diagnosticering af betændelse og infektion i urinsystemet via proteomics

Prøvekilder til evaluering af urinproteomiske data til urindiagnostiske formål

indsamlingen af 120 urinprøver, der er profileret i denne undersøgelse, var ikke begrænset til diagnose, vurdering af progression eller behandling af en specifik sygdom. Urinalyse (UA) af prøverne blev bestilt af behandlende læger af forskellige årsager, herunder akut skade, vaginal blødning, svimmelhed/kvalme, hyperlipidæmi, type II diabetes og tilhørende komplikationer, mavesmerter/kvalme, uspecificeret hypertension, blærehypertension, idiopatisk polyuri og mistænkt UTI. Da UTI er en meget udbredt infektionssygdom forbundet med nogle af de førnævnte kliniske symptomer (f.eks. mavesmerter/kvalme) og risikofaktorer (f. eks. diabetes), forventede vi hyppig diagnose af bakteriuri eller UTI fra disse prøver. Proteomiske analyser var begrænset til prøver, hvor urinanalyserapporter gav foreløbig støtte til bakterielt forårsaget UTI ‘ er (se metoder). Vi analyserede ikke urinprøver i tilfælde, hvor den specifikke diagnose af asymptomatisk bakteriuri blev stillet til rådighed. Omfattende UA-data blev opnået for alle de 120 prøver. Dette omfattede målepindstest, mikroskopisk undersøgelse af urinsedimenter for forskellige celletyper og slim og – i 46% af tilfældene – urinkulturdata (UC). Data om urinudseende såsom turbiditet, farve og urinpellets farve og volumen blev også gennemgået. Urinalyseresultater muliggjorde en omfattende sammenligning af de konventionelle metoder til diagnosticering af sygdomme i urinvejen med data fra metaproteomiske undersøgelser (yderligere fil 3: Tabel A3).

neutrofiler, de dominerende effektorer af medfødte immunresponser i urinvejen, tegner sig for høje niveauer af betændelse i mange prøver

proteomiske data gav stærke beviser for neutrofilernes vigtige rolle som effektorer og budbringere af betændelse i urinvejen. Neutrofiler frigiver antimikrobielle og inflammatoriske molekyler fra sekretoriske granulater, de producerer og dræber invaderende patogener i fagolysosomer efter deres fagocytose. En hierarkisk klyngeanalyse optimeret til prøvebladrækkefølge (HCLSO) identificerede fire prøveklynger med humane proteinoverflodsprofiler domineret af neutrofiler (23 af 111 tilfælde; NAD1-klynger i Figur 1) og to klynger med neutrofilspecifikke proteinmængder, der kan sammenlignes med dem, der er forbundet med cytoskelet (25 tilfælde; NAD2-klynger i Figur 1). Cytoskeletale proteiner udtrykkes stærkt i epitelceller, der forer urogenitalkanalen og udgør størstedelen af urinsedimentproteomet i fravær af patofysiologiske tilstande i urinvejen. Femogtredive af de 48 nad-klyngeprofiler var positive for ID ‘ er af et uropathogen inklusive G. vaginalis, hvilket tyder på, at en dominerende årsag til betændelse hos de respektive patienter var bakteriuri og et immunrespons mod de invaderende mikrober. Årsagen til afstandene mellem nad-klyngerne i koblingstræet var den betydelige variation i antallet af identificerede humane proteiner, der spænder fra 200 til 1.500 id ‘ er pr.

hierarkisk klyngeanalyse af urinpelletproteomiske profiler til 110 prøver. Hierarkisk klyngedannelse blev udført på kvantitative humane proteindatasæt ved hjælp af TPA-metoden i det maksimale program. Datasættene blev udsat for Pearson korrelationsanalyse med prøveblad ordreoptimering og komplet kobling klyngedannelse ved hjælp af programmelværktøjet MeV . Vi eliminerede protein abundance heat-kortet fra det viste hierarkiske træ i UP-prøverne. Bunden af panelet på venstre side forbinder til toppen af panelet på højre side, da det vedrører træforbindelser. Eksempelklyngenavnene, vist yderst til højre på grafikken med deres akronymer, diskuteres detaljeret i teksten. Farvede søjler angiver typen, størrelsen og placeringen af hver prøveklynge i træet.

