Cirkulær RNA: funktioner, applikationer og udsigter

introduktion

cirkulær RNA (circRNA) blev opdaget i RNA-vira som viroider i midten af 70 ‘ erne, oprindeligt antaget at være en endogen RNA-splejsningsfejl . Takket være fremskridt inden for beregningsanalyse og RNA-sekventeringsteknikker i det samme årti er disse misforståede cirkulære strukturer endelig blevet anerkendt korrekt og dybt både i struktur og funktionalitet . I sin kerne er circRNA et enkeltstrenget RNA , men det adskiller sig fra det langt bedre kendte lineære RNA, idet det kontinuerligt lukkes ind i sig selv ved kovalent at forbinde sine 5′ og 3’ ender og således præsentere nogle fascinerende egenskaber, som ikke er fuldt udforsket: proteinkompleks stilladser, forældregenmodulation, RNA-proteininteraktioner og microRNA (miRNA) svamp, for blot at nævne nogle få . De anses nu for at give væsentlig regulerende funktion for både planter og dyr . Et stigende antal studiegrupper har vist og verificeret i et omfang det niveau af effektivitet og effektivitet, der vises i cirkulære RNA ‘ er, der typisk kræves i levedygtige medicinske behandlinger og andre bioteknologiske anvendelser. For eksempel rapporteres der ofte tilfælde af traditionelle biomarkører, der er langt bedre end de foreslåede circRNA-erstatninger. Bakket op af voksende støtte og beviser om de promoterende kapaciteter af circRNAs, mere undersøgelse og interesse bør bringes ud som sådan, ikke blot fra en grundlæggende omfattende biologisk forståelse af dens strukturer og mekanismer, men også på et systematisk niveau af deres interaktioner med omgivende molekyler og miljøer. Anvendeligt set er circrna ‘ er på niveau med dets potentiale og levedygtighed til at målrette kræft og andre ondartede sygdomme med andre nye behandlinger såsom personlig medicin og stamcelleterapier.

CircRNA-egenskaber

Circrna ‘ er består generelt af 1-5 eksoner, og intronerne, der flankerer eksonerne, er op til 3 gange så lange som deres lineære modstykke. Nærmere analyse har afsløret tilstedeværelsen af mange komplementære inverter Alu-gentagelser i intron-segmenterne , hvilket får nogle til at spekulere i dette særlige arrangement, der faktisk letter splejsningsstederne for let at lokalisere hinanden og fremme cirkularisering. Da de er tætsluttede strukturer, er der faktisk ingen 5′ og 3′ endestrukturer såsom poly-A haler og 5’ hætter i circRNA, hvilket gør dem immune over for eksonukleasespaltning . Empirisk holder de 2,5 gange længere end deres lineære modstykker i brystceller, som illustreret i en undersøgelse udført af Enuka et al. . På grund af disse fysiske egenskaber, almindelige laboratoriescreeningsteknikker såsom RNase r – nedbrydning – et f.eks. der udelukkende nedbryder lineært RNA-såvel som poly-A-haletest kan nøjagtigt vælge tætte loopede strukturer frem for lineære former. Flere forskningsgrupper i de senere år har flyttet deres fokus på at identificere potentielle circRNA-isoformer, strukturer, der oprindeligt udtrykkes fra det samme forældres DNA, men som er lidt forskellige fra hinanden i sin endelige modne form på grund af differentiering i specificitet af spliceosomer for at genkende eksoner og introner på præ-mRNA-strengen . Blandt de mest bemærkelsesværdige grupper er Salman, Jeck, Memcak, Guo og Jang . Som sådan forklarede den utrolige mangfoldighed af cirkrna ‘ er: 20.000 forskellige typer er blevet identificeret i eukaryoter indtil videre, et tal, der stadig er åbent i dag .

