Antistofmålretning af claudin-1 som en potentiel kolorektal kræftbehandling

CRC-prøver

til genekspressionsprofilering valgte vi 143 tumorprøver fra 143 patienter inkluderet i tre kohorter: den prospektive single-center-undersøgelse REGP (19 patienter) (GSE62322), den retrospektive multi-center-undersøgelse COSIVAL (Gse62322 68 patienter) og det prospektive multicenterstudie biocolon (56 patienter) (Gse62080 og Gse72970) . For disse tre undersøgelser var inklusionskriterier: histologisk bevist tyktarmsadenocarcinom, avanceret og bidimensionelt målbar tumor (trin IV), alder mellem 18 og 75 år og Verdenssundhedsorganisationen (hvem) præstationsstatus karrus 2. Før nogen behandling gennemgik alle patienter operation for primær tumorresektion eller endoskopisk biopsi.

til vestlig blot-analyse blev der anvendt 13 yderligere tumorprøver fra den prospektive single-center-undersøgelse REGP, men ikke inkluderet i de 143 prøver.

til immunhistokemianalyse blev vævsprøver fra 52 yderligere patienter med CRC med tilbagevirkende kraft udvalgt fra Institute of Cancer Research of Montpellier pathology files, når normal slimhinde -, adenom-og adenocarcinomprøver var tilgængelige for den samme patient.

alle undersøgelser med humane vævsprøver blev godkendt af de relevante etiske udvalg, og alle deltagere blev informeret om undersøgelsens mål og metoder og underskrev et skriftligt informeret samtykke inden tilmelding.

Genekspressionsanalyse

Kolonprøver (normale kolon -, primær tumor-og levermetastaseprøver til Reg/P-undersøgelsen, men kun primære tumorprøver til cosival-og BIOCOLON-forsøgene) blev indsamlet på operationstidspunktet efter en standardiseret procedure for at opnå RNA af høj kvalitet . Prøver blev derefter hybridiseret til humant genom U133 Plus 2,0 arrays., Santa Clara, CA).

for at identificere nye terapeutiske mål for antistofbaseret terapi i mCRC sammenlignede vi genekspressionsprofilerne for normal slimhinde (n = 17), primær tumor (n = 20) og levermetastaser (n = 19) vævsprøver.

da CRC-heterogenitet skal tages i betragtning ved sammenligning af genekspressionsprofiler, primære tumorprøver (n = 143) blev klassificeret ved hjælp af CRC-molekylære klassifikationer baseret på genekspressionsprofiler, der er blevet foreslået af tre uafhængige grupper og den nylige konsensusklassificering . Kort sagt, De Sousa E. Melo et al. foreslået at gruppere tumorer i tre klasser: CCS1 (CRC med mikrosatellit ustabilitet, MSI), CCS2 (kræft med kromosomal ustabilitet, CIN) og CCS3 (ny undertype) . Sadanandam et al. identificerede fem molekylære undertyper baseret på cellefænotypen: Bægerlignende, Transitforstærkende (TA), Enterocyt, Stamlignende og inflammatorisk . Marisa et al. beskrevet seks molekylære undertyper (C1 til C6) med følgende hovedtræk: C1 = CIN og nedregulering af immunveje, C2 = MSI, C3 = muterede KRAS, C4 = stamcellefænotype-lignende, C5 = CIN og opregulering af vnt-veje og C6 = CIN og normal-lignende genekspressionsprofil . Endelig, startende fra seks tidligere offentliggjorte underskrifter, præsenterede et internationalt konsortium en klassificering med fire konsensusundertyper: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolisk (CMS3) og mesenkymal (CMS4) (til gennemgang ). CRC-prøvefordelingen ifølge den molekylære undertype er vist i yderligere fil 1: tabel S1.

