende antistofpar, der vil fungere i Alpha cetsa-kolosassayet.

Antistofpar, der giver stejlere kurver (højere Bakkehældning) og mindre baggrund foretrækkes, da de normalt giver et mere specifikt signal. Lav Bakkehældning kan være tegn på et antistofpars evne til at genkende det genfoldede protein.

spørgsmål: Er Alfa-cetsa-antistoffer kun mod det endogene målprotein eller det endogene målprotein plus bundet lille molekyle?

A: baseret på de hidtil udviklede sæt er antistofferne kun mod proteinmålet.

e: Kan jeg forvente, at detektionsantistofaffiniteter er forskellige mellem bundet og ubundet lille molekyle til målprotein?

A: små molekyler, der påvirker proteinfoldning på epitopsteder, risikerer faktisk at ændre antistofbinding. Dette fænomen kaldes” epiturbance ” og kan være en begrænsning af antistofbaseret-CETSA karrus . Epiturbance observeres generelt ikke i cetsa-klassikeranalyseformatet (vestlig Blotting), da proteinet i dette tilfælde er fuldt denatureret før antistofdetekteringstrinnet.

spørgsmål: kan kun IgG bruges sammen med cetsa-værktøjskassesættene?

A: Faktisk er antistofferne på anti-kanin-og anti-museperlerne specifikke for IgG og ville ikke genkende andre antistofklasser (dvs.IgA, IgM osv.

spørgsmål: er der en fordel ved at bruge Alpha cetsa-Kurt sammenlignet med Cetsa-Kurt-Kurt (vestlig Blotting)?

A: ved siden af større følsomhed af Alpha cetsa-masseanalysen og gennemløbs-og automatiseringsovervejelser på grund af den mulige vanskelighed med at analysere membranproteiner i cetsa-Klassikermetoden, kan Alpha cetsa-massa klare sig bedre for sådanne mål, da det ikke har brug for noget adskillelsestrin.

Cetsa karrus dataanalyse og fortolkning

spørgsmål: hvilke falske positive hits kan opnås i CETSA karrus?

A: den termiske stabilitet af nogle proteiner kan påvirkes efter sammensat behandling, selvom de ikke er direkte bundet af testforbindelsen. Disse indirekte virkninger kan være resultatet af for eksempel proteinphosphorylering, proteinrekruttering af et partnerprotein eller fra generel ændring af cellens tilstand. At køre cetsa-KOLS-analysen parallelt på intakte celler og på forstyrrede celler kan skelne mellem direkte og indirekte effekter, da sådanne indirekte effekter ikke forventes, når cellerne forstyrres, og de metaboliske processer stoppes.

forbindelse assay intereference kan forekomme i Alpha CETSA-Larsen, da forbindelserne er til stede i detektionstrinnet ved en relativt høj koncentration. Dette kan give vildledende resultater, og det er vigtigt at udføre en tællerskærm for at identificere disse forbindelser.

spørgsmål: Hvordan kan target destabilisering fortolkes?

A: Destabilisering kan skyldes forstyrrelsen ved forbindelsesbindingen af et proteinkompleks, der stabiliserede målproteinet. Efter vores erfaring har membranproteiner normalt en højere smeltetemperatur og er temmelig destabiliseret end stabiliseret ved sammensat binding. For kinaser kan det lige så godt skyldes forskydningen af ATP. I et sådant tilfælde kan det være nyttigt at sammenligne resultatet af cetsa-larrus-analyser, når de udføres på intakte celler (fysiologiske ATP-koncentrationer) og forstyrrede celler (tab af ATP). For nogle mål (se erbb2 Alpha cetsa Kurt kit manual) har vi observeret, at irreversible hæmmere destabiliserede målet, mens en reversibel hæmmer stabiliserede målet.

spørgsmål: er der en måde at undgå epiturbance effekt?

A: tilsætning af en lille mængde vaskemiddel, som 0,01% SDS, kan forhindre epiturbance fænomenet. En forklaring kan være, at SDS giver adgang til antistoffet selv i nærvær af forbindelsen. Nogle af cetsa-cellelysebufferen indeholder en lille mængde SDS og kan derfor undgå epiturbance i forhold til andre lysisbuffere. Vi kan ikke udelukke, at flere SDS muligvis skal tilføjes i nogle tilfælde.

det skal bemærkes, at en sådan epiturbance-effekt ikke er begrænset til cetsa-reolassays, men også kan forekomme i ethvert immunoassay.

spørgsmål: Modskærm / Sådan kontrolleres, om mit cetsa-hit er en falsk positiv?

