Clothianidin seed-treatment har ingen påviselig negativ indvirkning på honningbiekolonier og deres patogener

undersøgelsesdesign

i 2013 blev der i alt 16 felter (8,9 liter 5,4 ha; middelværdi af l.) blev parret efter geografisk nærhed (men adskilt med >4 km) og arealanvendelse (Fig. 1, Se ovenfor). Det omkringliggende landskab blev inspiceret for fravær af blomstrende afgrøder. Men i 2013 forblev to felter i undersøgelsen, selvom et andet raps felt var til stede i nærheden for at bevare så mange gårdspar som muligt34. I hvert gårdspar blev et felt tilfældigt tildelt til at blive sået med clothianidin-behandlede rapsfrø, mens det andet felt blev sået med frø, der ikke blev behandlet med clothianidin (behandlet: 8; kontrol: 8). De samme parrede gårde blev brugt i 2014, men med behandlingerne vendt, dvs.steder med behandlede felter i 2013 havde kontrolfelter i 2014 og omvendt (behandlet: 6; Kontrol: 4). På grund af sædskifte blev forskellige marker inden for hver gård brugt i 2013 og 2014 (Fig. 1, Se ovenfor). For at skabe Fig. 1, Vi hentede et kort fra Verdensgrænsedatabasen (hentbar her: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

oplysninger om omgivende landskabsvariabler for de forskellige bedrifter i 2014 fremgår af supplerende Tabel 7. I 2014 havde halvdelen af de centrale felter yderligere forårssået raps (1-13 ha) inden for en radius på 2 km. De clothianidin-behandlede frø til fokalfelterne blev belagt med Elado, en varemærkebeskyttet blanding af to aktive ingredienser: clothianidin (400 g l-1) og Kurt-cyfluthrin (+80 g l−1), valgt til denne undersøgelse, fordi det var den dominerende frøinsekticid behandling i raps i Sverige og i andre dele af Europa63. Clothianidin optages af planten og distribueres systemisk til alle dens dele for beskyttelse mod insekter64. det anses ikke for at være systemisk, og der blev ikke påvist restkoncentrationer i prøver indsamlet i denne undersøgelse34. Både clothianidin-behandlede og kontrolfrø blev belagt med fungicidet thiram i 2013.

de deltagende landmænd blev instrueret om ikke at bruge andre neonicotinoider i markerne under undersøgelsen, skønt andre insekticidbladspray; primært Plenum (pymetrosin), Avaunt/forvalter (indoksacarb) og Mavrik (tau-fluvalinat; også anvendt som varroacid i biavl) blev brugt til skadedyrsbekæmpelse (supplerende tabel 8). Biscaya, handelsnavn for en sprayformulering indeholdende neonicotinoid thiacloprid, blev imidlertid påført et kontrolfelt i 2013 efterfulgt af en Mavrik spray 1 uge senere og til et behandlet felt i 2014 ved begge lejligheder ved 0,3 L ha−1. Thiacloprid har en betydeligt lavere Akut toksicitet for bier end clothianidin65, og kun spormængder af thiacloprid blev påvist i pollen -, nektar-og biprøverne i 2013 og ingen i 2014. Mens Rundl Larf et al.34 observerede ikke nogen ændring i resultater, når felter, hvor Biscaya blev anvendt, blev udelukket fra analyserne, vi opdagede nogle kvalitative ændringer (supplerende Tabel 9). Disse ændringer kan skyldes de højere thiaclopridrester, der blev påvist i 2014, men kan lige så godt ikke vedrøre Biscaya, men snarere forskellen mellem Biscaya/Mavrik og de anvendte alternative insekticidspraykombinationer 34 eller skyldes reduceret statistisk styrke.

