Clostridium acetobutylicum
A Microbial Biorealm page on the genus Clostridium acetobutylicum
Classification
Higher order taxa
Bacteria (Domain); Firmicutes (Phylum); Clostridia (Class); Clostridiales (Order); Clostridiaceae (Family); Clostridium (Slægt)
arter
Clostridium acetobutylicum
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 betragtes som typen stamme.
NCBI: taksonomi
beskrivelse og signifikans
Clostridium acetobutylicum er en Gram-positiv bacillus (1). C. acetobutylicum er oftest jordboende, selvom det er fundet i en række forskellige miljøer. Det er mesofilt med optimale temperaturer på 10-65 liter C. Desuden er organismen saccharolytisk (kan nedbryde sukker) (1) og i stand til at producere en række forskellige kommercielt nyttige produkter; især acetone, ethanol og butanol (2).
C. acetobutylicum kræver anaerobe forhold for at vokse i sin vegetative tilstand. I sine vegetative tilstande er det bevægeligt via flagella på tværs af hele overfladen. Det kan kun overleve op til flere timer under aerobe forhold, hvor det vil danne Endosporer, der kan vare i årevis selv under aerobe forhold. Først når disse sporer er i gunstige anaerobe forhold, vil vegetativ vækst fortsætte (1).
det blev først isoleret mellem 1912 og 1914 (2). Han dyrkede bakterierne til at producere acetone, ethanol og butanol i en proces kaldet ABE-metoden. Det er således passende, at C. acetobutylicum ofte kaldes “Vismann-organismen.”Produkterne blev derefter brugt til produktion af TNT og krudt i Første Verdenskrig (3). Efter Første Verdenskrig blev ABE-processen meget brugt indtil 1950 ‘ erne, da petrokemiske processer blev mere omkostningseffektive på grund af omkostningerne og tilgængeligheden af oliebrændstofkilder. Den nylige fossile brændstofkrise har ansporet mere forskning i C. acetobutylicum og udnyttelsen af ABE-processen (2).
ud over at være en vigtig bakterie til industriel brug undersøges C. acetobutylicum som model for endosporedannelse i bakterier. Det er blevet sammenlignet med de hyppigst undersøgte endospore bakterier, Bacillus subtilis (2). Forståelse veje endospore dannelse er vigtig, fordi mange endospore danner bakterier er humane patogener, i både bacillus og Clostridium slægter.
den mest undersøgte stamme er type-stammen, ATCC 824. Denne stamme blev opdaget og isoleret i jord fra en Connecticut-have i 1924. Forskning har vist, at den bredt undersøgte ATCC 824 er tæt forbundet med den stamme, der blev brugt i den tidlige industrielle produktion af acetone (2).
Genomstruktur
genomet af Clostridium acetobutylicum ATCC 824 er blevet sekventeret ved hjælp af shotgun-tilgangen. Dette er modelstammen for opløsningsmiddelproducerende bakterier. Genomet består af et cirkulært kromosom og et cirkulært plasmid. Kromosomet indeholder 3.940.880 basepar. 51,5% af generne transkriberes fra den forreste streng og 49,5% fra den komplementære streng (2).
noterede gener, der er fælles for bakterier, inkluderer de 11 operoner, der koder for ribosomer. Det er interessant, at hver af disse operoner er nær oriC (replikationens oprindelse) og orienteret i retning af replikationsgaffelens førende streng. (2). Dette er en karakteristisk almindeligt observeret kendt som gendosering, hvor stærkt transkriberede gener placeres nær oriC. På grund af orienteringen af disse gener vil de blive transkriberet i større antal, mens DNA er i færd med at blive replikeret, og der er yderligere kopier af genet til stede i cellen.
derudover indeholder genomet et stort plasmid (kaldet et megaplasmid). Dette plasmid synes at indeholde næsten alle gener involveret i opløsningsmiddelproduktion og er passende navngivet pSOL1. pSOL1 indeholder 192.000 basepar og koder for 178 polypeptider. Undersøgelse af plasmidet indikerer ingen bias i hvilken streng er kodningsstrengen (2).
når Clostridium acetobutylicum dyrkes i kontinuerlig kultur eller gennemgår mange overførsler, degenererer stammen langsomt, idet den mister sin evne til opløsningsmiddelproduktion. Eksperimenter til at bestemme, hvad der forårsager degeneration, har vist, at pSOL1 indeholder fire gener, der er afgørende for alkohol-og acetoneproduktion. I løbet af mange overførsler eller fortsat vegetativ vækst går dette plasmid tabt. Yderligere bevis for tabet af dette plasmid, der fører til stammedegeneration, er, at mutanter, der mangler disse gener og ikke er i stand til at producere opløsningsmiddel, genoptager acetone-og alkoholproduktion efter komplementering af generne via plasmider (4).
