COLO 205

vellykket kultur af dine celler:

*læs de vigtige tekniske oplysninger, der følger, før du håndterer ECACC-leverede cellelinjer*. Disse oplysninger er også tilgængelige som PDF fra vores hovedmenu under’ kundesupport ‘ (Klik her).

opbevaring af frosne celler

efter modtagelse skal frosne ampuller straks overføres direkte til flydende nitrogen i gasfasen, medmindre de skal bruges med det samme. Brug ikke en -80 liter C fryser som et alternativ; dette vil resultere i tab af levedygtighed.

Sådan håndteres frosne celler ved modtagelse

ved modtagelse af en forsendelse af frosne ECACC-leverede cellelinjer er det vigtigt, at slutbrugeren straks giver forsendelsen opmærksomhed. Den tekniske rådgivning, der ledsager cellelinjerne, skal konsulteres, inden ampuller fjernes fra tørisen. Korrekt håndtering umiddelbart efter modtagelse er afgørende for en vellykket etablering af cellelinjen i slutbrugerens laboratorium.

på det tidspunkt, hvor en cellelinje bestilles, skal slutbrugere også overveje kulturbetingelserne for den nye cellelinje og sørge for, at det passende medium er tilgængeligt, når cellerne ankommer.

betydningen af celletælling

udfør et levedygtigt celletal, når du genopliver og høster cellekulturer. En af de mest almindelige årsager til manglende etablering af celler i kultur skyldes anvendelse af en forkert levedygtig cellesåningstæthed på tidspunktet for genoplivning, dvs.såning af celler for lave eller for høje. Dette kan undgås ved at udføre et levedygtigt celletal og følge den anbefalede såningstæthed.

for den specifikke cellelinje, du arbejder med, skal du læse oplysningerne under fanen ‘beskrivelse’ på vores hjemmeside. Disse oplysninger kan også findes i Cellelinjedatabladet, som vil blive leveret til dig som en papirkopi med din cellelinjeforsendelse. Såningstætheden er vist i subkulturens rutinemæssige information. Ved såning af celler straks efter genoplivning skal du bruge den midterste til den øvre ende af det givne sådensitetsområde.

genoplivning af frosne celler

det er vigtigt at håndtere frosne ampuller med omhu; brug en laboratoriefrakke, fuld beskyttende ansigtsmaske og handsker. I sjældne tilfælde kan ampuller eksplodere ved opvarmning på grund af udvidelse af fanget resterende flydende nitrogen.

1. I et mikrobiologisk sikkerhedsskab skal du holde et væv gennemblødt i 70% alkohol omkring hætten på den frosne ampul. Drej hætten en kvart omgang for at frigøre resterende flydende nitrogen, der kan blive fanget. Stram hætten igen. Overfør ampullen hurtigt til et 37oC vandbad, indtil der kun er en eller to små iskrystaller tilbage (1-2 minutter). Det er vigtigt at optø hurtigt for at minimere skader på cellemembranerne.
Bemærk: Nedsænk ikke ampullen helt, da dette kan øge risikoen for kontaminering.

2. Tør ampullen af med et væv gennemblødt i 70% alkohol inden åbning.

3. Pipette hele indholdet af ampullen ind i et sterilt rør (f.eks. 15 ml kapacitet). Derefter tilsættes langsomt 5 ml forvarmet medium, der allerede er suppleret med de relevante bestanddele. Bestem den levedygtige celletæthed ved hjælp af trypan blue stain, et hæmocytometer og et omvendt mikroskop for at tælle cellerne eller tilsvarende celletællingsmetode. Overfør det passende volumen af cellesuspension for at opnå den cellesåningstæthed, der anbefales på cellelinjedataindtastningen.

for vedhængende cellelinjer: Juster volumenet af mediet og om nødvendigt kolbestørrelsen for at opnå den cellesåningstæthed, der anbefales på cellelinjens datablad. Et præcentrifugeringstrin til fjernelse af kryobeskyttelsesmiddel er normalt ikke nødvendigt, da den første medieændring fjerner resterende kryobeskyttelsesmiddel. Hvis det er, vil dette blive angivet på databladet. Hvis cellerne skal anvendes med det samme (f.eks. til en cellebaseret analyse) i stedet for subkultureret, kan det være tilrådeligt at udføre et præcentrifugeringstrin for at fjerne kryobeskyttelsesmiddel.

for suspensionscellelinjer*: et præcentrifugeringstrin til fjernelse af kryobeskyttelsesmiddel anbefales, dvs. pellet cellerne ved centrifugering ved 150 g i 5 minutter og opbland cellepelleten i frisk medium ved hjælp af det passende volumen for at opnå den korrekte såningstæthed.

1. Inkuber kolber ved den temperatur og det CO2-niveau, der anbefales på databladet. Hvis der anvendes en CO2-fodret inkubator, skal kolben have en udluftet hætte for at tillade gasudveksling.

Hybridomakulturer fra frosne

ved genvinding af hybridomakulturer fra frosne er det ikke usædvanligt, at væksten oprindeligt er langsommere end forventet, og der kan være et observeret fald i levedygtigheden. Etablering af en aktivt spredende kultur kan tage op til 2 uger.

ved genoplivning er et centrifugeringstrin for at fjerne kryobeskyttelsesmidlet vigtigt. Optø hurtigt den frosne ampul i et vandbad ved 37 liter C i 1-2 minutter. Overfør indholdet til et centrifugerør, og tilsæt langsomt 5-10 ml forvarmede vækstmedier+. Fjern en prøve til tælling. Centrifuger ved 100 g i 2-3 minutter til pelletceller og frø ved en relativt høj densitet på 5-7 105 celler/ml. Placer kulturkolbe fladt og observer regelmæssigt, indtil levedygtige prolifererende celler ses.

+ofte kan hybridomakulturer drage fordel af at blive resuspenderet med medier suppleret med 20% FBS i det tidlige kritiske stadium af kulturetablering straks efter genoplivning.

fremgangsmåde til frysning af celler

ECACC anbefaler at fryse en bestand af din cellelinje(r) kort efter modtagelsen (mellem 2 – 4 gange 106 celler/ml) som en sikkerhedsforanstaltning.

følgende vejledning tilbydes til forberedelse og kryopræservering af cellelinjer.

1. Høst cellerne i logfasen af vækst på samme måde, der anvendes til rutinemæssig subkultur. For klæbende cellelinjer høstes så tæt på 80-90% sammenløb som muligt.

2. Standardproceduren er at bruge 90% serum + 10% kryobeskyttelsesmiddel til alle cellelinjer, medmindre andet er angivet på databladet. Tillad 1 ml for hver ampul. De fleste cellelinjer kan fryses i det passende dyrkningsmedium suppleret med 20% serum og 10% kryobeskyttelsesmiddel. Dette er normalt DMSO, men i visse tilfælde anbefales glycerol. Hvis DMSO ikke er egnet, vil der blive angivet et alternativ på Cellelinjedatabladet.

3. Pelletsceller ved centrifugering, f.eks. 150 g i 5 minutter. Opbland cellepellets i det passende frysemedium for at give en endelig cellekoncentration mellem 2 – 4 gange 106 celler/ml og pipette 1 ml i hver ampul.

4. Frys cellerne med en kølehastighed mellem 1-3OC / min ved hjælp af en programmerbar hastighedsstyret fryser eller egnet alternativ1. Når temperaturen når mindst-130oc, overfør ampullen til en gasfase flydende nitrogenopbevaringsbeholder.