Gap junction protein Conneksin-43 er en direkte transkriptionel regulator af N-cadherin in vivo

Embryo manipulation

voksen laevis blev opretholdt på 17 kg C og anvendt i henhold til reglerne for den biologiske serviceenhed ved University College London i overensstemmelse med de britiske hjemmekontorretningslinjer, der er fastlagt i Dyreloven 1986 som Beskrevet45. Laevis embryoner blev opnået og iscenesat som tidligere beskrevet46, 47. For specifikt at målrette mod den neurale Kam blev embryoner injiceret i dyrets ventrale blastomerer i otte-celletrinnet på den ene side til alle eksperimenter, undtagen når embryonale lysater blev anvendt. I dette tilfælde blev embryoner injiceret i begge dyresider af tocellede embryoner. Embryo mikroinjektioner blev udført i henhold til48. Om nødvendigt blev fluorescein-dekstran (FDK; Invitrogen, D1821, 20 ng) eller rhodamin-dekstran (RDK; Invitrogen, D1824, 20 ng) anvendt som sporstoffer. Oligomorpholinos mod laevis CH43 (Ch43mo1; 8-24 ng, 5′-TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Ch43mo2; 8-24 ng, 5 ‘-AAAAATGGTTTTCTCTGTGGTCGA – 3′) og BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-aacggaccggtttaaaggcttcct-3′) blev syntetiseret og leveret af Gene Tools LLC. Ækvimolære koncentrationer af standard kontrol morpolino (CTLMO: 3′-atatttaacattgactccattctcc-5’) blev anvendt. Mængderne af morpholinos svarer til de mængder, der injiceres i den ene side af otte-celletrinsembryoner, mens den anden side blev brugt som en intern kontrol. Når embryoner blev anvendt til opsamling af embryonale lysater, blev de injiceret i tocellet stadium i begge dyreblastomerer, og dobbelt af de nævnte doser blev anvendt. For at teste effektiviteten af Cks43mos på det endogene cks43 mRNA udførte vi vestlig blot-analyse. Begge Cks43mos sænkede effektivt proteinniveauerne af den endogene Cks43fl og Cks43iso (Fig. 3a, b). For at validere btf3mo-effektivitet testede vi ved immunfarvning af neurale kamceller btf3-proteinekspression, som viste nedsatte niveauer af BTF3 i BTF3MO-celler sammenlignet med Ctlmo (supplerende Fig. 3a).

in situ hybridisering blev udført som tidligere beskrevet49,50. Kort blev embryoner fikseret i MEMPFA efterfulgt af hybridisering natten over med digoksigeninmærkede prober, inkuberet med et AP-antistof, og AP-aktivitet blev udviklet under anvendelse af NBT/BCP-substrater. DIGOKSIGENIN-mærkede RNA-prober blev fremstillet til ræv348 snail251, vrid52, n-cadherin53, C353, btf3 (ksenbase: Hl075i22) og sok1054, sok954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0.8 mg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), og twist (0.7 µg/ml) blev anvendt til at vurdere neurale crest induktion, twist (0.7 kg / ml) til neural crest migration, n-cadherin (1 kg/mL) til vurdering af ekspressionsniveauer og btf3 (0,7 kg/mL) ekspressionsmønster. Helmonteret immunfarvning blev udført som tidligere beskrevet55 ved anvendelse af Cks43-antistof (1: 1000, Sigma, C6219). Kort fortalt blev embryoner fikseret i MEPMFA og inkuberet natten over med antistoffet ved den beskrevne fortynding.

dyrekapseksplanter blev dissekeret fra Ksenopus blastulas (trin 8) ved hjælp af en standardteknik 48,56 og forberedt til in situ-hybridisering som beskrevet ovenfor. Til dyrehætteanalyser blev 500 pg mRNA injiceret i dyresiden af de to blastomerer i tocelletrinsembryoer. Analyse af ISH blev udført på 20-25 embryoner pr.