andre, mindre undersøgte stammer af C. acetobutylicum, såsom ATCC 4259, har vist lignende degeneration. Plasmidet i denne stamme hedder PV. Igen antages degeneration på grund af seriel dyrkning af denne stamme at forekomme på grund af eventuelt tab. Denne stamme er værd at bemærke, fordi interessant nok disse degenererede stammer heller ikke sporulerer. Dette har ansporet ideen om, at gener involveret i sporulation også findes på plasmidet i både ATCC 4259 såvel som typestammen, ATCC 824 (4, 2).
energi metabolisme og biprodukter
Clostridium acetobutylicum er en kemoorganotroph. Det opnår energi via substratphosphorylering ved gæring. Som med al fermentering er substratet organiske molekyler, der fungerer som elektrondonor og acceptor. Det følger heraf, at det er heterotrofisk med sin kilde til kulstof, der kommer fra organiske molekyler. Især C. acetobutylicum kræver en kulhydratkilde, der er i stand til at gennemgå gæring for at overleve (1).
derudover er C. acetobutylicum en obligatorisk anaerobe. Det kan kun overleve timer i et aerobt miljø, før det gennemgår sporulation som et middel til at overleve i meget længere perioder i det aerobe miljø. Det viser ingen aktivitet af katalase, et vigtigt for aerobe organismer for at omdanne et giftigt biprodukt af iltmetabolisme, brintoverilte, til vand og ilt (5). Det indeholder dog mange mineraler, der gør det muligt at overleve i mikrooksiske miljøer, f.eks. Disse stoffer opreguleres i nærvær af ilt og bidrager til kortvarig celleoverlevelse i mikrooksiske miljøer (6).
C. acetobutylicum er i stand til at bruge en række forskellige fermenterbare kulhydrater som en energi, såvel som kulstof, kilde. Genomet koder for proteiner, der hjælper med nedbrydningen af Levan, pektin, stivelse og andre polysaccharider (2). Interessant nok, mens gener, der almindeligvis koder for cellusomer, proteinkomplekser, der nedbryder krystallinsk cellulose, er til stede, er organismen ikke i stand til at vokse udelukkende på cellulosesubstrater (7).
der er investeret betydelig forskning i metaboliske veje af Clostridium acetobutylicum for at forbedre industrielle gæringsoperationer. De metaboliske veje, der producerer industrielle nyttige opløsningsmidler, er mest bemærkelsesværdige i C. acetobutylicum. Opløsningsmidlerne acetone, acetat, butanol, butyrat og ethanol stammer alle fra den fælles forløber, acetyl-CoA (2). Ud over disse produkter produceres CO2 og H2 (1).
en anden bemærkelsesværdig metabolisk vej er, at nogle clostridier (inklusive C. acetobutylicum) er i stand til at “fiksere” atmosfærisk nitrogen. Processen med nitrogenfiksering reducerer atmosfærisk N2 til ammoniak, som derefter inkorporeres i molekyler via biosyntese. Dette blev bestemt ved anvendelse af en mærket form af nitrogen, 15N2. Efter sekventering, C. acetobutylicum ATCC 824, en række gener, der meget ligner nitrogenfikseringsgenerne i C. pasteurianum blev fundet, hvilket yderligere bekræfter bakteriens evne til at udnytte atmosfærisk nitrogen (8).
cellestruktur og udvikling
under den tidlige celleudvikling pletter C. acetobutylicum Gram-positivt, men det kan plette Gram-negativt, når kulturen ældes. Under vegetativ vækst har cellen peritrichous flagella (flagella, der dækker hele overfladen af cellen) (1). Øget bevægelighed af bakterierne er blevet impliceret i øget opløsningsmiddelproduktion på grund af kemotaksi. Tiltrækningsmidler omfatter smørsyre og sukker. Bemærkelsesværdige afskrækningsmidler omfatter acetone, butanol og ethanol. Denne mekanisme er logisk ved at lade cellen finde næringsstoffer og bevæge sig væk fra biprodukter produceret af sin egen metabolisme (9).
