Cistron
Biogenese af PTK
de fem PTK-underenheder er kodet af sammenhængende cistroner inden for en enkelt polycistronisk operon , hvis udtryk er reguleret af bvga/S-systemet. Via dette tokomponentsystem kan toksinproduktion moduleres ved tilstedeværelsen af af MgSO4 eller nikotinsyre eller under vækst ved lave temperaturer (til gennemgang, se ). BvgS er et indre membran-spændende protein, der udtrykker flere kinaseaktiviteter. I aktiv tilstand aktiverer den BvgA via phosphorylering. Bvga, en cytoplasmatisk transkriptionsregulator, binder derefter til operatørstederne i PTKS – genpromotorregionen, hvor den interagerer med RNA-polymerasen og aktiverer transkription. Selvom modulatorer, der interfererer med bvgs-signalering, er blevet identificeret, er der ikke kendt nogen bvgs-ligand, der kræves for at udløse signalering, hvilket antyder, at BvgS er aktiveret som standard .
efter transkription produceres de individuelle underenheder som præproteiner indeholdende spaltelige signalpeptider. Ved translokation gennem den indre membran (sandsynligvis via en Sec-afhængig vej) fjernes signalpeptiderne. Selvom signalpeptiderne viser typiske træk ved substraterne for leader peptidase i, er deres spaltning af Escherichia coli leader peptidase i meget ineffektiv. Coekspression af B. pertussis lep-genet i E. coli øger signifikant modningen af PTKS-underenheder . Inden for det periplasmiske rum dannes intra-subunit disulfidbindinger, og holotoksin samles derefter inden sekretion gennem den ydre membran. Der er i alt 11 intra-subunit disulfidbindinger, en i S1, to i hver S4 og S5 og tre i hver S2 og S3 . Alle cysteiner, der er til stede i PTKS, er involveret i disulfidbindinger inden for kæden . Disulfiddannelsen er vigtig for toksinbiogenesen, da ændringen af begge cystein i S1 forhindrer denne underenhed i at samles med B-oligomeren . Korrekt disulfiddannelse er afhængig af dsba / DsbC-systemet, som viste sig at være afgørende for PTKS-samling og sekretion . Mutationer i dsbC, der koder for en af tre disulfidisomeraser, har tilsyneladende ingen virkning på samlingen af toksinet, skønt de forringer dets sekretion, hvilket antyder, at DsbC virker på en komponent, der specifikt kræves til PTKS-sekretion.
sekretion er ikke påkrævet for biologiske aktiviteter af PTKS, men fuld samling af holotoksin er vigtig for effektiv sekretion, da stammer konstrueret til kun at producere S1 eller kun B-oligomeren viser en defekt i sekretion . Imidlertid kan en fuldt funktionel B-oligomer udskilles i en vis grad i fravær af S1 , hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af S1 ikke er et absolut krav til B-oligomersekretion. I modsætning hertil kan S1 alene ikke udskilles i fravær af B-oligomeren, hvilket antyder, at sekretionsdeterminanterne er placeret i B-oligomeren, skønt tilstedeværelsen af S1 helt sikkert kan forbedre sekretionseffektiviteten. Visse mutationer i S1-genet har en stærk skadelig virkning på sekretion, især i området omkring Arg-57 , hvilket antyder, at denne region af S1 spiller en rolle i sekretionen af PTKS. I fravær af B-oligomeren skilles S1 sandsynligvis til den ydre membran, måske via dets C-terminale, hydrofobe domæne. Dette kan være samlingsstedet med B-oligomeren før sekretion gennem den ydre membran .
de molekylære trin i holotoksinsamling er stadig dårligt forstået. Enkelte underenheder i mutantstammer, der ikke producerer de andre underenheder, nedbrydes hurtigt. Visse kombinationer af underenheder synes at gensidigt stabilisere hinanden . For eksempel forbedres stabiliteten af S2–underenheden kraftigt ved tilstedeværelsen af S4 og omvendt, hvilket er i overensstemmelse med S2-S4-dimerdannelsen afsløret af krystalstrukturen af holotoksin. Det er også muligt, at underenheder af S2–S4-dimeren med S1-underenheden dannes i fravær af S3 og S5. S2-S4-dimeren har ikke vist sig at være udskilt i B. pertussis, mens tilsætningen af S1 til denne dimer kan resultere i et vist niveau af sekretion.