A: i cetsa karrus er der en simpel metode, der gør det muligt at bestemme, om forbindelsen virker på selve målproteinet (de) stabilisering eller interfererer med detektionsmetoden: en sammenligning kan foretages mellem (1) tilsætning af forbindelserne til cellerne, derefter inkubering og udførelse af varmebehandlingen og (2) opvarmning af cellerne først og tilsætning af forbindelsen først efter. Hvis den sammensatte aktivitet kun findes i test 1, er den virkelig aktiv på målet. Hvis sammensat aktivitet findes i 1 og 2, viser det, at det på en eller anden måde forstyrrer detektionsteknologien (se PerkinElmer Protein-Protein interaction guide for en liste over potentielle alfa-interferenser).

spørgsmål: hvilke falske negative hits kan opnås i CETSA-kr?

A: Hvis en forbindelse ikke når målet i en cellulær sammenhæng, kan det forekomme som positivt i biokemiske assays og stadig være negativt i cetsa-kur . Dette er ikke et falsk negativt, men afspejler kun det faktum, at forbindelsen ikke er i stand til at få adgang til målet under reelle cellulære forhold, hvilket er en del af metodens kraft.

spørgsmål : Hvordan sammenlignes cetsa-værdier med funktionelle assays / er der en betydning af termoshift-amplituden?

A: Ved analyse af cetsa-kursdata skal man huske på, at analyseprincippet er meget forskelligt fra typiske funktionelle assays, såsom at se på proteinphosphorylering, ionkoncentrationer, cAMP og andre signaltransduktionsmarkører eller fænotypisk analyse i screening med højt indhold, og derfor skal dataene fortolkes i overensstemmelse hermed.

amplituden af termoshift er ikke et mål for sammensat affinitet.

EC50-eller ITDRF50-værdierne er specifikke for visse analysebetingelser (temperatur, opvarmningstid,…). Dette adskiller sig ikke fra funktionelle analyser, hvor EC50-værdier for eksempel er specifikke for stimuleringstider.

spørgsmål : er det muligt at diskriminere antagonister mod agonister i cetsa-masseanalyser?

A: normalt er dette ikke en information, der er uddraget fra cetsa-assays, men publikationen fra Shav et al. (2018) Videnskabelige rapporter / (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-h. rapporter om, at kun agonister var i stand til at stabilisere androgenreceptoren i cetsa-larsassayet udviklet, mens antagonist ikke havde nogen direkte effekt i cetsa-larsassayet, men kunne påvises som konkurrenter af effekten af agonister i CETSA-larsassayet. I dette særlige tilfælde var cetsa-analysen derfor i stand til at skelne mellem androgenreceptoragonister og antagonister. Dette betyder ikke, at dette er muligt for ethvert mål, da der er adskillige eksempler, hvor cetsa-masseanalysen direkte registrerer både agonister og antagonister.

e: Kan cetsa karrus bruges til at detektere toksicitet af en forbindelse?

A: forbindelser, der udøver en vis toksisk virkning på en celle, forventes at føre til ændringer i niveauet af nogle proteiner (via nedbrydning og/eller transkriptionelle virkninger) og til ændringer i termostabiliteten af nogle proteiner (via posttranslationelle modifikationer eller generel ændring af cellernes tilstand). Pelago undersøger muligheden for at generere “cetsa-røde fingeraftryk”, der kan knyttes til forskellige typer toksicitet, fra cetsa-røde MS-data. Dette kan også generere viden om mål, som lægemidler ikke bør ramme for at undgå sådan toksicitet. Hvis et specifikt mål ser ud til at være knyttet til toksicitet, kan brug af Alpha cetsa karrus blive en metode til valg for lægemiddelindustrien.

spørgsmål: kan et husholdningsprotein anvendes til normalisering af cetsa-cholertis-analyser?

A: normalisering er typisk ikke nødvendig i cetsa-masseassays, da det vigtige output af analysen er EC50-værdien. I nogle tilfælde, for eksempel ved arbejde med vævsprøver, kan mængden af materiale, der er involveret pr.datapunkt, imidlertid variere ganske markant, og normalisering kan derefter ønskes. I cetsa krist Classic (vestlig blotting), SOD1 bruges ofte, da dets smeltepunkt på 80 kruset C gør det til en god uforanderlig reference for ethvert mål, og da dets molekylvægt på 18 kDa gør det let at opdage på vestlige blots. GAPDH ville ikke blive anbefalet på grund af dens lavere smeltetemperatur (55 liter C), hvilket gør det ikke en mulig kontrol for mål med en højere smeltetemperatur.

hvis cofilin ønsker at normalisere Alpha cetsa-analyse, kunne cofilin forsøges(der er et AlphaLISA SureFire ultra kit til total cofilin, med foreløbige cetsa-data, men endnu ikke fuldt valideret kit)