CircRNA biogenese og klassificering

dannelsen af circrna ‘ er stammer fra positionering og scrambling af ekson-og introngrupper, som er segmenter, der er reserveret og elimineret i det endelige post-transkriptionelt modificerede produkt henholdsvis . Normalt dannes et modent messenger-RNA, når et protein-RNA-kompleks ved navn spliceosomet katalyserer spaltningen af intronsegmenter i et precursor-mRNA-molekyle, normalt ved genkendelse af specifikke sekvenser, der flankerer intron-segmentet i begge ender. Eksonsegmenterne smelter sammen, mens de introniske segmenter følgelig tages ud og nedbrydes. Denne konventionelle opfattelse tager ikke højde for afvigelsen og forskellen i styrke på tværs af alle splejsningssteder , hvoraf nogle som følge heraf kan spliceosomet ignorere og uundgåeligt føre til syntesen af circRNA. Endvidere skal bidraget fra det rumlige arrangement af 5′ og 3’ splejsningsstedet ikke ignoreres, for hvis førstnævnte er placeret nedstrøms for sidstnævnte, konstruerer spliceosomet gunstigt en kovalent lukket cirkulær struktur over et lineært eksonisk molekyle . Denne mekanisme, der almindeligvis betegnes som “Ekson Scrambling”, giver anledning til forskellige typer cirkrna ‘ er, herunder eksoniske, introniske, ekson-introniske og intergeniske . I kræftspecifikke tilfælde er den interne struktur endnu vanskeligere at bestemme på grund af den ekspansive og dermed invasive karakter af ondartede tumorer . Vi skildrede kort biogenese og funktionalitet af circrna ‘ er i Fig. 1.

oversigt over biogenese og funktionalitet af cirkulært RNA. Forklaring og fodnoter: a Et messenger-RNA i sin modne form, hvor interaktion mellem både eksoner og introner er fraværende. B Lariat-drevet Cirkularisering. Opstrøms ekson (ekson 1) og nedstrøms ekson (ekson 4) er kovalent bundet på grund af mRNA ‘ et, der splejses. Dette letter produktionen af et RNA lariat sammen med parrede eksoner, der forbliver, som er Eksoner 2 og 3. C RNA-bindende Proteindrevne og Intron-parringsdrevne Cirkulariseringer. I begge tilfælde er de opstrøms og nedstrøms introner (introner 1 og 3) parret op for at give mulighed for, at de klemte Eksoner (eksoner 2 og 3) kan interagere, den eneste forskel er, at med det tidligere tilfælde forbinder et eksternt RBP-molekyle ligningen for aktivt at lette reaktionen, hvorimod med Intron-parringsdrevet Cirkularisering parres hhv. d ecircRNA eller ElcircRNA fremstilles uanset Cirkulationsvej. I nogle tilfælde ligger introniske segmenter i sløjfen, hvilket giver anledning til Elcircrna ‘ er i modsætning til ecircRNA, der indeholder rent eksoniske segmenter. e funktionaliteter af modne cirkrna ‘er inkluderer miRNA-svamping, fungerer som en dobbelthæmmer for nogle kemiske reaktioner; Proteinoversættelse er mulig, omend ret sjælden, og der udføres forskning for at forstå, hvordan det adskiller sig fra lineære RNA-oversættelser; RBP-Proteinkompleksformationer hjælper med at regulere og moderere veje og indirekte påvirke produktionen af andre cirkrna’ er; mRNA-interaktioner, det være sig faciliterende eller hæmmende

CircRNA-funktion: microRNA-svampe

på grund af det unikke i strukturer af circRNA koder de ikke for proteiner som de lineære former . Undersøgelser har vist, med understøttende empirisk bevis, at visse circrna ‘ er fungerer som mikroRNA-svampe og effektivt hindrer deres mekanisme. MicroRNA ‘er er 21-nt lange ikke-kodende RNA-sekvenser, der hjælper med post-transkriptionel regulering af genekspression, typisk ved at låse sig fast på mRNA’ er og hæmme dets translation til protein via enten konkurrencedygtig eller ikke-konkurrencedygtig måde. De klassificeres i familier efter deres frøregioner, afhængigt af om de deler den samme sekvens af nukleotider fra position 2 til 7 . Circrna ‘er har komplementariteten til at modbinde sig på mikroRNA’ er, genkende frøregionerne i mirna ‘ erne og deaktivere dem konkurrencedygtigt. Især to circrna ‘er, henholdsvis Cdr1a’ er og circSRY, er rampelyset for videnskabelig forskning på nuværende tidspunkt. Det observeres, at Cdr1a ‘ er Indeholder 70 konserverede bindingssteder for miRNA-7, langt signifikant end nogen anden lineær miRNA-svamp. Dens sponging kapacitet er bekræftet af Memcsak et al. , som udnyttede sekvestrering af CDR1as-molekyler mod forhøjet ekspression af miR-7 i sebrafiskhjerner for at opnå understøttende bevis for CDR1as-hæmmende aktiviteter mod det målrettede miRNA ved at overvåge efterfølgende sebrafisk midthjerneudvikling. CircSRY testes derimod i murine testikler, og dets komplementære angreb på Mir-138 frøregionen bemærkes . Da det indeholder 16 specifikke bindingssteder, et tal, der stadig er imponerende blandt alle svampemolekyler, bekræftes deres svampfunktionaliseringshypotese .