Neural crest manipulation og billeddannelse

neural crest transplantationer blev udført som tidligere rapporteret57. Kort fortalt, neurale kam taget fra trin 18 fluorescerende mærkede embryoner blev dissekeret med øjenbrynsknive og podet i umærkede værtsembryoner. Til in vitro-eksperimenter blev kraniale neurale kameksplantater dissekeret i trin 18 ved hjælp af en standardteknik 58,59 og belagt på fibronectin (Sigma, F1141) belagte retter som tidligere beskrevet53. Til enkeltcelleanalyser blev neurale kamceller kort dissocieret i Ca2+ / Mg2+-fri Danilchick medium53. For hver tilstand blev ti embryoner transplanteret med fluorescerende mærket NC analyseret pr.

immunfarvning blev udført på neurale kameksplantater som tidligere beskrevet54 ved anvendelse af anti-N-cadherin (1:50, rotte IgG, klon MNCD2, DSHB), anti-E-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Billeddannelse af in vitro neural crest migration blev udført ved hjælp af time-lapse cinematografi som beskrevet tidligere53,60. Kort fortalt blev neurale kamceller dyrket i petriskåle af plast eller glas belagt med fibronectin, og time-lapse-mikroskopi blev startet efter en times in vitro-kultur. Til cellemotilitet og migration blev sammensatte mikroskoper (enten et Eclipse 80i Nikon-mikroskop med et Hamamatsu-digitalkamera eller et Dmrk-2 Leica-mikroskop med et Hamamatsu-digitalkamera styret af simpelt PCI-program) udstyret med motoriserede trin og en 10 liter/0,30 na tør linse blev brugt. NC-kulturer blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Billeder blev erhvervet hvert 5. minut i en periode på 12 timer. til cellemorfologiafbildning blev der anvendt et TCS SP8–mikroskop med en 63 liter /0,90 na-objektivlinser til nedsænkning af vand og kontrolleret af LAS-af-programmer. Faste celler blev afbildet ved hjælp af et 63 liter /1,4 NA oliedybningsmål og et Leica TCS SPE konfokalt mikroskop styret af LAS–af-programmer.

til konstruktionslokalisering eller endogene if-niveauer blev 10-15 NCC ‘ er analyseret for hver tilstand pr.

cellemigration og cellemorfologianalyse

Kemotaksianalyse blev udført efter en standardprocedure61 ved anvendelse af heparinakrylperler (Sigma, H5263) belagt med 1 liter/mL oprenset human stromalcelleafledt faktor-1 (Sigma, SRP3276). Cellemotilitet og kemotakse blev analyseret ved hjælp af ImageJ (https://imagej.nih.gov) analyseværktøjer, som beskrevet tidligere53,60. Kort sagt blev hver enkelt celle manuelt sporet ved hjælp af Imagejs manuelle Sporingsplugin, dataene blev indsamlet og analyseret ved hjælp af Imagejs Kemotaksiplugin. Cellemorfologi blev vurderet ved at implementere cirkularitetsindekset (komplet cirkel = 1) og estimeret af ImageJ analyseværktøjer. Celledispersion blev analyseret ved hjælp af Delaunay trianguleringsalgoritme (ImageJ Plugins) og blev afbildet som gennemsnitligt eksplanteret trekantområde, som beskrevet før54. Celle fremspringende område blev analyseret i neurale kamceller ved kanten af en eksplantat, der måler udvækningsområdet, der stammer fra to på hinanden følgende tidsrammer med 4 min tidsinterval; disse to på hinanden følgende rammer blev trukket fra for at generere det nye område12. Til analyse af cellekemotakse og celledispersion blev 10-15 eksplantater analyseret pr. For cellemotilitet blev cellemorfologi og cellefremspring 15-25 NCC ‘ er analyseret pr.

Molekylærbiologi, plasmider og reagenser

til cDNA-syntese blev Total RNA isoleret fra 10-15 embryoner trin 23-24 eller 10-15 dyrehætter trin 8 fra laevis pr. betingelse for hvert uafhængigt eksperiment, og tre tekniske replikaer blev anvendt inden for hvert eksperiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) som skabelon. Fuld længde CH43 (ch43fl, aa 1-379), CH43 carbokset terminalt afkortet konstruktion (Ch43trunc, aa 1-212) og CH43-20K konstruktion (ch43tail, aa 213-379) blev klonet i 5 ‘Bamhi/3’ Hoi af pCS2+ eller pCS2-EGFP vektorer. PCS2-EGFP-vektoren blev venligt leveret af Dr. Masa Tada. Den inducerbare konstruktion af Ch43tail blev fremstillet ved sammensmeltning af CH43-20ktail (aa 219-379) til ligandbindende domæne af det humane GR (aa 512-777). 43 – 20k blev klonet til 5 ‘EcoRI/3’ Aci og GR til 5 ‘Aci/3’ Hoi af pCS2+ og pCS2-EGFP. Btf3-konstruktioner blev syntetiseret ved hjælp af H. laevis sekvens fra cDNA klon (UniGene ID 3536). BTF3FL (aa 1-162) blev klonet til 5 ‘EcoRI/3’ Ohoi af pCS2+ eller pCS2-EGFP. Btf3-sletningskonstruktion, der mangler NLS-regionen RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) blev klonet i 5 ‘Ambamhi/3’ Clai af pCS2+. Til BiFC-eksperimenterne (Fig. 4b, c), Ch43tail og Ch43trunc blev klonet i 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi af pCS2-VC155. BTF3FL blev klonet i 5 ‘Ambamhi / 3’ Ambamhi af pCS2-VN9m. BiFC-vektorer blev venligt leveret af Prof James C. Smith. Alle konstruktionssekvenser verificeres ved automatiseret DNA-sekventering (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); 213 CH43 (800 pg/embryo,63).