neutrofile proteinoverflader afledt af proteomiske data korrelerer godt med LE-aktiviteter og leukocytantal

en vigtig motivation for denne undersøgelse var at bestemme, hvordan proteomiske data afledt af urinsedimenter sammenlignet med konventionelle analyser for at kvantificere niveauer af betændelse i urinprøver. Vi bestemte mængderne af 35 proteiner, der vides at være stærkt udtrykt i aktiverede neutrofiler (yderligere fil 2: Tabel A2) i forhold til total proteinoverflod for hver UP-prøve, som vist i Blue bar-segmenter af plottet vist i figur 2. Ikke uventet var 85% procent af tilfældene, der tilhørte de førnævnte NAD1-klynger, i sektionen af grafen med mere end 30% neutrofilproteinindhold (på venstre side). De 35 proteiner omfattede fem funktionelle grupper: de calciumbindende S100-familieproteiner S100-A8, S100-A9 og S100-A12, som bidrager med 40-50% af det samlede cytosoliske proteinindhold i neutrofiler; proteiner frigivet under inflammation fra neutrofile granulater, herunder myeloperoksidase (MPO), cathepsin G (CTSG), defensin-1 (DEFA1), elastase (Elane), lysosom (lysosom), lactotransferrin (LTF) og cathelicidin (CAMP) ; proteiner involveret i dannelse, handel og fusion af granulater med fagolysosomer, herunder grancalcin (GCA), plastin-2 (LCP1), bilag A3 (3) og tetraspanin (cd63-antigen); proteiner, der påvirker neutrofil migration i miljøet af en REORGANISERENDE ekstracellulær matrice, såsom integrin am/L2, gelatinase (MMP9) og neutrofil collagenase (mmp8); med flere underenheder, herunder cytochrom b-245 (CYBA, figur 3) placeret i membranen af fagolysosomer af fagocytiske celler og ansvarlig for den oksidative burst, der direkte dræber patogener. Mange af disse proteiner, især defensin-1, var meget rigelige i prøver med tegn på UTI ‘ er (f.eks. SA_112 og PM_20, figur 3). De bakterielle patogener i de to tilfælde var S. aureus (SA) og P. mirabilis (PM) og var ikke uventet placeret på venstre side i plottet i figur 2 og støder op til hinanden i en NAD1-klynge (Figur 1). Vi anerkender, at disse data afspejler omtrentlige mængder neutrofiler i betragtning af det faktum, at proteiner som defensin-1, LTF, S100-A8 og S100-A9 også frigives i urinvejen af urotelceller. Hierarkisk klyngeanalyse optimeret til proteinbladrækkefølge (HCLPO) viste imidlertid, at disse proteiner klyngede sig sammen, hvilket understøtter forestillingen om en dominerende rolle af neutrofiler i deres produktion (yderligere fil 4: Figur A1). Eosinofil kationisk protein (ECP), som begge også er effektorer af responsen mod patogener, var en størrelsesorden mindre rigelig end neutrofilafledte proteiner, hvilket således ikke understøtter en vigtig rolle af eosinofiler i den inflammatoriske respons. Den makrofagspecifikke migrationsinhiberende faktor (MIF) var til stede i endnu lavere mængder, hvilket tyder på næsten fravær af makrofager som deltagere i akutte immunresponser efter patogeninvasion i urinvejen.

Proteinprofiler, der viser kvantitative bidrag fra neutrofiler, komplementsystemet og erythrocytter til det samlede proteom af urinpelletprøver. Grafen viser de summerede proteinmængder i forhold til det samlede proteom for tre biologiske proteinkategorier. H-aksen viser identifikatorerne for de UP-prøver, der er forbundet med 110 mennesker. De tre kategorier repræsenterer proteiner produceret af aktiverede neutrofiler (blå), proteiner stærkt udtrykt i erythrocytter og frigivet ved vaskulær skade (grøn) og proteiner forbundet med komplementsystemaktivitet og koagulation (rød). Metoden, der anvendes til kvantificering af alle proteiner, er Ibak-metoden i det maksimale programværktøj. Rækkefølgen af prøver er baseret på neutrofil protein overflod, faldende fra venstre mod højre. For at tillade direkte sammenligninger til vurdering af betændelse blev scoren for LE-analysen inkluderet i grafikken over hver bjælke, der repræsenterer en prøve. Under aksen viser en ekstra bjælke, hvilke prøver der var forbundet med ID ‘et for et patogen, der forårsager UTI (ORANGE farvesegmenter), kommensale bakterier (grønne farvesegmenter) eller mangel på bakterielle id’ er (ingen farve).