Immunhistokemianalyse

prøver blev samlet i et vævsmikroarray (TMA) ved hjælp af tre vævskerner (hver med en diameter på 0,6 mm) som tidligere beskrevet . Kort fortalt blev 3-liters sektioner af TMA de-paraffiniseret og rehydreret i graderede alkoholer. Varmeinduceret antigenudtagning blev udført ved at inkubere TMA-sektioner i EDTA-buffer (pH 9) ved 98 liter C i et vandbad i 20 minutter. Efter neutralisering af den endogene peroksidaseaktivitet blev TMA-sektioner inkuberet med et polyklonalt anti-CLDN1-antistof (JAY-8, C, USA) eller antistoffortyndingsmiddel (Dako, Glostrup, Danmark) alene i 60 minutter. Primær antistofbinding blev visualiseret ved hjælp af Envision-systemet og Dako-Autostainer-systemet (Dako, Glostrup, Danmark). Procentdelen af CLDN1-positive celler og farvningsintensiteten (0, ingen farvning; 1, gullig; 2, brun; og 3, mørkebrun) blev evalueret for hver enkelt TMA-plet.

vestlig blot-analyse

Tumorvævsprøver fra patienter blev direkte slibet i lysisbuffer (150 mm NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton H-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM natriumorthovanadat, en cocktailproteasehæmmertablet til 10 ml) ved hjælp af en blandefabrik lolus mm 300 enhed (chiagen, Valencia, CA). Proteinkoncentrationen blev bestemt med Bradford assayet (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Derefter blev 50 liter samlede proteiner opløst med 12% SDS-side og overført til nitrocellulosemembraner (hhv.hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. hhv. pore størrelse 0,45 liter). Ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 5% (vægt/vol) ikke-fedtholdig mælk i PBS med 0,1% (vol/vol) mellem 20 (PBS-T) ved stuetemperatur i 1 time, og derefter blev membraner inkuberet ved 4 kg c med et polyklonalt anti-CLDN1-antistof (JAY-8) natten over. Membraner blev derefter vasket og inkuberet med det passende peberrodsperoksidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time. åbenbaring blev udført med et kemiluminescenssystem (Amersham Biosciences); til normalisering blev der anvendt en ekspression af cholin-tubulin.

subcellulær proteinekstraktion

Proteinekstraktion blev udført som tidligere beskrevet . For hver prøve blev 20 liter tykke sektioner skåret med et kryotom, blandet i flydende nitrogen og forsigtigt malet med en mikropestle. Til subcellulær proteinekstraktion blev Proteoekstraktet subcellulært Proteomekstraktionssæt anvendt i henhold til producentens anvisninger (Calbiochem). Subcellulære fraktioner (10 liter/hver) blev indlæst på 12% SDS-sidegeler. Immunoblotting blev udført som beskrevet ovenfor med følgende primære antistoffer: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histon H3 (Pierce) og-Kurt-tubulin (Sigma T4026).

cellelinjer

følgende humane CRC-cellelinjer blev brugt: S480 (ATCC CCL-228), S620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (en gave fra C. Montagut, Institut for Medicinsk Onkologi, Hospital del Mar, Barcelona, Spanien), HCT116 (CCL-247) og ls174t (ATCC cl-188). For at opnå den CLDN1-positive SV480-cellelinie (SV480-CLDN1) blev SV480-celler stabilt transficeret med den humane CLDN1 cDNA-klon (Invitrogen MGC-samling) eller med Tom vektor (pcDNA) ved hjælp af jetPRIME-oprensningsreagens (Polyplus-transfection Inc., Frankrig). CLDN1-positive kloner blev udvalgt ved at dyrke transfekterede celler i nærvær af 500 liter/ml geneticin. Til cldn1-lyddæmpning blev S620 transduceret med pSIREN-vektoren indeholdende shRNA mod CLDN1 (S620shcldn1) eller mod luciferase (shLUC, negativ kontrol). Efter 24 timer blev celler udvalgt med 1 liter/mL puromycin, og stabile kloner blev samlet. Alle transiente transfektioner blev udført ved hjælp af jetPRIME-oprensningsreagensen.

produktion af anti-CLDN1 mAb 6 F6

til antistofproduktion blev 6-8 uger gamle kvindelige BALB/C-mus (Harlan, Gannat, Frankrig) udfordret af intra-peritoneal (i.p.) injektion af 4 millioner mus NIH-celler transient transficeret med CLDN1 cDNA (NIH-CLDN1-celler) hver anden uge (fem injektioner i alt). NIH-CLDN1-celler blev blandet med komplet Freunds adjuvans (Sigma) til den første injektion og med ufuldstændig Freunds adjuvans (Sigma) til de andre fire injektioner. En intravenøs boosterinjektion af NIH-CLDN1-celler blev givet tre måneder efter den femte immunisering. Tre dage senere blev miltceller fra immuniserede mus fusioneret med musens myelomcellelinie P3-H63-Ag.8.653 til fremstilling af musehybridomer. Supernatanter fra nygenererede kloner blev screenet ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved hjælp af S480-CLDN1 og S480 celler (negativ kontrol). Screeningsresultaterne blev bekræftet ved at udføre og yderligere screening ved hjælp af S620-og S620-shCLDN1-celler. Anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 klonen blev valgt og klonet ved at begrænse fortynding. Antistofisotyping viste, at 6 F6 var en IgG3k.

alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de franske regerings retningslinjer for eksperimentelle dyreforsøg (aftale CEEA-LR-12052).

radiomærkning og SPECT-CT-billeddannelse

kvindelige athymiske nøgne mus (6-8 uger gamle) blev købt hos Harlan. 6 F6 mAb blev radiomærket med 125i (Perkin Elmer) ved den specifikke aktivitet på 370 MBK/mg til single-photon emission computed tomography (SPECT) billeddannelse ved anvendelse af IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) metode. Efter haleveinjektion af 16 MBK / 50 liter 125I-mærket 6 F6 blev helkrops-enkeltfotonemissionstomografi/computertomografi (SPECT/CT)-billeder erhvervet med et 4-hoved multipleksende Multi-pinhole NanoSPECT-kamera (Bioscan Inc. USA) på forskellige tidspunkter (48, 72 og 96 timer). Samtidig blev mikro-CT-billeder i hele kroppen erhvervet til anatomisk samregistrering med SPECT-data. Rekonstruerede SPECT-og CT-data blev visualiseret og co-registreret ved hjælp af Invivoscope kros.

Klonogent assay

kolorektale cancerceller blev podet i en 6-brøndsplade (150, 250 eller 400 celler/brønd) og fik lov til at klæbe ved 37 liter C natten over. Derefter blev 1 ml RPMI med eller uden 6 F6 mAb (slutkoncentration: 100 liter/ml) tilsat til hver brønd, og cellerne blev dyrket i seks dage. Efter yderligere seks dage i medium uden antistof, plader blev læst ved hjælp af et celigo-billeddannelsescytometer og applikationen “single colony verification”. Celigo ‘ s cytometer er et in situ cellulært analysesystem, der giver billeder af brønde ved hjælp af lysfeltbelysning (Neccelom Bioscience, MA, USA).

etablering af tredimensionelle (3D) sfæroidkulturer

Ultra-lav fastgørelse, rundbundede 96-brøndsplader (Corning Costar) blev brugt til sfæroiddannelse. S480, S480-CLDN1 eller S620 celler blev podet med en massefylde på 5 l.104. Celler aggregeret og fusioneret i 3D sfæroider inden for 24-72 timer. Billeder af brønde blev taget med et fasekontrastmikroskop ved hjælp af et 5-liters mål eller taget med Celigo-billeddannelsescytometeret ved hjælp af applikationen “Tumorosphere”. Cellelevedygtighed blev vurderet med Celltiter-Glo luminescerende Cellelevedygtighedsanalyse (Promega, Madison, Vi, USA). Efter tilsætning af 100 liter CellTiter Glo reagens til hver brønd i 10 minutter blev luminescens målt på en 1450 MicroBeta luminescens mikropladelæser (Perkin Elmer).

cellecyklus-og proliferationsanalyse i sfæroider

sfæroider blev fremstillet ved plettering af 1000 DiFi-celler pr.brønd i ultra-lave 96-brøndsplader og dyrkning af dem i nærværelse af 100 liter/ml af 6 F6 mAb eller irrelevant mAb (retuksimab) i 5 dage. Til cellecyklusanalyse blev celler pelleteret, trypsiniseret, vasket med PBS, fikseret i 75% ethanol og farvet med 40 liter/ml propidiumiodid i nærvær af 100 liter ml−1 RNAse (Chiagen). Cellecyklusfordelingen blev bestemt med et Fc500 Beckman Coulter Strømningscytometer under anvendelse af FL-3-kanalen. Celler blev lukket på et prikplot, der viste DNA-puls-toppen vs DNA-pulsområdet for at udelukke dubletter. Cellecyklusfordelinger blev illustreret ved hjælp af strømnings jo-analyseprogrammet (Treestar, STRØMNINGSJO, Ashland eller USA).