Al analyse på fluorescerende konstruktioner blev vurderet ved normalisering til baggrundsfluorescens og om nødvendigt til Total cellearealfluorescens.

følgende reagenser blev anvendt: flufenamic syre (50 µM til NC eksplantation inkubation −100µM for fosteret behandling, Sigma, F9005), meclofenamic syre (50 µM til NC eksplantation inkubation −100µM for fosteret behandling, Sigma, M4531), actinomycin-D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) og ethanol-opløst dexamethason (10 µM) blev tilføjet til kultur medium på faser 14-15 og vedligeholdes indtil neurale crest vandrende embryonale stadier (stadium 23). For at kontrollere den mulige lækage af inducerbare kimærer blev et søskendeparti embryoner dyrket uden deksamethason og behandlet til in situ hybridisering. Til koblingstest (testing gap junction channel activity) blev 10-15 NCC ‘ er analyseret pr.

Immunudfældning, fraktionering og vestlig blotting

for hver tilstand blev der anvendt 10-15 embryoner til fremstilling af embryolysater pr.eksperiment. Hele embryoner blev forberedt til vestlig blot efter homogenisering i lysisbuffer (20 mm Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-h, pH 8,0) med tilsatte proteasehæmmere (Roche, 11836153001) og phosphatasehæmmere (Roche, 04906837001)54,64. For vestlige blots blev følgende antistoffer anvendt: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); kort fortalt blev cellerne suspenderet i lysisbuffer og centrifugeret ved 20.000 liter g i 5 minutter ved 4 liter C, supernatanten blev genvundet og volumenet justeret med fortyndingsbuffer. Perler blev ækvilibreret i fortyndingsbuffer og blandet med det resuspenderede cellelysat. Blandingen blev magnetisk oprenset og forberedt til vestlig blot. Laevis embryoner blev udført under anvendelse af differentielle centrifugeringsprotokoller med modifikationer64, 65. 18. laevis embryolysater ved anvendelse af en 22 g nål og 20 homogeniseringsbuffer (HB: 250 mM saccharose, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, phosphatase og proteasehæmmere) pr.embryo. Alle prøver blev centrifugeret ved 250 liter g i 5 minutter for at fjerne embryonrester. Efter opsamling af supernatanten blev den fordelt til tre forskellige rør og spundet med tre forskellige hastigheder (400 liter g, 600 liter g) i 5 minutter for at isolere cellekernerne. De postnukleære supernatanter blev opbevaret til videre behandling. De nukleare pellets blev igen vasket i buffer HG og centrifugeret med den passende hastighed (400 liter g, 600 liter g). Nukleare pellets blev derefter resuspenderet i 40 liter 10% glycerol/0,1% SDS/1% Triton i HB. Passende mængde prøvebuffer blev tilsat til hver prøve, og prøver blev behandlet til acrylamidgelelektroforese og vestlig blot-analyse. For at undgå belastningsfejl blev den samme membran blottet mod belastningskontrollen efter stripping som beskrevet før54,64.

vestlige blot data blev analyseret ved hjælp af ImageJ analyseværktøjer. Billedintensiteter blev normaliseret og forholdet mellem proteinet af interesse for belastningskontrol (dvs. Blev beregnet, gennemsnitlige forhold blev tegnet. Uncropped blots er inkluderet som supplerende tal(supplerende Fig. 5–7).

cellekulturer

HeLa-celler blev dyrket i Dmem suppleret med 10% føtalt kalveserum (Life Technologies, CA, USA) ved 37 liter C i en befugtet atmosfære på 10% CO2 og transficeret som angivet ved hjælp af Rottifect (Carl Roth, Tyskland) i henhold til producentens anvisninger.

embryonale fibroblaster blev dyrket i 67% DMEM/H2O suppleret med 10% føtalt kalveserum ved 25 liter C i en befugtet atmosfære på 5% CO2 og transficeret som angivet ved anvendelse af Viafect (Promega, USA). Plasmider til transfektion var som angivet, og 10-20 hela-eller HTC-celler blev analyseret for hver tilstand pr.