overflod af udvalgte neutrofile proteiner i UP-prøver. Tretten proteiner, der er anført i legenden yderst til højre, er neutrofile granulatproteiner. Tre andre proteiner er fibrinogen-lolit (FGB; impliceret i koagulation), hæmoglobin-lolit-underenhed (HBA1; indikativ for vaskulær skade) og uromodulin (UMOD; rigeligt i urinen hos raske donorer). Prøverne SA_112 og PM_20 repræsenterede urinvejsinfektioner forårsaget af henholdsvis S. aureus (SA) og P. mirabilis (PM). Profilen af LG_23 (Lactobacillus) angav manglen på betændelse og repræsenterede urethral kolonisering, muligvis også mindre vaginal forurening af urinprøven. KP_10 (K. pneumoniae) syntes at repræsentere vaginal infektion, da vaginal blødning blev klinisk diagnosticeret for patienten. Proteinprofilerne for EC_13 (UPEC) og KP_55 antydede næsten fravær af betændelse og derfor sandsynligvis urethral kolonisering. Proteiner blev kvantificeret ved hjælp af Ibak-metoden, i hvert tilfælde divideret med de summerede Ibak-værdier for hele up-proteomet.

nad score

repræsentationen af neutrofile proteinmængder i plottet i figur 2 er afledt af nad (neutrofile activation and degranulation) scores også angivet i (yderligere fil 3: Tabel A3). Figur 2 inkluderer LE-score, der spænder fra negativ (N) til spor (T), 1, 2 og 3 for hver prøve. Samlet set observeres en stærk korrelation af neutrofile proteinoverflader og LE-score. LE-score måler leukocytesteraseaktivitet, sandsynligvis repræsenterer primært elastase (ELANE) og myeloblastin (PRTN3), to neutrofile proteaser kvantificeret for otte prøver i figur 3. Alle profiler på venstre side af grafen (figur 2) og treoghalvtreds af de 60 prøver med mere end 30% (Ibak) neutrofilproteinindhold havde LE-score på 2 eller 3. Niogtyve af de 40 prøver med mindre end 23% (Ibak) neutrofilproteinindhold havde LE-score fra negativ til 1. I kun fire ud af elleve tilfælde, hvor LE-scoren var kr2, men neutrofilproteinindholdet var relativt lavt, var det mikroskopiske leukocytantal større end 11 celler pr. Samlet set var der lidt mindre enighed i sammenligningen af leukocyttællinger, der satte tærsklen til 11 celler / HPF med mere end 30% (Ibak) neutrofilproteinindhold: 14 af de 60 tilfælde havde tællinger til 10 (yderligere fil 3: Tabel A3). Sammenfattende synes vurderingen af neutrofilindhold i urinsedimenter via proteomics at være mindst lige så nøjagtig som LE-analysen til diagnosticering af betændelse i urinvejen. Det måler summen af overflod af 35 proteiner beriget i neutrofiler og kan være mindre modtagelige for falske positive resultater sammenlignet med LE-analysen.

overflod af erythrocytproteinindhold tjener som diagnostisk indikator for vaskulær skade

vaskulær skade i urinvejen, typisk forbundet med inflammation, vurderes med dipstick test for hæmoglobin og mikroskopisk tælling af røde blodlegemer i konventionel urinalyse. I betragtning af den høje berigelse af forskellige proteiner i erythrocytter var vi i stand til at udvikle en proteomisk tilgang svarende til konventionelle tests for hæmaturi. Opsummerede mængder af 32 røde blodlegemer proteiner, inklusive hæmoglobinunderenheder, bånd 3 aniontransportprotein, bånd 7 integreret membranprotein, og kulsyreanhydrase-1, i forhold til det samlede proteinindhold i hver UP-prøve blev bestemt, vist ved de grønne stangsegmenter af plottet vist i figur 2. Disse proteinmængder er angivet som ERY-score i (yderligere fil 3: Tabel A3) for hver prøve. Der var ingen tegn på en god sammenhæng mellem hverken NAD-score eller LE-analyseresultater med ERY-score, hvilket antyder, at selv i tilfælde af påvisning af et patogen (vist ved farven på den vandrette bjælke i bunden af plottet i figur 2), neutrofil infiltration af urinvejen medfører ikke altid signifikant hæmaturi og vævsskade. Ved at indstille tærsklerne for hæmaturi til 2+ for målepindetesten og 4, 5% for ERY-score var der enighed blandt 81% af alle tilfælde. I de 21 tilfælde, hvor score var uenige, blev mikroskopiske røde blodlegemer vurderet. Ved hjælp af et antal større end 10 celler pr.højeffektfelt (HPF) som bevis for hæmaturi fandt vi, at den mikroskopiske analyse i to tredjedele af tilfældene var i overensstemmelse med proteomiske data. Vi konkluderer, at de proteomiske ERY-score giver et godt kvantitativt skøn over hæmaturi i urinen.