Honningbiekolonier

hundrede og seksten honningbiekolonier blev tilberedt i slutningen af maj 2013 af en professionel biavler i enkelt Langstroth-nældefeber i fuld størrelse indeholdende to kamme med hovedsageligt forseglet yngel (med bier), to fulde honningkager (med bier), en trukket tom kam, fem kamme med voksfundament, bier rystet fra to kamme og enten en 1-årig (84 eksperimentelle kolonier) eller 2-årig (12 eksperimentelle kolonier plus 20 reservekolonier) dronning af kendt afstamning til at producere relativt små, lige store (3418 kr.123 voksne bier; betyder kr.; N = 96 kolonier) kolonier med masser af plads til vækst, der kunne blive stærke nok til at overleve den kommende vinter, men ikke vokse deres plads om sommeren. Seks eksperimentelle kolonier blev anbragt langs feltkanten i hvert af de 16 raps-felter (i alt 96 kolonier) mellem 14.og 28. juni 2013 ved begyndelsen af raps-blomstringen (supplerende Fig. 1). Dronning afstamning og alder blev matchet mellem gårdspar, men kolonier blev ellers fordelt tilfældigt. Kolonier blev holdt på en 60 ha økologisk forvaltet vinter raps felt i fuldt flor før placering på de 16 eksperimentelle felter (supplerende Fig. 1) For at sikre, at kolonivæksten før eksperimentet var baseret så meget som muligt på pesticidfri foder.

da raps blomstrer i forsøgsfeltet var ophørt, blev kolonierne flyttet mellem 2.og 31. Juli (supplerende Fig. 1) til en fælles apiary at overvintre. Den 10.August fik kolonierne en myresyredampbehandling mod varroamider, bestående af 20 ml 60% myresyre gennemblødt i en flad husholdningssvamp placeret under det indre dæksel oven på rammerne. Kolonierne blev fodret med i alt 20 kg sukker pr.koloni i form af en 55-60% v/v saccharoseopløsning, der blev leveret i en foderboks tre gange i løbet af August–September 2013. En yderligere let Varroa-behandling blev udført den 4. December ved at drysse 30 ml 2,6% oksalinsyre i 60% saccharose mellem rammerne direkte på bi-klyngen. I foråret 2014 blev kolonierne flyttet til et organisk forvaltet raps-felt inden placering på de 10 forårssåede raps-felter (supplerende Fig. 1). Kolonier blev overvejet til optagelse i 2014-delen af undersøgelsen, hvis de havde en 2-årig æglægningsdronning i April 2014 (eksklusive kolonier, der døde, blev dronning eller havde 3-årige dronninger i April 2014) og ikke havde sværmet i begyndelsen af juni 2014. Disse begrænsninger ud over kravet om, at kolonier ville blive eksponeret/ikke eksponeret for clothianidin i begge år af eksperimentet, betød, at der i 2014 kun kunne tildeles fire kolonier til hvert felt. Kolonier placeret af behandlede felter i 2013 blev igen placeret af behandlede felter i 2014 for at vurdere de kumulative virkninger af flerårig clothianidineksponering, men blev ellers randomiseret inden placering for at minimere utilsigtede forstyrrelser. Alligevel måtte to kontrolkolonier fra 2013 placeres af et clothianidin-behandlet felt i 2014 på grund af utilstrækkelige kvalificerende eksponerede kolonier til de seks clothianidin-behandlede felter. Der var nok kolonier til rådighed for de fire kontrolfelter. Styrken af kolonier blev udlignet som beskrevet for 2013, men kun inden for hver behandlingsgruppe. Kolonierne blev reduceret og udlignet en anden gang (8.juni 2014), efter at nogle af dem blev for store og forsøgte at sværme (supplerende Fig. 1). Hver reduceret koloni omfattede 1 fuld honningkam (med bier), 3 kamme med hovedsageligt forseglet yngel (med bier) og den oprindelige dronning fra 2013 og 6 kamme med voksfundament. Kolonier blev flyttet til foråret raps felter mellem 16. og 25. juni 2014 og bragt tilbage til det fælles overvintringssted mellem 14.og 22. juli 2014 (supplerende Fig. 1).

Restkoncentrationsanalyser

for at bekræfte eksponering for clothianidin blev 24 voksne honningbier pr.Mark fanget ved indgangen til bikuben, pollenpellets opsamlet fra 5 honningbier, der fouragerede i raps-markerne, og nektar, der blev fjernet fra maven på 5 nektar-fouragerende honningbier i rapsfelterne, analyseret fra hvert sted for clothianidinrester. Pollen (> 25 ml) blev opsamlet ved hjælp af pollenfælder, som blev installeret i 1 dag på tre kolonier pr. Prøver blev håndteret og analyseret som i Rundl Lutf et al.34 og indsamlet under peak bloom-vurderingerne i begge år (supplerende Fig. 1) med koncentrationerne af clothianidin og fire andre neonicotinoider anvendt i Sverige (supplerende tabel 2) kvantificeret ved hjælp af væskekromatografi kombineret med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) og pollen identificeret til rapstype ved hjælp af lysmikroskopi og et pollenreferencebibliotek (se supplerende tabel 2 for detektions-og kvantificeringsgrænser). For yderligere analyser af variationen i neonicotinoid eksponering af honningbier på forskellige steder, vi indsamlede 12 honningbier pr. Denne prøveudtagning blev udført på tre clothianidin-behandlede steder i 2013. Nektar blev ekstraheret fra honningmaven af de indsamlede bier. Koncentrationerne af clothianidin blev derefter kvantificeret i både nektar og bi-væv for hvert bi-individ. Flere detaljer om prøvebehandling for forskellige matricer, LC-MS/MS-metode og kvalitetskontrol er givet i supplerende metoder.