for siRNA-eksperimenter blev en kombination af tre siRNA målrettet mod BTF3 transficeret som beskrevet ovenfor. En standard siRNA (scrambled siRNA fra Sigma) blev brugt som kontrol. Katalognummer for disse kommercielle siRNA mod BTF3 er: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion og behandlet til kpcr, vestlig blot eller immunhistokemisk forsøg. Som beskrevet i de respektive afsnit.

alle cellelinjer blev testet for mycoplasma kontaminering.

immunhistokemi og phalloidinfarvning

til proteindetektion blev pattedyrceller eller neurale crest-eksplantater fikseret i 4% formaldehyd i 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton H-100) i 10 minutter og blokeret med 10% NGS i 1 time. Primære antistoffer blev inkuberet på ved 4 liter C i 10% NGS. Følgende antistoffer blev anvendt: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 g/ml anti-n-cadherin (Mncd2 Developmental Studies Hybridoma Bank) og 1:100 G43 (Sigma, C6219) i 10% NGS og inkuberet på ved 4 g C. eksplantater blev vasket 3 gange med PBS + 0,2% mellem-20 og inkuberet på ved 4 g C med sekundær antistof, fortyndet ved 1:350 i 10% NGS. DAPI blev fortyndet ved 1: 1000 og blandet med de sekundære antistoffer.

massespektrometri

til co-immunudfældning af den FLAGMÆRKEDE Cks43tail til massespektrometriske analyseceller blev lyseret, og lysater blev inkuberet natten over med anti-HA og ækvilibrerede perler med høj affinitet ved 4 liter C blev immunudfældningerne derefter vasket og elueret27. Efterfølgende af syreeluering med 0,1 M glycin pH 2,5 blev eluaternes pH justeret til pH 8,0 med 0,5 m Tris. Til proteinfordøjelsesprøver blev inkuberet natten over med 2 liter trypsin (Trypsin Gold, Promega, USA) efterfulgt af tilsætning af 0.1 liter Lys-C (Roche, Tyskland) og inkubation i yderligere 6 timer. peptiderne blev afsaltet på C-18 omvendte fasetrinspidser (Nest Group, USA), tørret i vakuum og opbevaret ved -20 liter C indtil analyse. Tørrede peptidblandinger blev udvundet i 3 liter 30% myresyre og fortyndet med vand til 23 liter. Fem C-18 C-kolonner blev injiceret på et Nano-LC-system (Eksigent425 2D Nano-LC; Scieks, USA), og peptider blev adskilt ved omvendt fasekromatografi på C-18-kolonner, der blev fremstillet internt (Reprosil-Pur C18-AK, 1,9 k, Dr. Maisch, Tyskland, PicoFrit-kolonner, 75 K-i.d., Ny Obejctive, USA) i en lineær gradient på 100% eluent A (0,1% myresyre) til 55% eluent B (60% actenitril, 0,1% myresyre) på 120 min. LC-systemet blev opsat som udluftet søjle, og prøven blev belastet og afsaltet ved en strømningshastighed på 400 nl/min, og adskillelsen blev udført ved en strømningshastighed på 200 nl/min. Nano-LC-systemet blev bindestreg til massespektrometeret (K-krævende HF, Termovidenskabelig, Tyskland), som blev betjent i dataafhængig tilstand. Data fortolkning blev udført med Mascot V2.2 (Matricience, UK) og Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK). Data fortolkning blev udført med maks. V1. 6.1.0 og Perseus V1.6.1. 3 (MPI for Biokemi, Tyskland).

Koblingsassay

Gap junction intracellulær kommunikation blev testet ved hjælp af en farvekoblingsassay. Her blev det fluorescerende farvestof Calcein-AM (Sigma, 17783) anvendt. En neurale kampopulation dissekeret fra ikke-injicerede embryoner blev inkuberet med farvestoffet Calcein-AM i cirka 10 minutter, eller indtil farvestoffet blev indlæst i alle cellerne. En anden neural crest population fra embryoner injiceret med en nuklear markør (nRFP mRNA injektioner, se ovenfor) blev dissekeret separat. Efter at de to populationer var dissocieret i fravær af calcium og magnesium, blev de blandet og inkuberet i 1 time ved 14 liter C i et reagensglas. Efter mild centrifuge blev de neurale kameksplantater skåret i stykker af samme størrelse og dyrket som beskrevet ovenfor og derefter filmet. For at teste kanalaktiviteten af spalteforbindelser blev gap junction blokkere; meclofenaminsyre (Sigma, M4531) og flufenaminsyre (Sigma, F9005) anvendt. Cellekommunikation blev vurderet ved at estimere forholdet mellem antallet af celler, der viser begge sporstoffer, den nukleare markør og Calcein til det samlede antal celler, der har den nukleare markør.