urinprøver beriget med proteiner impliceret i komplementaktiviteter og koagulation

vi observerede, at HCLPO-analysen blev anvendt på alle urinproteomiske profiler grupperet 21 proteiner med funktionelle roller i koagulationsveje og / eller komplementsystemet (yderligere fil 4: Figur A1). Begrundelsen for måling af proteinmængder vedrørende disse inflammatoriske veje i fællesskab var også baseret på rapporter om omfattende funktionelle interaktioner . Vi identificerede 42 proteiner forbundet med komplementsystemaktiviteter og koagulation (CAC), hvis summerede overflod er inkluderet som CAC-score for hver UP-prøve i (yderligere fil 3: Tabel A3). Komplementsystemet bidrager til den akutte fase respons og medfødt immunitet, og forskellige komponenter er pro – eller antiinflammatoriske. En central komponent er komplementkomponent C3. C3 modnes til opsonin C3b og anafylaktoksin C3a og udskilles i blodplasma og urinvejene efter produktion i renale tubulære celler . C3 spiller en rolle i øvre urinvejsinfektion og optagelse i og ro af UPEC i uroepiteliale celler muligvis forbundet med det kliniske problem med tilbagevendende urinvejsinfektioner . Selvom mængderne af proteiner forbundet med komplementaktiviteter og koagulation ikke var så høje neutrofile proteiner, genererede HCLSO-analysen to prøveklynger, der støder op i træet og med et samlet antal på 12 prøver, kendetegnet ved relativt høj overflod af sådanne proteiner (CAC-klyngerne i Figur 1). CAC-klynger afslørede et lavt antal tilfælde med et ID for et patogen (3 af 12). CAC-scoringer blev afbildet i figur 2 afbildet af de røde stangsegmenter i hver prøve (kolonne). Høje samlede mængder CAC-proteiner korrelerede ikke godt med store mængder neutrofile proteiner, hvilket tyder på, at inflammatoriske aktiviteter medieret af komplementsystemet (f.eks. C3 og C4) og koagulation (f. eks. fibrinogen) kan reguleres separat ved patogeninvasion eller andre belastninger, som urinvejen blev udsat for hos patienter. Høje CAC-og ERY-proteinmængder blev hyppigere observeret at forekomme i tandem. Mange koagulations-og komplementproteiner er faktisk rigelige i blodplasma. Denne kropsvæske lækker ind i urinvejens lumen ved vaskulær skade. Urinalysetest svarende til måling af CAC-score anvendes sjældent i kliniske laboratorier.

udfældning af urinsyresalte og tilhørende proteomiske urinsedimentprofiler

visuel inspektion af de 12 UP-prøver i CAC-klyngerne afslørede, at ni urinprøver var meget uklare og ti urinpiller relativt store med en lyserød til lysebrun farve. Disse træk har været forbundet med høje mætningsniveauer af urinsyre og udfældning af urinsyresalte, især ved en pH under 6, i urinen. Udfældning af urinsyre kan være en forløbertilstand for dannelse af urinsten . Det er rimeligt at antage, at prøvernes uklare udseende bidrog til fejlagtigt at identificere bundfaldene som bakterier under mikroskopi. Kun en klinisk registrering var tilgængelig, der rapporterede forekomsten af nyresten (GV_64). Selvom den proteomiske profil for denne patient ikke var en del af CAC-klyngen, angav de visuelle træk ved prøven også turbiditet og en lyserød til lysebrun urinpelletfarve. Vi antager, at proteiner, der er relativt rigelige i den opløselige fraktion af urin, binder til saltudfældningerne og derfor bidrager til forskellige proteinoverflademønstre i de respektive UP-prøver. Faktisk blev proteiner, der generelt var opløselige i urin og normalt med lav overflod i urinpiller, øget i overflod i nogle CAC-klyngeprøver i forhold til en kontrol uden tegn på UTI og saltudfældninger (LG_21). Eksempler på sådanne proteiner er IgG-Kurt-kæde, AMBP (bikunin) og fibrinogen-Kurt-kæde, som vist i figur 4. Proteinerne defensin – 1 og underenhederne HBA1 og HBD af hæmoglobin blev stærkest forøget i overflod sammenlignet med data for LG_21. Selvom de fleste proteiner vist i figur 4 vides at være forøget i urin og plasma som en konsekvens af lokal skade og bidrager til den akutte fase respons, viste disse data Høj kvantitativ variabilitet. Patologisk betydning, specifikt skade i urinvejen, kan ikke udledes af disse data. Proteomiske profiler blev for nylig rapporteret for urinstenmatricen . Blandt de hyppigst observerede proteiner i stenmatricen var IgG tunge kæder, fibrinogenunderenheder, S100-A8, lysosyme C og LTF, proteiner også vist i plottet i figur 4. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at evaluere værdien af proteomisk analyse for at identificere biomarkører fra urinprøver indeholdende urinsalt udfældes, f.eks. for at vurdere risikoen for dannelse af nyresten.