Koloniudvikling, re-dronning og honningproduktion

udvikling af Honningbikolonier blev vurderet af den samme uddannede observatør og en assistent. Tilstedeværelsen af en æglæggende dronning blev etableret såvel som tilstedeværelsen af dronningceller. Hvis en re-dronning begivenhed blev ledsaget af et stort tab af voksne bier, blev det anset for at have sværmet. Hvis der ikke blev observeret noget tab af voksne bier, blev kolonien anset for at være blevet dronning igen gennem supersedure. Kolonihonningsproduktion og-udvikling blev bestemt ved at veje kolonierne og ved at vurdere kolonistyrken ved hjælp af Liebefeld-metoden66, som det samlede antal voksne bier og arealet med begrænset yngel over alle rammer. Antallet af voksne bier blev estimeret ved at tælle honningbier på begge sider af de 10 rammer. Antallet af udjævnede yngelceller (mængde yngel) blev bestemt ved at multiplicere andelen af lukket yngeldækning med 2700, hvilket er antallet af celler på den ene side af de anvendte rammer. Kolonierne blev vejet under vurderinger før eksponering og efter eksponering (ved hjælp af en Mettler Toledo bænkskala, der kan veje op til 32 kg med 1 g præcision) for at estimere honningproduktionen. Fuld honning rammer blev erstattet af tomme rammer under raps blomstre, at tillade kolonien at vokse og reducere sværmer. Både de fulde og de tomme rammer blev vejet til optagelse i beregningen af honningproduktion. Under vurderingen efter eksponering blev så mange honningrammer som muligt fjernet (maks.10% af arealet dækket med overdækket yngel) for at simulere biavlernes honninghøst. Der blev foretaget vurderinger før eksponering på det økologisk forvaltede vintersåede rapsfelt den 6.-17. juni 2013 og den 9. -11. juni 2014 og vurderinger efter eksponering på det fælles overvintrende bigård den 29. juli til 9. August 2013 og den 28. -31. juli 2014 (supplerende Fig. 1). Desuden blev der i April 2014 foretaget en vurdering af forårskoloniens styrke ved at estimere det samlede antal voksne bier og antallet af udjævnede yngle (supplerende Fig. 1). Kolonivurdøren og assistenterne blev blindet under dataindsamlingen med hensyn til felternes behandlingsregime.

indsamling og behandling af patogen – og parasitprøver

der blev taget prøver af omkring 100 voksne honningbier fra hver koloni under vurderinger før og efter eksponering i de clothianidinbehandlede og kontroleksperimentelle rapsfelter i både 2013 og 2014 (supplerende Fig. 1). Bier blev taget fra den ydre kam af hver koloni og bestod derfor af en blanding af husbier og foderbier67. Alle biprøver blev opbevaret ved -20 liter C, indtil laboratoriearbejdet blev udført. V. destruktorangreb for hver koloni blev bestemt ved at vaske de voksne biprøver med sæbevand for at løsne og tælle miderne 68. Underlivene på 60 voksne honningbier pr.koloni (til individuelle kolonianalyser) eller pr. bigård (til de samlede kolonianalyser i 2013, 10 bier pr. koloni) blev fjernet og anbragt i en polyethylenpose med et indre maske (BioReba). Underlivene blev formalet i posen ved hjælp af en støder, og 30 ml nucleasefrit (Milli-K) vand (0,5 ml pr.bi) blev blandet grundigt med prøven for at skabe en homogen suspension. Adskillige 1 ml alikvoter af denne suspension blev fjernet og nedfrosset straks ved -80 C til DNA-og RNA-ekstraktion og som fremtidigt referencemateriale.