derudover produceres forskellige biprodukter i forskellige vækstfaser i C. acetobutylicum. Under eksponentiel vækstfase er primære produkter acetat og butyrat. I løbet af denne tid finder kvælstoffiksering også sted (8). Nogen tid efter cellen træder stationær fase (18 timer), produktionen af butanol og acetone peak (1). Denne tidsmæssige adskillelse af nitrogenfiksering og produktion af opløsningsmiddel er fordelagtig for at undgå konkurrence om reduktanter ved de to processer (8).
det store stadium af celleudvikling er karakteriseret ved dannelsen af en endospore. En endospore er den mest resistente celletype, der er kendt. Efter visse miljømæssige signaler producerer den vegetative celle en subterminal septum (1), en begivenhed, der kan ses med elektronmikroskopi . Denne septum bliver til sidst en anden celle, kaldet fororespore, opslugt af den oprindelige celle, kaldet modercellen. Foresporen består af et lag af bark (primært peptidoglycan) og coat proteiner. Disse to meget resistente lag omgiver kernen, som er en stærkt dehydreret cytoplasma. Kernen er defineret af absolut ingen metabolisme, der forekommer i cellen. Modercellen lyser frigive den modne spore. Denne modne spore er modstandsdygtig over for høj temperatur, kemikalier og mange typer stråling, der gør det muligt at overleve i ekstraordinært mange år. På andre miljømæssige signaler, såsom et anoksisk miljø, spirer cellen og begynder den vegetative cyklus igen (10).
Sporedannelse begynder, når cellen udsættes for ugunstige forhold. Aerobe forhold, dannelse af organiske biprodukter og spredning af protongradienten uden for den cytoplasmatiske membran fører alle til sporulation. Dette er i modsætning til modelorganisme af endosporedannelse, Bacillus subtilis, som danner endosporer primært på grund af begrænsning af næringsstoffer (10).
økologi
mens typen stamme af C. acetobutylicum blev isoleret fra jord, C. acetobutylicum er allestedsnærværende. Det er blevet fundet i “sø sediment, godt vand, og Musling gut” (1). Derudover er det blevet registreret i en række forskellige afføringsprøver, herunder fæces fra Mennesker, Kvæg og hunde (1). En søgning i litteraturen afslører, at patogene eller symbiotiske forhold ikke er dokumenteret.
patologi
C. acetobutylicum er fuldstændig godartet for både planter og dyr, men mange andre arter i Clostridium-slægten er kendte patogener, herunder: Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani og Clostridium perfringen. Især producerer C. botulinum og C. tetani nogle af de mest dødelige neurotoksiner, der er kendt (11).
C. acetobutylicum er fundet i den humane kolon, men det vides ikke at være en del af normal menneskelig flora (3). Da organismen ikke synes at være giftig for pattedyr gennem produktion af intracellulære eller ekstracellulære stoffer, skal organismen desuden være til stede i enorme mængder for at producere nogen trussel (12).
det eneste problem med patologi med C. acetobutylicum erhverver gener fra patogen Clostridium, såsom C. tetani eller C. botulinum. Mens der ikke er rapporteret tilfælde af C. acetobutylicum erhverve disse gener, har der været hændelser i litteraturen, hvor andre Clostridium arter har forårsaget spædbarn botulisme med toksiner meget lig dem, der findes i C. botulinum. Ligheden mellem toksinerne antyder, at den normalt ikke-toksigeniske Clostridiumstamme erhvervede toksinkodende gener fra C. botulinum, som sandsynligvis er til stede på et plasmid (13).
anvendelse på bioteknologi
Clostridium acetobutylicum har spillet en vigtig rolle i bioteknologi gennem det 20.århundrede. Oprindeligt var der behov for acetone i produktionen af syntetisk gummi. Han blev ansat til at arbejde på problemet ved Manchester University, og fermentering blev en attraktiv vej til at erhverve den acetone, der var nødvendig for processen. Mellem 1912 og 1914 isolerede han en række stammer. Den bedste produktion ville senere blive kendt som Clostridium acetobutylicum. ABE-metoden, der blev udtænkt af Vismann, gav fordelen ved øget effektivitet i forhold til andre fermenteringsprocesser. Derudover kunne det bruge majsstivelse som substrat, mens andre processer krævede anvendelse af kartofler (3).