transporten af PTKS gennem den ydre membran af B. pertussis er afhængig af et type IV-sekretionssystem (T4SS) sammensat af ni forskellige proteiner, der hedder PtlA gennem PtlI . Disse proteiner er homologe med dem fra T4SSs fra andre bakterier, herunder Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila og Rickettsia prov . Ptl-generne ligger direkte nedstrøms for de fem strukturelle PTK-gener og er under kontrol af PTK-promotoren . Imidlertid synes Ptl-proteinerne at være produceret på lavere niveauer end PTKS-underenhederne, hvilket fremgår af translationelle fusioner af phoA-genet med forskellige ptks-og ptl-gener . Produktionen af visse Ptl-proteiner synes at være et begrænsende trin i udskillelsen af PTKS. Under eksponentiel vækst er bakterierne blevet estimeret til at udskille tre toksinmolekyler/min/ bakteriecelle , og underenheder har vist sig at akkumulere i det periplasmiske rum, både som individuelle underenheder og samlet i holotoksiner. Akkumulering af underenheder sker gennem eksponentiel vækst, selvom niveauerne af visse Ptl-proteiner stiger til mellem 30 og 1.000 molekyler pr. Således kan sekretion snarere end toksinproduktion eller samling være hastighedsbegrænsende. Mærkeligt, i fravær af Ptl–proteinerne, kan nogle underenhedskombinationer, såsom S2-S4-dimeren i nærvær af S1 , udskilles, skønt sekretionen af holotoksin stærkt afhænger af tilstedeværelsen af Ptl-proteinerne.
Ptl-proteinerne menes at danne et kompleks , der spænder over både den indre og den ydre membran, og alle af dem (i det mindste PtlA-H) ser ud til at være nødvendige for toksinsekretion, som undersøgt ved mutationer i hvert enkelt ptl-gen . Nogle af de mutationer, der blev introduceret i trans i vildtype ptl+-stammer, resulterede i en dominerende negativ sekretionsfænotype, hvilket bekræftede, at i det mindste PtlC til PtlH er en del af et multimerisk kompleks. Et vigtigt trin i PTKS-sekretion er åbenlyst dets evne til at krydse peptidoglycanlaget, og PtlE har vist sig at udtrykke peptidogycanase-aktivitet . Dette 276-restlange protein indeholder aktive ligheder på stedet med andre glycohydrolaser, og alaninsubstitutioner på dette sted har vist sig at i høj grad mindske peptidoglycanaseaktiviteten af rekombinant PtlE. De samme substitutioner i naturlig PtlE afskaffer også sekretion af PTKS af B. pertussis, hvilket kraftigt antyder, at PtlE er den peptidoglycanase, der kræves for, at toksinet kan krydse peptidoglycanlaget.
PTK-sekretion kræver sandsynligvis også energi. To af Ptl-proteinerne, PtlC og PtlH, indeholder formodede adenosintrifosfat (ATP)–bindingssteder og kan således tilvejebringe den nødvendige energi til toksinsekretion. Begge proteiner har vist sig at være nødvendige for sekretion , og i begge tilfælde er de formodede ATP-bindingssteder essentielle for funktion. For begge observeres en dominerende negativ fænotype, når mutante alleler udtrykkes sammen med vildtype-allelen, hvilket antyder, at begge fungerer som multimerer eller er en del af sekretionskomplekset. PtlH blev påvist at være forbundet med den indre membran, og mutationer i ATP-bindingsstedet for PtlH påvirker dets cellulære placering og afskaffer dets interaktioner med andre Ptl-proteiner . PtlC ‘ s præcise rolle er endnu ikke kendt. PtlD er også et indre membranprotein og indeholder fem transmembrane domæner. Det er nødvendigt for stabiliteten af PtlE, PtlF og PtlH via dets C-terminal 72 rester. Denne C-terminale region er imidlertid ikke tilstrækkelig til toksinsekretion . PtlF viser træk ved ydre membranproteiner (OMPs), men det kan også være forbundet med den indre membran. Under ikke-reducerende forhold migrerer PtlF og PtlI som et kompleks under natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese, hvilket indikerer, at PtlI binder til PtlF ved dannelse af disulfidbinding . Den korrekte dannelse af disulfidbinding mellem PtlI og PtlF kan afhænge af DsbC, da mutationer i dsbc-genet påvirker sekretionen uden at påvirke toksinsamlingen .