parasitter, patogener, symbiotiske mikrober og immungener

de indsamlede biprøver blev vurderet for en række patogene og ikke-patogene parasitter og mikrober for at undersøge påvirkningsplaceringen af kolonier på clothianidin-behandlede felter på deres prævalens og overflod. Organismerne omfattede den allestedsnærværende ektoparasit Varroa destructor, 13 vira: akut bi-lammelsesvirus (ABPV), bladlus-dødelig lammelsesvirus (ALPV), Big Siouch-flodvirus (BSRV), sort dronningcellevirus (CBPV), kronisk bi-lammelsesvirus (CBPV), deformeret vingevirus type-A (DV-A), deformeret vingevirus type-B (DV-B), Israelsk akut lammelsesvirus (Iapv), Kashmir-bivirus (KBV), Sinai-søen-virusstamme 1 (LSV-1) og stamme 2 (LSV-2), sacbroodvirus (SBV), langsom bi-lammelsesvirus (sbpv); to almindelige honningbi-MIKROSPORIDISKE tarmparasitter (Nosema APIs og Nosema CERANAE) og to symbiotiske tarmbakterier (gammaproteobacterium: GILLIAMELLA Apicola og betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). For 2013-prøverne analyserede vi også på bigårdsniveau mRNA-niveauerne af otte honningbi-gener (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1a, Eater-lignende, NimC2, PGRP-S2 og SPH51), hvis ekspression tidligere var blevet knyttet til pesticid -, patogen-og/eller parasiteksponering19, 44 og (social) immunitet i honningbier45.

nukleinsyreekstraktion

DNA blev ekstraheret fra bi-homogenaterne ved hjælp af protokollen til ekstraktion af DNA fra Nosema spores69, som er tilstrækkelig robust til også at ekstrahere DNA fra bakterier og andre mikroorganismer. I alt blev 500 liter primært bihomogenat centrifugeret i 5 minutter i en mikrofuge ved 13.000 omdr. / min. Pelleten blev gentagne gange frosset-optøet med flydende nitrogen og formalet med en steril Teflon-mikropestle, indtil den blev pulveriseret. Den pulveriserede pellet blev resuspenderet i 400 liter Chiagen plantevæv DNeasy AP1 lysis buffer indeholdende 4 liter RNase-a (10 mg ml−1) og inkuberet og rystet i 10 minutter ved 65 oC, hvorefter 130 liter P3 neutraliseringsbuffer (3,0 M kaliumacetat pH 5.5) blev tilsat, efterfulgt af 5 min inkubation på is og centrifugering i 5 min ved 14.000 o / min for at fjerne lysisaffaldet. DNA blev oprenset fra 500 liter af supernatanten ved hjælp af den automatiske kiacube-ekstraktionsrobot efter plant Dneaseprotokollen og eluerede DNA ‘ et i 100 liter nuklease-frit vand. RNA blev ekstraheret af Chiacube-robotten direkte fra 100 liter primær honningbihomogenat ved hjælp af Chiagen-anlægget RNeasy-protokollen (inklusive Chiafræseren til yderligere homogenisering70), og RNA blev elueret i 50 liter-nuklease-frit vand. Den omtrentlige nukleinsyrekoncentration blev bestemt af NanoDrop, hvorefter prøverne blev fortyndet med nuklease-frit vand til en ensartet 10 ng−RPL-1 (DNA og LSV−1(RNA)) eller 20 ng-RPL-1 (For alle andre RNA-prøver) og opbevaret ved -80-rpcr C.