overflod af udvalgte proteiner i prøver med tegn på saltudfældning i urinen. UP-prøver, der begyndte med nm_ (ingen mikrober), viste ikke tegn på bakteriekolonisering, men urinsedimenterne havde et visuelt udseende, der tyder på urinsyresaltudfældninger og var til stede i to CAC-klynger. LG_21 (Lactobacillus) repræsenterede fraværet af betændelse. Patienten forbundet med prøve GV_64 (G. vaginalis) blev diagnosticeret med nyresten. Ud over de proteiner, der er beskrevet i legenden i figur 3, er andre komplementkomponenten C3 (C3), ceruloplasmin (CP), plasminogenaktivatorinhibitor-3 (PAI-3), AMBP (bikunin), hæmoglobinrus-underenhed (HBD) og immunglobulin-karrus-kæde (ig gamma). Alle disse proteiner er impliceret i den akutte fase respons, som typisk initieres af vævsskade og patogen invasion. Prøveprofilerne viser høj variabilitet af proteinmængder, skønt forskellige akutte faseproteiner blev øget sammenlignet med kontrollen LG_21 i nogle af prøverne.

Urethral kolonisering af kommensale bakterier, der ikke fremkalder værtsimmunresponser

meget parallelle DNA-sekventeringsteknologier har afsløret, at urin ikke er fuldstændig steril, og forestillingen om et urinmikrobiom har udviklet sig som et interessant forskningsemne . Det er sandsynligt, at eksterne dele af urinrøret, især hos kvinder, koloniseres med bakterier fra perineale og vaginale kilder. Det er også tydeligt, at suboptimal opsamling af urin med ren fangst fra kvindelige patienter kan resultere i forurening af urin med proteiner og kommensale bakterier fra vaginalhulen. Data præsenteret her kan forklares ved, men skelner ikke mellem de to ovennævnte scenarier. Cirka 25% af de urinproteomprofiler, der blev opnået i denne undersøgelse, blev beriget for proteiner, der blev udskilt i urinen i et fysiologisk normalt miljø (f.eks. uromodulin og cytokeratiner) eller rigeligt produceret af epitelceller, der blev udgydt af slimhindeoverflader, der forede urin-og vaginale kanaler. HCLSO-analysen identificerede fire klynger (Figur 1), en stor klynge med 15 UP-prøver, afledt af kvindelige patienter med kun to undtagelser. Profilerne afslørede en stor overflod af cytoskeletale proteiner (f.eks. Kurt-actiner og bilag), desmosomale proteiner (f. eks. desmoplakin og periplakin) og cornified cellehylsterproteiner (f. eks. cytokeratiner, cornulinog lille prolinrig protein 3). Proteiner , der tilhører de to første kategorier, er til stede i de fleste celletyper, herunder urotelceller, mens stratificeret pladeepitel placeret i urethral meatus og vaginalkanalen producerer proteiner fra alle disse kategorier rigeligt . Mikroskopisk undersøgelse af urinsedimenter bekræftede det forøgede pladeepitelcelleindhold med scoringer Kurt 2+ for de fleste af de prøver, der er til stede i de fire klynger (yderligere fil 3: Tabel A3), kaldet uromodulin og pladeepitelcelleklynger med vaginale bakterier (USEV) herfra. Uromodulin, et protein , der bidrager til vand/elektrolytbalancen i urinvejen, var også rigeligt i prøverne af USEV-klyngen. Vaginale bakterier (Lactobacillus og G. vaginalis) blev identificeret fra 22 ud af 30 prøver, og bakterier var fraværende i 5 af disse prøver. Proteomiske data bekræftede et meget lavt niveau af betændelse for USEV-klyngerne i 74% af tilfældene i henhold til NAD-score, som det fremgår af positionerne for prøverne i grafikken i figur 2. En repræsentativ profil for USEV-klyngen er LG-23 med en NAD-score på 20% og lave mængder inflammationsassocierede proteiner undtagen defensin-1 og S100A8 (figur 3). Sammenlignet med profilerne for SA_112 og PM_20 var alle proteiner, der bidrog til inflammation, mindre rigelige i LG_23. G. vaginalis kan være et opportunistisk patogen i urin-og vaginale kanaler. Clustering af værtsproteinprofilerne i USEV-klyngerne, valgt til IDS af Lactobacillus, G. vaginalis eller begge arter, indikerede manglen på et stærkt immunrespons mod disse bakteriearter. Vi konkluderer, at den proteomiske analyse har diagnostisk værdi ved at fremlægge bevis for fraværet af en infektion i kvindens urogenitale kanal.