statistisk analyse

estimeringen af stikprøvestørrelsen blev udført ved at følge tidligere offentliggjort arbejde, og der blev ikke anvendt nogen specifik statistisk metode. Eksperimenter blev ikke randomiseret, og på grund af arten af eksperimenterne blev forfatterne ikke blindet for tildeling under begge eksperimenter og resultatanalyse. Kun levedygtige embryoner og eksplantater blev analyseret. Mis-injicerede embryoner blev ikke inkluderet i In situ hybridiseringseksperimenter. Korrekt injektion blev bestemt ved injektion af lineære sporstoffer. Vores eksperimentelle parametre blev målt tilfældigt, når levedygtige og korrekt injicerede embryoner blev valgt.

sammenligning af procenter blev udført ved hjælp af beredskabsborde66. Normaliteten af datasæt blev testet ved hjælp af Kolmogorov–Smirnovs test, d ‘ Agostino og Pearsons test og Shapiro–Vilks test ved hjælp af Prism6 (GraphPad). Datasæt efter normalfordeling blev sammenlignet med studerendes t – test (to-tailed, ulige afvigelser) eller ANOVA med en Dunnetts flere sammenligninger efter test ved hjælp af Prism6 (GraphPad). Datasæt, der ikke fulgte en normalfordeling, blev sammenlignet ved hjælp af Mann-test eller en ikke-parametrisk ANOVA (Kruskal Vægis med Dunns flere sammenligninger efter test) ved hjælp af Prism6. Krydssammenligninger blev kun udført, hvis den samlede P-værdi af ANOVA var mindre end 0,05. I alle figurlegender N = antal uafhængige eksperimenter; n = samlet prøvestørrelse.

E. laevis n-cadherin delvis promotoridentifikation

for at identificere den grundlæggende promotor af Ksenopus n-cad brugte vi følgende strategi. Den grundlæggende promotorregion fra kylling-og pattedyrs n-cadherin-gener er blevet beskrevet i 5′ – UTR-regionerne inden for positionen -3000 til -1 BP respekterer oversættelsesinitieringsstedet41, 67. Ved at bruge laevis Genome Project resource (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) identificerede vi en region på 2800 bp i 5′-UTR af laevis n-cadherin genet (supplerende Fig. 4). Da vores data indikerer, at Cks43tail, BTF-3 og Pol II udgør et kompleks, bruger vi ElemeNT tool68 til at søge efter potentielt aktive TATA-bokse i den region, vi isolerede. Vores in silico-analyse afslører en TATA-boks rig region mellem positionerne -166 til -618 bp i forhold til oversættelsesstartstedet (supplerende Fig. 4). Endelig designer vi overlappende primere for at forstærke fragmenter på 200 bp i hele denne region. Primersekvenser er angivet i Chipsektionen, og deres bindingsområder er fremhævet i supplerende Fig. 4.

kromatin-immunudfældning(ChIP)

for kromatin-immunudfældning (ChiP) fulgte vi en standardprocedure for H. laevis-embryoer69, 70. For hvert uafhængigt eksperiment brugte vi to tekniske replikaer og 250-300 embryoner pr.tilstand. Laevis blev neurula-stadier fikseret i 15 minutter, og der blev anvendt 3 liter Pol II-antistof (Diagenode, C15100055) eller antistof af GFP-Chipkvalitet (Abcam, ab290). Til DNA-ekstraktion fulgte vi en standardprotokol69, 70. Ved hjælp af elementanalyseressourcen søgte vi efter formodede TATA-kasser i K. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCTTTTGTTGT-3′,

P8F: 5 ‘- GGAAGCAAATGCTTTTTTCTCTGTC-3’,

P8R: 5′-AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

og deres relative bindingssteder er vist i supplerende Fig. 4b. Chipeksperimenter blev kvantificeret som følger: normaliseret forhold mellem båndintensitet for hver tilstand blev i gennemsnit det, og foldforøgelsesrespekten IgG-kontrollen blev beregnet og afbildet som foldberigelse. Band intensitet blev registreret ved hjælp af ImageJ Gels analyse plugin. Ikke-beskårne geler er vist i supplerende Fig. 7c, d.