Chloramphenicolacetyltransferase som markeringsmarkør for chlamydial transformation
pGFP::S2, shuttle-vektoren Konstrueret af Vang et al., indeholdt et krishlactamase-gen som markeringsmarkør. Det bærer også et KATTEGEN, der er smeltet sammen med GFP-genet . Vi fandt ud af, at E. coli transformeret med pGFP::S2 plasmid var i stand til at vokse i medium indeholdende chloramphenicol (endelig koncentration: 170 kg / ml), hvilket antyder, at KATTEGENET også kan anvendes som en selektionsmarkør til chlamydial transformationsforsøg. Som advaret af Vang et al., en negativ virkning af chloramphenicol på vært mitokondrier, som demonstreret af Li et al. kan påvirke nytten af dette antibiotikum til chlamydial transformation . I Li et al.’s rapport, den minimale toksiske koncentration af chloramphenicol var 10 liter / ml, hvilket forårsagede en mild 20% reduktion af ATP-produktionen. Vi har bestemt, at den tilsyneladende laveste chloramphenicolkoncentration, der fuldstændigt hæmmede inklusionsdannelse i plasmidfri C. trachomatis L2-stamme betegnet L2R var kun 0,05 liter / ml (data ikke vist), hvilket var langt under koncentrationerne toksiske for værtsceller. Derfor begrundede vi, at dette antibiotikum kunne bruges til at vælge katteudtrykkende transformanter uden signifikant at stresse værtsceller.
vi transformerede L2R med pGFP::S2 og valgte den ene halvdel af de transformerede celler med ampicillin og den anden halvdel med chloramphenicol. Antibiotika (2 liter/ml ampicillin eller 0,1 liter/ml chloramphenicol) blev tilsat til kulturerne ved 10 timer efter transformation. Begyndende ved passage 2 blev deres koncentrationer forøget til henholdsvis 5 og 0,2 liter/ml, og de blev tilsat på inokulationstidspunktet. Opdelingsforholdet mellem passager forblev 1:1 fra passage 1 selvom passage 4. Selvom MIC af chloramphenicol, som blev bestemt ved lav multiplicitet af infektion (~0,1 inklusionsdannende enheder pr.Celle), var 0,05 liter/ml, forventedes nogle af de ikke-transformerede chlamydiae at danne inklusioner i nærvær af 0,1 – 0.2 liter/ml antibiotikumet, fordi vi brugte et højt EB til celleforhold til transformation, og effektiviteten af chlamydial væksthæmning af antibiotika påvirkes af mangfoldigheden af infektion . Med den ovenfor beskrevne selektionsprotokol blev næsten 100% celler i kulturer valgt med ampicillin under et fasekontrastmikroskop fundet at indeholde en inklusion med afvigende RBs ved den indledende passage. De afvigende RB-holdige indeslutninger var stadig til stede i en lille andel celler ved passage 2, men blev for det meste erstattet af tilsyneladende normale indeslutninger ved passage 3. 20% celler, og unormale indeslutninger blev sjældent observeret ved passage 4. Ved passage 5, som skyldtes podning med 10% høst fra passage 4, blev indeslutninger fundet i 80% celler; tilsyneladende indeholdt ingen af disse indeslutninger afvigende RBs.
da chloramphenicol ikke får chlamydiae til at danne afvigende RBs, vurderede vi resistens over for antibiotika efter inklusionsstørrelsen. Inklusioner af mindre end normale størrelser blev påvist i næsten alle celler ved passage 1. Nogle, men meget lille størrelse, indeslutninger blev fundet ved passage 2, og de fleste af disse indeslutninger blev erstattet med indeslutninger i normal størrelse ved passage 3. Indeslutninger i normal størrelse blev fundet i mere end 20% celler ved passage 4. Ved passage 5, afledt efter inokulation med 10% passage 4-høst og en stigning i chloramphenicolkoncentration (fra 0,2 liter/ml til 0,5 liter/ml), blev indeslutninger i normal størrelse fundet i næsten 100% celler 0000000.
