få klarhed: Hydrogelproces skaber gennemsigtig hjerne
KLARHEDSPROCES: samtale med Stanford bioingeniør og psykiater Karl deisseroth. Længde: 3:58
“at studere intakte systemer med denne form for molekylær opløsning og globalt omfang – for at kunne se den fine detalje og det store billede på samme tid — har været et stort uopfyldt mål i biologi, og et mål, som klarhed begynder at adressere,” sagde deisseroth.
“denne bedrift inden for Kemiteknik lover at transformere den måde, vi studerer hjernens anatomi på, og hvordan sygdom ændrer den,” sagde Thomas Insel, MD, direktør for National Institute of Mental Health. “Den dybdegående undersøgelse af vores vigtigste tredimensionelle organ vil ikke længere blive begrænset af todimensionelle metoder.”
intakt voksen mushjerne før og efter den to-dages KLARHEDSPROCES. På billedet til højre kan de fine hjernestrukturer ses svagt som områderne af blurriness over ordene “nummer”, “uudforsket”, “kontinent” og “strækninger.”
forskningen i denne undersøgelse blev primært udført på en mushjerne, men forskerne har brugt klarhed på sebrafisk og på konserverede humane hjerneprøver med lignende resultater, etablering af en vej til fremtidige studier af humane prøver og andre organismer.
“klarhed lover at revolutionere vores forståelse af, hvordan lokale og globale ændringer i hjernestruktur og aktivitet oversættes til adfærd,” sagde Paul Frankland, ph.d., seniorforsker inden for neurovidenskab og mental sundhed ved Hospital for Sick Children Research Institute i Toronto, som ikke var involveret i forskningen. Franklands kollega, seniorforsker Sheena Josselyn, ph.d., tilføjede, at processen kunne gøre hjernen fra “en mystisk sort boks” til noget i det væsentlige gennemsigtigt.
et ubeskriveligt sted
højen af indviklet gråt stof og ledninger, der er hjernen, er et komplekst og ubeskriveligt sted. Neuroscientists har kæmpet for fuldt ud at forstå dets kredsløb i deres søgen efter at forstå, hvordan hjernen fungerer, og hvorfor, sommetider, det gør det ikke.
Karl deisseroth
klarhed er resultatet af en forskningsindsats i Deisseroths laboratorium for at udtrække de uigennemsigtige elementer — især lipiderne — fra en hjerne og alligevel holde de vigtige funktioner fuldt intakte. Lipider er fedtmolekyler, der findes i hele hjernen og kroppen. Især i hjernen hjælper de med at danne cellemembraner og giver hjernen meget af dens struktur. Lipider udgør imidlertid en dobbelt udfordring for biologisk undersøgelse, fordi de gør hjernen stort set uigennemtrængelig både for kemikalier og for lys.
Neuroscientists ville gerne have ekstraheret lipiderne for at afsløre hjernens fine struktur uden at skære eller sektionere, men for en større hitch: fjernelse af disse strukturelt vigtige molekyler får det resterende væv til at falde fra hinanden.
tidligere undersøgelser har i stedet fokuseret på at automatisere udskæring/sektioneringsmetoden eller i behandling af hjernen med organiske molekyler, der kun letter penetrering af lys, men ikke makromolekylære Sonder. Med klarhed har deisseroths team taget en grundlæggende anden tilgang.
” vi trak på Kemiteknik for at omdanne biologisk væv til en ny tilstand, der er intakt, men optisk gennemsigtig og gennemtrængelig for makromolekyler,” sagde Chung, papirets første forfatter.
denne nye form oprettes ved at erstatte hjernens lipider med en hydrogel. Hydrogelen er bygget inde fra selve hjernen i en proces, der konceptuelt ligner forstening, ved hjælp af det, der oprindeligt er en vandig suspension af korte, individuelle molekyler kendt som hydrogelmonomerer. Den intakte hjerne efter døden nedsænkes i hydrogelopløsningen, og monomererne tilfører vævet. Derefter, når” termisk udløst, ” eller opvarmes lidt til omkring kropstemperatur, monomerer begynder at størkne i lange molekylære kæder kendt som polymerer, danner en maske i hele hjernen. Dette maske holder alt sammen, men vigtigere binder det ikke til lipiderne.
med vævet shored op på denne måde, er holdet i stand til kraftigt og hurtigt at udtrække lipider gennem en proces kaldet elektroforese. Hvad der er tilbage er en 3-D, gennemsigtig hjerne med alle dens vigtige strukturer – neuroner, aksoner, dendritter, synapser, proteiner, nukleinsyrer og så videre – intakt og på plads.