CircRNA-funktion: interaktion med RBPs og proteinoversættelse

nogle har fundet circRNA til at regulere gentranskription og ekspression via andre veje. De kan interagere med RNA-bindende proteiner (RBP ‘er) såsom circ-Ræve3 og danner sammen et kompleks, der påvirker celleoverlevelse og proliferation ved at interagere med p21 og CDK2 ; nogle styrker mRNA-stabiliteten ved at danne dupleksstrukturer, såsom i tilfælde af Cdr1a’ er. På en mere kontroversiel note, grupper som Legnini I. et al. og Pamudurti N. R. et al. opdaget, at visse circrna ‘ er kan oversætte til proteiner, en i murine myoblaster og en i fluehoveder . Sådanne nyheder frembringer ny hypotese ‘ om circRNA-kapaciteter, der traditionelt menes at være ikke-kodende . Siden den første opdagelse af proteiner oversat fra hepatitisvirus-en enkeltstrenget circRNA, har nogle verificeret aktiveringen af circRNA translationel kapacitet ved at indsætte en IRES (intern ribosomindgangssted) opstrøms for startkodonet . Der skal gøres meget mere for fuldt ud at forstå den nøjagtige translationsmekanisme for disse circrna ‘ er, og hvorfor de fungerer, mens flertallet af andre ikke gør det.

CircRNA-anvendelsespotentiale

på en mere praktisk note er circrna ‘ er levedygtige biomarkører til diagnose og behandling af sygdomme, da de ikke let kan nedbrydes af eksonukleaser på grund af deres lukkede cirkulære struktur. I nogle tilfælde har circrna ‘ er vist sig at trumfe konventionelle biomarkører. For eksempel opregulering af circ-PVT1 i gastrisk kræft (GC) væv forbedrer svampeaktivitet af miR-125 og tilskynder derefter GC-proliferation ; hsa_circ_0000190 har også tiltrukket opmærksomhed ved at fungere lige modsat – nedregulering sker, når den kommer i kontakt med GC, og den testes for at være mere følsom og specifik end biomarkører som CEA og CA 19-9 . Et andet eksempel er i hepatocellulært carcinom (HCC), hvor den nuværende biomarkør i overvejende anvendelse er alfa-fetoprotein (AFP) . AFP viser dårlig følsomhed, hvor 40% af alle patienter med HCC testede normale AFP-niveauer. Den konstruktive måde at øge denne følsomhed på er ved kombination med andre markører, hvilket ikke er en effektiv løsning. Alternativt, Shang et al. har foreslået sammenhængen mellem circ_005075 og tumorstørrelse , der angiver det som en levedygtig prognostisk biomarkør, der er overlegen både i effektivitet og potentiale på grund af deres stabilitet og specificitet. Dette antyder, at udviklingen og invasionen af HCC ‘er er tæt knyttet til circrna’ er, omend dens fulde mekanisme stadig uklar. Ikke desto mindre er listen over mulige circRNA-biomarkører, der gælder for kræftforskning, ikke begrænset til udelukkende disse to sygdomme. Vi opsummerede tilgængelige undersøgelser vedrørende circrna ‘ er involveret i forskellige menneskelige sygdomme, som kan findes i tabel 1.

yderligere nylige undersøgelser har identificeret og forsøger at afkode berigelsen og stabiliteten af cirkrna’ er i eksosomer, en kombination, der yderligere kan forbedre cirkrna ‘ ernes målretningsevne. Eksosomer er ekstracellulære vesikler, hvis hovedfunktion er at transportere forskellige celleindhold, kemikalier såvel som faktorer, hvilket tillader celle-til-celle interaktion og respons . Som sådan er et betydeligt antal cellulære ændringer og vævsrespons en konsekvens af, om dens tilsvarende vesikel med samme kompatibilitet med succes har nået sin destination og illiciterede reaktioner eller transporterede faktorer . At få en forståelse af eksosommekanismen kan hjælpe med at udlede mediationer på tumormikromiljø og intercellulært netværk, hvilket derfor udløser stor interesse for eksosomet circRNA for nylig i lyset af muligheden for styrket effektivitet og målretningsevne på ondartede eller funktionssvigt celler.