udbruddet af Første Verdenskrig i 1914 resulterede i en enorm stigning i behovet for acetone. Det ville vise sig at være et centralt punkt i udviklingen af ABE-processen ved hjælp af Vismanns organisme. Acetonen skulle bruges til fremstilling af røgfrit krudt, kendt som cordit. I løbet af de næste par år vil processen blive brugt i en række store industrifabrikker gennem Storbritannien. Da Storbritannien blev afskåret fra adgang til korn under krigen, blev processen flyttet til fabrikker i Canada. Da USA gik ind i krigen i 1917, åbnede det også en række fabrikker ved hjælp af metoden. Efter krigen sluttede behovet for acetone brat. Fabrikker blev dog stadig brugt til at producere butanol, et nyttigt opløsningsmiddel til fremstilling af lakker til den ekspanderende bilindustri. Tidligere havde butanol været et affaldsprodukt af processen, da fokus var på produktion af acetone. I slutningen af 1920 ‘ erne fortsatte efterspørgslen efter butanol med at eskalere på grund af den voksende bilindustri, og en række nye anlæg åbnede med enorm produktionskapacitet. To sådanne planter lægger 100 tons acetone hver dag. Ud over butanol blev industriel ethanol produceret til en række formål. Den hydrogengas, der blev afgivet ved processen, blev brugt til at hydrogenere olier, der blev brugt til mad. Omkring dette tidspunkt blev melasse det førende substrat for ABE-gæring. Det var billigere og mere effektivt end majsstivelse. Da patentet udløb i 1937, blev der åbnet flere nye anlæg i hele landet såvel som internationalt (3).
men i slutningen af 1950 ‘erne og 1960’ erne begyndte olieindustrien at klatre med en utrolig hastighed. Derudover begyndte prisen på melasse, der blev brugt til gæring, at klatre stejlt. Mens der blev udviklet mere effektive gæringsmetoder, kunne de i sidste ende ikke konkurrere med petrokemisk produktion af de industrielle opløsningsmidler, og de fleste planter blev lukket ned i 1957(3). Men med den fortsatte stigning i oliepriserne har der været siden undersøgelser for at genoverveje fermentering som en kilde til industrielle opløsningsmidler. Nogle af disse processer har forsøgt at øge effektiviteten af processen ved hjælp af genetisk manipulation (14). Andre har undersøgt ved hjælp af affaldsprodukter såsom valle eller træspåner som substrat (15).
aktuel forskning
C. acetobutylicum har været fokus for forskning som en specifik mekanisme for levering af terapeutiske lægemidler til kræftområder i kroppen. C. acetobutylicum er nødvendigvis anaerob, og derfor vil intravenøs injektion af sporer kun resultere i spiring i hypoksiske områder af faste tumorer i kroppen. Genmanipulation af C. acetobutylicum for at producere stoffer, som vil aktivere Pro-lægemidler inden for tumorområdet, giver en ekstremt specifik leveringsmekanisme til disse tumorsteder (16).
nogle af de nyeste undersøgelser har undersøgt alternative metoder til fremstilling af de industrielle opløsningsmidler, som C. acetobutylicum er blevet brugt i det sidste århundrede til at producere. Især har butanol fået særlig opmærksomhed som en mulig alternativ brændstofkilde til biler. Butanol og ethanol, begge produkter af fermentering af C. acetobutylicum, er blevet undersøgt intensivt. Af de to har butanol fordele i forhold til ethanol som brændstofkilde samt mange mulige fordele i forhold til nuværende brændstofkilder, idet det kan give lavere emissioner og øget effektivitet. Den vigtigste faktor i omkostningerne ved butanolproduktion er forbundet med omkostningerne og tilgængeligheden af substratet. Undersøgelser har derfor været rettet mod nye metoder til anvendelse af billige substrater. I en undersøgelse fra 2006 blev butanolfermentering via en ny patenteret proces til erstatning for ABE-processen foreslået. Det indebærer anvendelse af majsfibre (specifikt ksylem), som et substrat for C. acetobutylicum, til fremstilling af billig butanol. Den største fordel ved denne teknik er, at majsfibre er et biprodukt i mange landbrugsprocesser og giver en rigelig kilde til substrat (17).
en anden intens kilde til undersøgelse for C. acetobutylicum er hydrogengasproduktion som en alternativ energikilde. Brintgas indeholder en stor mængde energi, hvilket kan være en yderst gavnlig alternativ gas. Brug af brintgas producerer især ingen kulsyre eller drivhusgasser. De fleste brintgas produceres i øjeblikket ved hjælp af ikke-fornyelige kilder; et alternativt produktionsmiddel via gæring ville være yderst værdifuldt, hvis udbyttet kunne øges enormt. Således undersøges en række forskellige fermenteringsmetoder, der kunne bruges til at forbedre udbyttet i den seneste forskning, der involverer C. acetobutylicum. Især er en trickle bed-reaktor, der bruger glukose som substrat, blevet præsenteret som en mulighed, selvom udbyttet er for lavt til at blive brugt industrielt. Imidlertid ses en form for anvendelse af en trickle seng som et muligt middel til produktioner i fremtiden (18).
taksonomi:NCBI
(1) Cato, E. P., George og S. M. Finegold. 1986. Slægten Clostridium, s.1141-1200. In: P. H. A. Sneath et al. (EDS.), Bergeys Manual for systematisk bakteriologi, Vol. 2. I Baltimore, MD.