på kulturdag 4 blev celleproliferation målt ved inkubering af celler med 5-ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU) i 24 timer. EdU inkorporeres i DNA under aktiv DNA-syntese. Derefter, efter celletrypsinisering og fiksering/permeabilisering i 75% ethanol/PBS, inkorporeret EdU blev mærket og detekteret med klik-det EdU Aleksa Fluor 488 Strømningscytometri Assay Kit (Invitrogen). Cellerne blev derefter inkuberet med 1 liter/ml 4′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i PBS/0,1% Triton 100 ved 37 liter C i 30 minutter. Celigo-Karsten” Ekspressionsanalyse ” (mål 1 + Maske) – applikationen blev brugt til at kvantificere det fluorescerende signal og til dataanalyse. Celler blev identificeret ved hjælp af DAPI-nuklear plet, og DNA-syntese blev kvantificeret ved måling af Edu-inkorporering.

musemodeller

1,5 liter 106 S620-celler eller 3 liter 106 DiFi-celler blev suspenderet i dyrkningsmedium og injiceret subkutant (s.c.) i højre flanke af 6-8 uger gamle kvindelige athymiske nøgne mus fra Harlan. 100 mm3 blev mus randomiseret i forskellige grupper og behandlet ved i.p. injektion af 0,9% NaCl eller 6F6 mAb (15 mg/Kg pr.injektion) to gange om ugen i tre på hinanden følgende uger for det første eksperiment og tre gange om ugen for det andet eksperiment. Tumorer blev målt to gange om ugen med en tykkelse og volumener beregnet med formlen: D1 * D2 * D3/2.

Intrasplenisk leverkoloniseringsmodel

i hvert forsøg blev 2 millioner luciferaseudtrykkende S620-celler (S620-LUC-celler) injiceret i milten hos 6-8 uger gamle kvindelige athymiske nøgne mus. Milten blev fjernet 2 minutter efter celleinjektion. På dag 1 efter injektion blev mus tilfældigt opdelt i to grupper på 10 mus, der blev behandlet enten med 15 mg/kg 6 F6 mAb eller 0,9% NaCl ved i.p. injektion tre gange om ugen. For at evaluere metastatisk dannelse og formidling blev luciferaseekspression overvåget ved luminescensafbildning efter injektion af luciferin (Camera iVis Lumina II, PerkinElmer karrus) en gang om ugen. I uge 5 Efter operationen blev mus ofret, lever blev fjernet, fotograferet og makroskopisk synlige metastaser på leveroverfladen blev talt.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af stata 13.0-programmet (StataCorp). Til genekspression eller immunhistokemiske eksperimenter blev forskelle mellem grupper analyseret ved hjælp af Kruskall/Dunns test. Korrelationer mellem CLDN1-genekspression og progressionsfri overlevelse (PFS) og samlet overlevelse (OS) blev evalueret i hele gruppen (n = 143 patienter) og i henhold til tumormolekylær subtype. Til dette formål blev de 143 patienter opdelt i to grupper baseret på den mediane CLDN1-genekspression (dvs.9,75). PFS-og OS-værdier blev sammenlignet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og forskelle mellem overlevelsesfordelinger vurderet ved hjælp af log-rank-testen.

den parrede t-test blev brugt til at sammenligne effekten af inkubation med 6 F6 mAb i In vitro-eksperimenter.

i In vivo-eksperimenter blev en lineær blandet regressionsmodel anvendt til at bestemme forholdet mellem tumorvækst og antal dage efter injektion. Den faste del af modellen omfattede variabler svarende til antallet af post-graft dage og forskellige behandlingsgrupper. Interaktionsbetingelser blev indbygget i modellen; tilfældige aflytninger og tilfældige skråninger blev inkluderet for at tage hensyn til tidseffekten. Koefficienterne for modellen blev estimeret ved maksimal sandsynlighed. Overlevelsesrater blev estimeret fra datoen for injektionen indtil den dato, hvor tumoren nåede et volumen på 1500 mm3 ved hjælp af Kaplan–Meier-metoden. Overlevelseskurver blev sammenlignet ved hjælp af log-rank-testen. For leverkoloniseringseksperimenterne blev forskelle mellem grupper evalueret med Mann-Hvidney U-testen. For alle eksperimenter blev forskelle anset for at være signifikante, når P < 0,05.