oprindelsen af circrna ‘ er afhænger i sidste ende af tilsvarende miRNA-niveauer i deres donorceller, som kan være både immun og ikke-immun. Eksosom-RNA ‘ er kan minimere skader på DNA ved at accelerere cellecyklussen, som det er vist i et nyligt tilfælde af overekspression af miR-217, hvilket resulterer i reduktion af clclin-D1 og J2 udtryk. Denne adfærd menes at være knyttet til dereguleret proliferation i formationerne af neoplasmi . Desuden har mange eksperimentelle resultater konkluderet den direkte sammenhæng mellem eksosomer og neoplastisk transformation såvel som circrnas mekanistiske virkning på tumormikromiljø . Tager pancreas duktalt adenocarcinom (PDAC) for eksempel har det været forbundet med den unormale høje ekspression af eksosomet circ-PED8A ; eksosomet circNRIP1 fremmer metastatis i gastrisk kræft (GC) ved at svampe miR-149-5p, i en anden undersøgelse. Måske mest signifikant er den rolle, eksosomet circPTGR1 har på udviklingen af hepatocellulært carcinom (HCC) , hvorved opregulering af eksosomet circRNA tilskyndede tumorinvasion. På grund af disse stærkt korrelerende fund foreslås eksosom circrna ‘ er som diagnostiske indikatorer for deres tilsvarende ondartede tumorer baseret på, hvordan respondenten de er i skiftende ekspressionsniveauer og deres fremragende stabilitet kombineret med dens medfødte målrettede leveringsmekanisme . Fra nu af er over 1000 circrna ‘ er blevet identificeret i eksosomer i hele menneskekroppen, hvor der udføres mere forskning på at opdage ekstra eksosom-circRNA-kræftkombinationer.

CircRNA udfordringer og udsigter

på trods af stigende forskning er blevet udført parallelt med stigningen i circRNA popularitet, er den biologiske funktion af de fleste circrna ‘ er stadig et mysterium. For eksempel observeres det, at størstedelen af circrna ‘ er patruljerer i cytoplasmaet, men de stammer fra cellens kerne, så spørgsmålet om, hvordan de passer gennem den lille nukleare pore, rejses. Desuden er det endnu ikke undersøgt, at mange af de cirkulerede eksoner (85%) overlapper hinanden med proteinkodende sekvenser, men størstedelen af cirkrna ‘ er koder ikke for proteiner. På en mere klinisk note kræver de yderligere test for at kunne erstatte traditionelle diagnostiske procedurer fuldstændigt. Bekymringer såsom traumefremkaldende patientvævsekstraktion og dyr circRNA-detektion i væv skal stadig behandles sammen med at opnå en fuld omfattende forståelse af deres sekundære strukturer og forskellige roller indbyrdes. Manglende korrekt administration af egnede circRNA-biomarkører til patienter kan tilsløre kliniske resultater, som skal overvindes ved at få et bedre billede af generationen, lokalisering og nedbrydning af foreslåede circrna ‘ er.

ikke desto mindre er circrna ‘ er stadig attraktive muligheder for udvikling af en række biologiske terapeutiske værktøjer. Der er allerede rapporter om både in vitro og in vivo RNA-konstruktion ved hjælp af gruppe i permuterede intron-ekson (PIE) sekvenser til komplementær målretning af spliceosomal-backsplice-site flankerende sekvenser, og denne mekanisme kan muligvis ekstrapoleres til at omfatte enhver sekvens eller protein med kendt struktur, hvis vi ønsker det. Som en sidebemærkning er der meget plads til forbedringer i at udvide mangfoldigheden af circrnas diagnostiske muligheder. I et eksempel, nuværende molekylær analyse af blod bevares ved analyse af cellefrie fragmenter af genomisk-DNA; Et stort fremtidigt perspektiv ville være at overveje prøveudtagning af sygdomsspecifikke ekstracellulære vesikler for at overvåge sygdomsudbrud og progression med flere detaljer. Disse ideer lægger grundlaget for yderligere forslag til selektiv proteinregulering og programmeret cellesignalering. Som demonstreret gang på gang i igangværende eksperimenter, circrna ‘er har med sikkerhed vist deres svampende og biomarkeringspotentiale, hvilket burde opfordre os til at låse op for hemmelighederne hos de længe misforståede circrna’ er.