(2) Nolling J et al., “Genomsekvens og sammenlignende analyse af den opløsningsmiddelproducerende bakterie Clostridium acetobutylicum.”, J Bacteriol, 2001 Aug;183 (16): 4823-38.
(3) Jones, D. T. og D. R. skoven. 1986. Aceton-butanol fermentering revisited. Mikrobiol. Åb 50: 484-524.
(4) Cornillot, E., R. V. Nair, E. T. Papoutsakis og P. Soucaille. 1997. Generne til dannelse af butanol og acetone i Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ligger på et stort plasmid, hvis tab fører til degeneration af stammen. J. Bakteriol. 179:5442-5447.
(5) H, Bruns MA, Logan BE.(5) Keis, S., Shaheen, R., and Jones, D.T. “Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp. nov. and Clostridium saccharobutylicum sp. nov.” Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001) 51:2095-2103.
(6) Kawasaki, S., Y. Watamura, M. Ono, T. Watanabe, K. Takeda, and Y. Niimura. 2005. Adaptive responses to oxygen stress in obligatory anaerobes Clostridium acetobutylicum and Clostridium aminovalericum. Appl. Environ. Microbiol. 71:8442-8450.
(7) Fabrice Sabathe, Anne Belaıch, Philippe Soucaille (2002) Characterization of the cellulolytic complex (cellulosome) of Clostridium acetobutylicum FEMS Microbiology Letters 217 (1), 15–22.
(8) Chen, J.S., Toth, J., and Kasap, M. (2001) Nitrogen-fixation genes and nitrogenase activity in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. J Ind Microbiol Biotechnol 27: 281–286.
(9) Gutierrez, Noemi A., Maddox, Ian S. Role of Chemotaxis in Solvent Production by Clostridium acetobutylicum Appl. Environ. Microbiol. 1987 53: 1924-1927.
(10) P. Durre og C. Hollergschvandner, initiering af endosporedannelse i Clostridium acetobutylicum, Anaerobe 10 (2004), s.69-74.
(11) Hill, E. O. 1981. Slægten Clostridium (medicinske aspekter), s.1756-1766. In: M. P. Starr et al. (EDS.), Prokaryoterne, Bind II. Springer-Verlag, Ny York.
(12) Gill, D. M. 1982. Bakterielle toksiner: en tabel med dødelige mængder. Mikrobiol. Åb 46: 86-94.
(13) Gimenes, J. A. og H. Sugiyama. 1988. Sammenligning af toksiner af Clostridium butyricum og Clostridium botulinum type E. infektion og immunitet 56:926-929.
(14) Harris, L. M., R. P. Desai, N. E. velkommen og E. T. Papoutsakis. 2000. Karakterisering af rekombinante stammer af Clostridium acetobutylicum butyrat kinase inaktiveringsmutant: behov for nye fænomenologiske modeller til solventogenese og butanolinhibering? Biotechnol. Bioeng. 67:1-11.
(15) McNeil, B. Og B. Kristiansen. 1986. Acetone butanol fermentering. Adv. Appl. Mikrobiol. 31:61-92.
(16) Nuyts s, Van Mellaert L, Theys J, Landuyt h, Lambin P og Anne J. Clostridium sporer til tumorspecifik lægemiddelafgivelse. Anticancer Lægemidler. 2002 Februar;13 (2): 115-25.
(17) Nasib-Liang Li, Stephen Hughes, Badal C. Saha og Michael A. Cotta Butanol produktion fra majsfibre ved hjælp af Clostridium acetobutylicum Biotechnol. Prog.; 2006; 22 (3) s.673 – 680.
(18) h, Bruns MA, Logan BE. Biologisk hydrogenproduktion ved Clostridium acetobutylicum i en umættet strømningsreaktor. Vand Res. 2006 Februar; 40 (4): 728-34.
redigeret af Mark brøler, elev af Rachel Larsen og Kit Pogliano