Going things one better
klarhed går derefter en bedre. Ved at bevare den fulde kontinuitet i neuronale strukturer tillader klarhed ikke kun sporing af individuelle neurale forbindelser over lange afstande gennem hjernen, men giver også en måde at samle rig, molekylær information, der beskriver en celles funktion, der ikke er mulig med andre metoder.
” vi troede, at hvis vi kunne fjerne lipiderne ikke-destruktivt, kunne vi muligvis få både lys og makromolekyler til at trænge dybt ind i væv, hvilket ikke kun tillader 3-D billeddannelse, men også 3-D molekylær analyse af den intakte hjerne,” sagde deisseroth, der har D. H. Chen professorat.
ved hjælp af fluorescerende antistoffer, der er kendt for kun at opsøge og knytte sig til specifikke proteiner, viste deisseroths team, at det kan målrette mod specifikke strukturer inden for den KLARHEDSMODIFICEREDE eller “afklarede” mushjerne og få disse strukturer og kun disse strukturer til at lyse op under belysning. Forskerne kan spore neurale kredsløb gennem hele hjernen eller dybt udforske nuancerne ved lokal kredsløbsledning. De kan se forholdet mellem celler og undersøge subcellulære strukturer. De kan endda se på kemiske forhold mellem proteinkomplekser, nukleinsyrer og neurotransmittere.
en tredimensionel gengivelse af afklaret hjerne afbildet nedenfra (ventral halvdel). En fly-through video af gnaver hjerne er tilgængelig her.
“at være i stand til at bestemme den molekylære struktur af forskellige celler og deres kontakter gennem antistoffarvning er en kernekapacitet for klarhed, adskilt fra den optiske gennemsigtighed, som gør det muligt for os at visualisere relationer mellem hjernekomponenter på fundamentalt nye måder,” sagde Deisseroth, som er en af 15 eksperter på “dream team”, der vil kortlægge mål for $100 millioner brain research initiative annonceret 2.April af præsident Obama.
og i endnu en betydelig kapacitet fra et forskningssynspunkt er forskere nu i stand til at fjerne den afklarede hjerne, skylle de fluorescerende antistoffer ud og gentage farvningsprocessen på ny ved hjælp af forskellige antistoffer til at udforske forskellige molekylære mål i den samme hjerne. Denne farvning / destaining proces kan gentages flere gange, forfatterne viste, og de forskellige datasæt på linje med hinanden.
åbning af døren
klarhed har derfor gjort det muligt at udføre meget detaljeret, finstrukturel analyse på intakte hjerner-selv humane væv, der er bevaret i mange år, viste holdet. Omdannelse af menneskelige hjerner til gennemsigtige, men stabile prøver med tilgængelige ledninger og molekylære detaljer kan give forbedret forståelse af de strukturelle understøttelser af hjernefunktion og sygdom.
tredimensionelt billede af farvet hippocampus, der viser fluorescerende ekspressive neuroner (grøn), forbinder interneuroner (rød) og understøtter glia (blå).
ud over den umiddelbare og tilsyneladende fordel for neurovidenskab advarede deisseroth om, at klarhed har sprang vores evne til at håndtere dataene. “At omdanne enorme mængder data til nyttig indsigt udgør enorme beregningsmæssige udfordringer, der skal løses. Vi bliver nødt til at udvikle forbedrede beregningsmetoder til billedsegmentering, 3D-billedregistrering, automatiseret sporing og billedoptagelse,” sagde han.
faktisk vil sådanne tryk stige, da klarheden kunne begynde at understøtte en dybere forståelse af store intakte biologiske systemer og organer, måske endda hele organismer.
“af særlig interesse for fremtidig undersøgelse er intrasystemrelationer, ikke kun i pattedyrets hjerne, men også i andre væv eller sygdomme, for hvilke fuld forståelse kun er mulig, når grundig analyse af enkelt, intakte systemer kan udføres,” sagde deisseroth. “Klarhed kan være gældende for ethvert biologisk system, og det vil være interessant at se, hvordan andre grene af biologi kan bruge det.”
andre medforfattere inkluderer bachelorstuderende Jenelle; Ph. d.-studerende, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin og Logan Grosenick; forskningsassistenter Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirsabekov, Sally Pak og Charu Ramakrishnan; postdoc-forskere Aaron Andalman, ph. d. og Tom Davidson, ph. d.; tidligere bachelorstuderende Hannah Bernstein; og tidligere personaleforsker Viviana Gradinaru.
forskningen blev støttet af National Institute of Mental Health (grant MH099647); National Science Foundation; Simons Foundation; præsidenten og Provost for Stanford University; det er en af de mest populære og mest populære måder at gøre dette på.
Stanfords Institut for Bioengineering støttede også arbejdet. Afdelingen drives i fællesskab af School of Engineering og School of Medicine.