ud over tilsyneladende resistens over for selektionsmidlerne brugte vi GFP-ekspression og restaurering af glykogensyntese som yderligere markører til vellykket transformation . EBs høstet fra passage 5 blev anvendt til at inficere McCoy-celler med en fortyndingshastighed på 1:100 (cellenummerækvivalens) til forsøg, der bestemmer GFP-ekspression og glykogensyntese (figur 2). Som forventet udtrykte hverken vildtype plasmidfyldt C. trachomatis L2 (434/bu) (figur 2a) eller ikke-transformeret plasmidfri L2R (figur 2b) GFP. Overensstemmelse med etablerede fund, at glycogensyntese i C. trachomatis kræver sit plasmid, jodplet viste, at glykogen blev akkumuleret i inklusionerne af vildtype L2 (figur 2a), men ikke dem af L2R (figur 2b). I nærvær af 5 liter/ml ampicillin, som hæmmer RB-opdeling, dannede ikke-transformerede L2R (figur 2C) indeslutninger indeholdende kæmpe RBs uden at producere glykogen; hvorimod chloramphenicol (endelig koncentration: 0,5 liter/ml) fuldstændigt inhiberede dannelsen af synlige indeslutninger i L2R-inficerede celler (figur 2D). I overensstemmelse med data offentliggjort af Vang et al. , pGFP::S2-transformeret L2R valgt med ampicillin dannede GFP-positive indeslutninger med glykogen (figur 2e). PGFP:: S2-transformeret L2R valgt med chloramphenicol dannede også GFP-positive indeslutninger indeholdende glycogen (figur 2F). Som forventet var ampicillin-udvalgte transformanter i stand til at danne normal størrelse, GFP-positive, glykogenholdige indeslutninger i nærvær af chloramphenicol (figur 2G); ligeledes var chloramphenicol-udvalgte transformanter fuldstændigt resistente over for ampicillin, udtrykt GFP og produceret glykogen (figur 2h). Disse resultater tyder på, at KATGENET i pGFP::S2-plasmid er funktionelt i chlamydiae, og chloramphenicol-resistens kan bruges som en markeringsmarkør til chlamydial transformation.
inklusion, GFP-ekspression og glykogensyntese af pGFP::S2-transformanter af C . trachomatis L2. Utransformeret plasmidfyldt stamme 434/bu (a), utranformeret plasmidfri stamme L2R (B-D) og transformeret L2R valgt med enten ampicillin (E, G) eller chloramphenicol (F, H) blev dyrket enten med medium indeholdende et indikeret antibiotikum eller med antibiotikafrit medium. Billeder af indeslutninger i ufarvede og jodfarvede kulturer blev erhvervet med fasekontrastmikroskopi eller fluorescensmikroskopi 48 timer efter inokulation. I alle paneler er fasekontrast og GFP-billeder overlejrede.
vi fjernede derefter re-lactamase-genet fra pgfp::S2-plasmid som beskrevet i afsnittet “metoder” og anvendte den resulterende pGFP-kat::S2-plasmid til at transformere L2R. transformerede chlamydiae blev underkastet selektion med chloramphenicol under anvendelse af det samme regime som beskrevet ovenfor. 20% af de inficerede celler i passagekulturen 4. Fluorescensmikroskopi og jodfarvning afslørede GFP-og glykogen-positive indeslutninger i celler, der blev inficeret med EBs høstet fra passage 5 og dyrket i nærvær af chloramphenicol (figur 3, øverste panel). Som et resultat af en mangel på pgfp-lactamase i pgfp-CAT::S2-plasmidet var transformanterne imidlertid ikke i stand til at danne normale indeslutninger i nærvær af ampicillin; i stedet blev deres indeslutninger fyldt med afvigende RBs. Mens de uregelmæssige indeslutninger stadig var positive for GFP, var de stort set fri for glykogen (figur 3, nedre panel). Efter passage 5 blev pgfp-CAT::S2-transformanter dyrket med 0,5 liter/ml chloramphenicol til yderligere fire passager i et 1:100 opdelingsforhold for hver passage. Alle indeslutninger ved passage 9 Havde det samme udseende som indeslutningerne af plasmidfyldt chlamydiae og ikke af den plasmidfrie L2R, og alle viste sig at udtrykke GFP (data ikke vist). Disse resultater viser, at CAT-genet i PGFP-CAT::S2-plasmidet, svarende til pGFP::S2-plasmidet, fungerer som en selektionsmarkør for C. trachomatis-transformation.
inklusion, GFP-ekspression og glykogensyntese i L2R transformeret med pGFP-CAT::S2. Celler inficeret med chloramphenicol-udvalgte transformanter blev udsat for enten chloramphenicol eller ampicillin. Billeder af indeslutninger i ufarvede og jodfarvede kulturer blev erhvervet med fasekontrastmikroskopi eller fluorescensmikroskopi 48 timer efter inokulation. Fasekontrast og GFP-billeder kan overlejres.
det skal bemærkes, at Tam et al. har tidligere forsøgt at udvikle et transformationssystem med CAT-genet som en selektiv markør . I denne undersøgelse blev en shuttle-vektor indeholdende et KATTEGEN elektroporeret til EBs af C. trachomatis E (stamme UV-5 / H) og L2 (stamme 434/Bu). Selvom både cat mRNA og f. eks. aktivitet var påviselig i de indledende kulturer af transformerede chlamydiae, kunne forfatterne ikke opnå stabile transformanter efter selektion med chloramphenicol til 4 passager. Det er vigtigt at bemærke, at begge stammer elektroporeret indeholder et nativt plasmid, der deler den samme replikationsoprindelse med det rekombinante plasmid, der anvendes til transformation . Siden Vang et al. var kun i stand til at opnå stabile penicillinresistente transformanter fra L2R, et plasmidfrit C. trachomatis L2-variant, men ikke vildtype, plasmidfyldt 434/Bu , under ellers identiske eksperimentelle indstillinger, er det retrospektivt ikke overraskende, at Tam et al. kunne ikke udlede stabil chloramphenicolresistent chlamydiae.