RT-kpcr og kpcr

de forskellige mikroorganismer og vært-mRNA-mål blev detekteret og kvantificeret ved enten et-trins revers transkription-kvantitativ PCR (rt-kpcr) for patogener med et RNA-genom og immun-og internt referencegen mRNA-mål eller ved kvantitativ PCR (kpcr) for organismer med et DNA-genom. Nærmere oplysninger om analyserne er vist i supplerende Tabel 10, supplerende Tabel 11 og supplerende tabel 12. Den omvendte primer til Amel / LRR blev let omdesignet fra Di Prisco et al.19 fordi den ekstremt høje komplementaritet mellem de oprindelige frem-og omvendte primere resulterede i høje niveauer af PCR-artefakter, der dominerede det kvantitative signal. Reaktionerne blev udført i to eksemplarer, i 20 liter (DNA) eller 10 liter (RNA) reaktionsvolumener indeholdende 2 liter (DNA) eller 1,5 liter (RNA) skabelon, 0,4 liter (DNA) eller 0.2 liter (RNA) af frem og tilbage primer og enten Bio-Rad Eva Green-blandingen (DNA) eller Bio-Rad One-Step-blandingen med SYBR Green detection chemistry (RNA). Reaktionerne blev inkuberet i 96-brønds optiske kvpcr-plader i Bio – Rad connect-termocycler ved anvendelse af følgende amplifikationscyklingsprofiler: 10 min ved 50 liter C til komplementær DNA (cDNA) syntese (kun RT-kvpcr): 5 min ved 95 liter C (for at inaktivere den omvendte transkriptase og aktivere tak-polymerasen) efterfulgt af 40 cyklusser på 10 sekunder ved 95 liter C til denaturering og 30 sekunder ved 58 liter C til primerglødning, forlængelse og dataindsamling. Til DNA-assays blev følgende amplifikationscyklusprofiler anvendt: 2 min ved 98 liter C til den indledende denaturering efterfulgt af 40 cyklusser af 5 s ved 98 liter C til denaturering og 10 s ved 60 liter C til primerglødning, udvidelse og dataindsamling. Amplifikationscyklusserne blev efterfulgt af en smeltekurveanalyse for at bestemme specificiteten af amplifikationen ved aflæsning af fluorescensen ved trin på 0,5 liter C fra 65 liter C til 95 liter C. inkluderet på hver reaktionsplade var positive og negative (ikke-skabelon) analysekontroller. For hver type assay (supplerende Tabel 10, supplerende Tabel 11 og supplerende tabel 12) blev der udarbejdet en kalibreringskurve gennem en 10 gange fortyndingsserie med en positiv kontrol af kendt koncentration, der dækkede 6 størrelsesordener, til kvantitativ datakonvertering, fastlæggelse af amplikonens referencesmeltningskurveprofil og estimering af reaktionsydelsesstatistikken.

datakonvertering og normalisering

smeltekurverne for individuelle reaktioner blev evalueret visuelt for at adskille ikke-specifikke amplifikationer, som adskiller sig i smeltetemperaturprofiler fra ægte mål cDNA/DNA-amplikoner. Ikke-specifikke forstærkninger blev slettet fra datasættet. Alle analyser blev kørt i to eksemplarer, hvor gennemsnitsværdien af disse to duplikater blev brugt i yderligere beregninger. Begge duplikater måtte give en positiv kvantitativ værdi og bestå smeltekurveanalysen for de data, der skulle inkluderes i datasættet. De rå RT-kpcr-data for alle bekræftede amplifikationer blev efterfølgende konverteret til estimerede kopiantal for hvert mål-RNA ved hjælp af den tilsvarende kalibreringskurve til analysen. Disse data blev ganget med de forskellige fortyndingsfaktorer under hele proceduren til beregning af de anslåede kopier af hvert mål pr.bee69. Da RNA let nedbrydes, er der en risiko for, at forskelle mellem individuelle prøver i RNA-kvalitet (dvs.nedbrydning) kan påvirke resultaterne70. For at korrigere for dette blev RT-kpcr-analyser for mRNA ‘ et for et fælles honningbi-internt referencegen (RP49) kørt på alle prøver. Dataene for RNA-målene af interesse blev derefter normaliseret til gennemsnitsværdien for rp49 mRNA, hvilket korrigerede dataene for prøvespecifikke forskelle i RNA-kvalitet med hensyn til RT-kpcr-ydeevne70.

statistiske analyser

andelen af honningbiopsamlet pollen, der stammer fra rapsplanter af oliefrø, blev sammenlignet mellem behandlinger (clothianidin frøbehandling/ubehandlet) ved hjælp af en generaliseret lineær model, der antager binominal fordeling og korrigering for overdispersion. Clothianidinkoncentrationerne i nektar og pollen indsamlet af honningbier og i bivæv blev sammenlignet mellem behandlinger ved hjælp af test. For at sammenligne koncentrationerne af clothianidin i bivævet og nektar i individuelle bier mellem felter brugte vi variansanalyser (ANOVA) med feltidentitet som forudsigelse. Desuden var koncentrationerne af clothianidin i vævs-og nektarmaveindholdet hos individuelle bier relateret ved anvendelse af en multipel lineær regression med feltidentitet og koncentration af clothianidin i nektar som forklarende variabler og koncentration af clothianidin i bivæv som responsvariabel.