Urethral kolonisering af opportunistiske patogener

USEV-klyngerne omfattede tre tilfælde, hvor almindelige urinvejspatogener blev identificeret, UPEC og K. pneumoniae. De to tilfælde (EC_13 og KP_55) viste lave nad-og ERY-score, hvilket var i overensstemmelse med fraværet af neutrofil-udløst inflammation og vaskulær skade. Relative mængder af proteinerne vist i figur 3 for disse to tilfælde og deres lighed med det mønster, der blev observeret for LG_23, understøttede forestillingen om, at immunresponser, der er karakteristiske for UTI, ikke blev fremkaldt ved kolonisering af bakterierne. Hvorvidt tilfældene repræsenterer asymptomatisk bakteriuri (ASB) kan ikke vurderes på grund af en mangel på viden om molekylært niveau immunrespons for ASB. Sammenfattende understøtter disse data forestillingen om, at proteomiske profiler kan identificere tilfælde af urinrørskolonisering af uropatogener uden aktivering af det medfødte immunsystem.

Vaginal kontaminering med tegn på urogenitale infektioner

HCLSO-analysen genererede en up-prøveklynge, vi kaldte den vaginale kontaminering (VCO) klynge, vist i Figur 1. VCO-klyngeprofilerne indeholdt store mængder cytoskeletale, desmosomale og cornified cellehylsterproteiner, men lave eller moderate uromodulinmængder, hvilket antyder, at vaginalt proteinindhold blev øget i disse prøver. VCO-score, et kvantitativt forhold på fem proteiner udtrykt i cervicovaginal epitelvæv med relativt høj specificitet ifølge databasen TiGER sammenlignet med uromodulin blev beregnet. Disse proteiner var cornifelin, cornulin, serpin B3, galectin-7 og proteoglycan mucin-5b. Neutrofile-specifikke proinflammatoriske molekyler, såsom proteinet S100-A12 og proteiner, der indikerer eller reagerer på vaskulær skade (HBA1 og fibrinogen-Kurt, henholdsvis) var mere rigelige i VCO-klyngen sammenlignet med USEv-klyngen, som vist for KP_10 i sammenligning med LG_23 i figur 3. VCO-klyngen indeholdt 14 prøver, alle undtagen en afledt af kvindelige patienter, hvoraf halvdelen var forbundet med et ID for et uropathogen. I fem prøver blev G. vaginalis eller Lactobacillus identificeret. Klinisk bevis antydede vaginal blødning for patienten vedrørende prøve KP_10, der understøtter diagnosen af en urogenital eller vaginal infektion med K. pneumoniae. VCO-scorerne er inkluderet i yderligere fil 3: Tabel A3. En VCO-score for VCO-og USEV-klyngerne gav en p-værdi på 0,017, hvilket tyder på, at scoren er nyttig til at skelne ingen eller mindre fra større vaginal forurening i urinprøver. Der kan ikke foretages klare vurderinger vedrørende VCO-scorens anvendelighed til at skelne en UTI fra vaginal infektion.