undersøgelsen fulgte generelt et Før-Efter-kontrol-Impact (BACI) design med en parret feltstruktur gentaget i to på hinanden følgende år på koloniniveau for data om koloniudvikling samt prævalens og overflod af parasitter, patogener og tarmbakterier. Årene, 2013 og 2014, blev analyseret sammen i en fuld model med frøbehandling, blomst, år og deres interaktioner som faste faktorer. Effekten af clothianidin-behandlingen blev vurderet ved interaktionen mellem blomst og frøbehandling, da dette udtryk afspejler forskellen i ændring mellem behandlinger i forhold til raps-blomsten(r). Hvis trevejsinteraktionen (behandling af blomstrende frø) var signifikant (dvs.hvis variablen reagerede forskelligt på clothianidin-behandlingen fra et år til det næste), blev datasættet opdelt efter år og år blev droppet som en fast faktor. Desuden blev datasættet kun analyseret i 1 år, hvis dataene bestod af en stikprøvestørrelse på 10 kg på et år både for mikrobiotaprævalens og overflod (supplerende tabel 1). Kolonier, der sværmede (8 ved kontrolfelter og 10 ved clothianidin-behandlede felter i 2013; en ved et kontrolfelt og to ved clothianidin-behandlede felter i 2014) blev udelukket fra analysen, da sværmning har en stor effekt på koloniens udvikling. Også udelukket er den enkelte koloni, der mistede sin dronning under transport før feltplacering i 2013 (behandlet felt). Eksklusive kolonier, der sværmede fra analysen, ændrede kvalitativt nogle resultater (se supplerende tabel 13). Ændringer i signifikansniveau kan skyldes reduceret statistisk styrke, tilfældig chance eller biologiske effekter.

lineære modeller med blandede effekter (LMM) blev brugt til at teste effekten af clothianidin-behandlingen på koloniudvikling målt som antallet af udjævnede yngelceller (mængde yngel) og antallet af voksne bier. Frøbehandling (clothianidin eller kontrol), bloom (før eller efter raps bloom), år (2013 eller 2014) og deres interaktioner var faste faktorer. Farm pair identitet, gård identitet og koloni identitet blev inkluderet som tilfældige faktorer. Honningproduktionen blev sammenlignet mellem behandlinger ved hjælp af en LMM med gårdspar identitet og gårdsidentitet som tilfældige faktorer. Generaliserede lineære blandede modeller (Glmm ‘ er) blev brugt til at teste indflydelsen af clothianidin-behandlingen på Re-dronning og dødelighed af kolonierne med gårdsidentitet som en tilfældig faktor.

clothianidinbehandlingens indflydelse på forårskoloniens udvikling, målt som antallet af voksne bier og mængden af yngel, blev testet ved hjælp af henholdsvis en LMM og en GLMM med frøbehandling som fast faktor og gårdspar identitet og gårdsidentitet som tilfældige faktorer. For antallet af udjævnede yngelceller brugte vi en negativ binomial fejlfordeling og logaritmisk linkfunktion.

mikrobiom-og varroamiddataene blev analyseret både på deres binomiale (tilstedeværelse/fravær) og kvantitative (overflod) karakter ved hjælp af henholdsvis GLMMs (med binomiale fejlfordelinger og en logit-linkfunktion) og LMMs (med normale fejlfordelinger) med frøbehandling, blomstring, år og deres interaktioner som faste faktorer. Glmm ‘ er på mikroorganisme eller varroamidprævalens omfattede kun koloniidentitet som tilfældig faktor, da den effektive prøvestørrelse (dvs.det mindre hyppige resultat af tilstedeværelses – /fraværsdataene) ikke tillod inkludering af mere tilfældige faktorer. Kun organismer og år med en (effektiv) prøvestørrelse >10 blev analyseret for både prævalens-og overflodsdata. Derudover blev kolonier, der ikke mindst en gang testede positive for en bestemt mikroorganisme, udelukket fra analysen af overflod. Bi-patogen og bakteriel overflod blev logaritmisk (log10) transformeret, da de generelt er eksponentielt fordelt. LMM ‘ er på målorganismens overflod indeholdt gårdspar identitet, gårdsidentitet og koloniidentitet som tilfældige faktorer. 100 bier og kolonivægt blev kvadratrod transformeret for at undgå ikke-normalt distribuerede rester. Konfidensintervaller blev beregnet ud fra profil Sandsynlighed. For kvadratroden transformerede data, estimater blev transformeret tilbage til den oprindelige skala for grafiske illustrationer.

immungentranskripterne var kun tilgængelige i 2013 og på bigårdsniveau, men fulgte også BACI-designet. LMM ‘ er på genekspression indeholdt frøbehandling og blomstring som faste faktorer og gårdsidentitet som tilfældige faktorer.

statistiske dataanalyser blev udført ved hjælp af R bortset fra analyser, der vedrørte verifikation af clothianidineksponering og arealanvendelse, for hvilke SAS 9.4 for vinduer (SAS Institute Inc.) blev brugt . LMM ‘er var fit ved hjælp af lmer-funktionen i lme4-pakken, og Glmm’ er var fit ved hjælp af glmmTMB-funktionen i glmmTMB-pakken i R. P-værdier fra Glmm ‘ er blev beregnet ved sandsynlighedsforholdstest. P-værdier fra LMM ‘ er blev beregnet ved hjælp af ANOVA-funktionen i bilpakken, hvor type III F-test blev brugt til modeller, der indeholder interaktioner, og type II F-test for modeller uden interaktioner (dvs.forårsvurdering og honningproduktion). Virkningerne af faste faktorer blev estimeret ved anvendelse af sum-til-nul kontraster i alle modeller undtagen dem på neonicotinoidrester. Sum-til-nul-kontraster muliggør bestemmelse af hovedeffekter/interaktioner (dvs.estimering uafhængigt af andre uafhængige variabler) og viser virkningerne af faktorer som afvigelser fra Det Store gennemsnit (intercept). For faktorer med to niveauer er størrelsen af afvigelsen for hvert niveau fra Det Store gennemsnit det samme, men retningen adskiller sig. Vi repræsenterer virkninger af faktorer (frøbehandling, blomst, år), som afvigelsen af andet niveau (clothianidin, efter, 2014) fra grand mean. Dette var også tilfældet for interaktioner, således at f.eks. frøbehandlingen, hvor stor en andel af clothianidin-eksponerede kolonier afveg fra den gennemsnitlige ændring i forhold til rapsblomsten i forhold til den gennemsnitlige ændring af begge behandlinger.

effektanalyse

vi udførte effektanalyser for antallet af voksne bier og antallet af udjævnede yngelceller og honningproduktion for at undersøge den effektstørrelse, vi potentielt kunne opdage i betragtning af vores design, replikation og modelvalg. Effekt blev bestemt for en række effektstørrelser ved et nominelt konfidensniveau på Larus = 0,05 ved 1000 Monte Carlo-simuleringer pr.effektstørrelse ved hjælp af simr-pakkenes effektsim-funktion. Effekt blev beregnet for en række effektstørrelser, udtrykt som ændringen i antallet af voksne bier, antal udjævnede yngelceller eller honningproduktion. Ved at dividere effektstørrelsen med det gennemsnitlige antal bier, det gennemsnitlige antal yngelceller eller honningproduktion af alle kontrolkolonier opnåede vi effektstørrelse udtrykt som den procentvise ændring af disse matricer (supplerende Fig. 3). Denne effektanalyse gjorde det muligt at sammenligne vores effektstørrelse med den effektstørrelse, der blev præsenteret af Rundl Larf et al.34. Ved hjælp af den fulde model kunne vi registrere en effektstørrelse for antallet af voksne bier på under 5% med en effekt på 80% sammenlignet med effektstørrelsen Under 20% præsenteret af Rundl Larf et al.34. Dette er endnu lavere end kravene til en effektstørrelse <7% fastsat af EFSA32. Som et resultat af en signifikant interaktion mellem frøbehandling, blomstring og år blev datasættet for antallet af udjævnede stamceller analyseret separat for hvert år. Derfor præsenterer vi her strømanalysen for hvert år. Effektstørrelsen, hvor 80% blev nået, steg fra under 10% i 2013 til lidt under 11% i 2014 (supplerende Fig. 3), sandsynligvis på grund af den reducerede replikation i 2014. Vi udførte også en effektanalyse af honningproduktionen (mængde honning pr.koloni i kg) ved hjælp af datasættet fra begge år, hvilket viste, at en effektstørrelse på under 20% kunne detekteres med en effekt på 80% (supplerende Fig. 3).

Rapporteringsoversigt

yderligere oplysninger om eksperimentelt design findes i Nature Research Reporting Resume, der er knyttet til denne artikel.