Proteomisk analyse af urinsedimenter identificerer mikrober med følsomhed og specificitetsniveauer, der kan sammenlignes med urinkulturens

vi identificerede bakterier fra 76 UP-prøver og Candida albicans fra en up-prøve (63% af alle analyserede tilfælde). Urinkulturer blev udført i kun 55 tilfælde, hvoraf 44% identificerede mindst et patogen, 24% kommensale organismer og 17% viste ingen mikrobiel vækst (yderligere fil 3: Tabel A3). I forbindelse med patogenidentifikationer var proteomiske data og UC-resultater ikke altid enige (tabel 1). Flere grunde synes at bidrage til uenighederne. Udfordringerne ved at fortolke metaproteomiske data baseret på de identificerede mikrobielle proteiner følger. For det første kan protein-id ‘ er for mindre almindelige uropatogener gå glip af på grund af fraværet af deres proteinsekvenser fra den søgte database. Bakteriearter repræsenteret i databasen blev identificeret via proteomisk analyse (K. pneumoniae og E. faecalis) i to tilfælde, men UC-dataene antydede tilstedeværelsen af de fylogenetisk tætte arter Enterobacter aerogenes og E. faecium, henholdsvis. For det andet er mikrobielle organismer, der er til stede i lav overflod i urinen, vanskeligere at identificere i nærvær af meget rigelige mikrober, især hvis de mikrobielle arter deler omfattende sekvensidentitet blandt ortologe proteiner. EC_85-og kp_11-profilerne i (yderligere fil 5: datasæt A1) illustrerer dette problem og vedrører især Enterobacteriaceae-familien, der forårsager størstedelen af alle UTI ‘ er. Unøjagtige genomiske anmærkninger, f. eks. manglende gener for en art (til stede i UP-prøven) resulterer i identifikation af ortologe proteiner korrekt kommenteret i genomet af en beslægtet art (men fraværende i UP-prøven). Små tryptiske peptider identificeres i en haglgevær proteomisk analyse, hvilket gør forkerte proteinopgaver ved søgealgoritmen mere sandsynlige i tilfælde af stærkt sekvensidentitet. For det tredje kan ID af bakterier, der er til stede i lave tællinger i urinen, mindre end ~ 10.000 celler/mL kombineret med en høj værtsproteomisk baggrund, gå glip af, fordi vært-og mikrobielle proteiner ikke undersøges separat af LC-MS/MS. lave CFU-tællinger for bakterielle organismer ifølge UC-data viste en lavere matchhastighed med proteomiske id ‘ er end høje CFU-tællinger (yderligere fil 3: Tabel A3). I modsætning hertil har proteomiske identifikationer af mikrober fordelene ved, at de er kulturuafhængige, og at de giver information om virulens, antibiotikaresistens, stødt på stress og væksttilstand for de identificerede patogener. To eksempler, der afslører sådanne omfattende data, findes i (yderligere fil 5: datasæt A1). I et datasæt (EC_85) blev proteiner af UPEC, G. vaginalis og Lactobacillus profileret. I det andet datasæt (KP_11) var årsagen til UTI K. pneumoniae. Tabel 1 giver en oversigt over sammenligningen af nitrittesten, identifikation af Enterobacteriaceae i urin baseret på deres evne til at reducere nitrater og UC-resultater med de proteomiske data. 90% af de positive nitrittest vedrørte faktisk tilfælde af bakteriuri med UPEC eller K. pneumoniae som årsagsmiddel og blev uvægerligt identificeret med proteomiske og UC-metoder også. I modsætning til den proteomiske analyse syntes nitritforsøg ikke at være følsomme nok til at identificere Enterobacteriaceae i ti tilfælde. Nitritforsøg var ikke positive i 21 tilfælde, hvor ID fra proteomiske analyser var G. vaginalis. Hvad angår forskelle i patogen-id ‘ er via proteomiske versus UC-metoder, blev kurshemolytiske streptokokker identificeret ved UC-eksperimenter i tre tilfælde, mens proteomiske data antydede tilstedeværelse af G. vaginalis. Som vist i tabel 1 var antallet af matchende id ‘ er for UPEC og i mindre grad K. pneumoniae høje. Sammenfattende viste den proteomiske metode højere følsomhed end nitrittesten og følsomheds-og specificitetsniveauer, der var sammenlignelige med UC. Proteomisk baggrund med høj vært i en urinprøve nedsætter følsomheden for mikrobiel identifikation.