Genomdækkende analyse af kondensinbinding i Caenorhabditis elegans / Genombiologi

Kondensiner i og II deler de to SMC-underenheder bland-1 og SMC-4 og er kendetegnet ved tre ikke-SMC-underenheder (figur 1a). Kondensin IDC adskiller sig fra kondensin I med kun en underenhed, SMC-4-varianten DPY-27. Vi brugte et eller to forskellige antistoffer mod hver kondensinunderenhed til Chipsekv og identificerede de bindingssteder, der er almindelige i flere antistoffer og biologiske replikater (yderligere fil 1: tabel S1). Antistofvalidering og forventede Co-immunudfældning interaktioner fra kondensin holokompleks er præsenteret i yderligere fil 2. Parvis korrelation af median ChIP-berigelsesscorer grupperet kondensin i-IDC og II underenheder separat, hvilket bekræfter fordelingen af individuelle underenheder mellem de tre kondensintyper (figur 1b).

bindingsmønstre med høj opløsning af de tre kondensinkomplekser er ens
Kondensinbindingssteder beriges ved aktive promotorer
Kondensinbindingssteder falder signifikant sammen med en delmængde af transkriptionsfaktorer
Kondensin II-mutation forårsager transkriptionsdefekter, der antyder en undertrykkende funktion
Histonmodifikationer forbundet med åben kromatin korrelerer positivt med kondensinbinding
DNA-sekvensmotiver beriget ved kondensinbindingssteder viser specifikke træk
SDC-2 er påkrævet til binding af kondensin i-IDC, kondensin II og cohesin loader til kromosomale DCC rekrutteringssteder

bindingsmønstre med høj opløsning af de tre kondensinkomplekser er ens

C. elegans kondensin i og II har delvist overlappende , men forskellige kromosomale lokaliseringer i mitose og meiose, og kondensin IDC er specifikt målrettet mod den . Derfor forventede vi at finde forskellige Chipsekv mønstre for kondensin i, IDC og II. i stedet var bindingsmønstre for kondensin i, IDC og II underenheder generelt ens (figur 1C). Denne lighed skyldtes ikke antistof-krydsreaktivitet, fordi HCP-6-antistoffet, som ikke viser nogen krydsreaktivitet og ikke immunopræcipiterer nogen kondensin I-IDC-underenhed , viste omfattende Co-lokalisering med kondensin I-IDC-underenheder (se HCP-6 i figur 1C). Desuden, Hvis overlapningen af kondensin II skyldtes krydsreaktivitet med kondensin IDC, ville vi have forventet en berigelse af kondensin II bindingssteder på H, hvilket ikke var tilfældet (figur 1D). Sammenlignet med kondensin II havde KONDENSIN-IDC-underenheder konsekvent højere Chipscore på H, hvilket antydede en forskel i kromosomal tilknytning af de to kondensinkomplekser som fanget af ChIP (Bemærk forskellige skalaer på H og kromosom i i figur 1C). Da vi udførte Chipsekv i blandede embryoner, var de fleste celler (mere end 95% estimeret med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning) i interfase. Manglen på kondensin I-underenheder på autosomer (figur 1C og yderligere fil 3: Figur S1A) og den tidligere observation, at kondensin i lokaliserer til mitotiske kromosomer efter nuklear kuvertnedbrydning antyder, at det meste af ChIP-sekv-signalet er fra interfase. Til støtte for dette viste kondensin II sig at være nuklear under interfase og viste en mere lige fordeling af bindingssteder blandt alle kromosomer (figur 1D).

KLE-2, HCP-6 og CAPG-2 er kondensin II-specifikke og repræsenterer således kondensin II-binding. Kondensin i og IDC deler alle tre ikke-SMC-underenheder, så herefter henviser vi til ChIP-sek-signalet fra DPY-26, DPY-28 og CAPG-1 fra kondensin i-IDC. At fokusere på de steder, der er bundet som et kompleks, vi gennemsnit Chipsignalet fra kondensintypespecifikke CAP-underenheder. Ud over at bruge gennemsnitlige data bekræftede vi, at hver analyse var sand med enkelte underenheder, og vi præsenterer HCP-6 og DPY-28 i supplerende tal. Vi identificerede et sæt kondensin i-IDC-og II-bindingssteder med høj tillid ved kun at vælge de chipsekv-toppe, der var konsistente på tværs af to eller flere ikke-SMC-underenheder (figur 1D). Som tidligere nævnt forekom 97% af kondensin i-IDC-bindingen på kromosom . Kondensin II blev ligeledes fordelt mellem autosomer og Kondensin II bundet til stærkere kondensin i-IDC-steder på kromosomet (figur 1e og yderligere fil 3: figur S1B).

Kondensinbindingssteder beriges ved aktive promotorer

for at identificere de regioner, hvor kondensiner fortrinsvis binder, analyserede vi kondensinbindingssteder med hensyn til flere genomiske kommentarer. Kondensinbindingssteder blev signifikant beriget ved promotorer, nær tRNA-gener og ikke-kodende RNA ‘ er (Figur 2a, yderligere fil 4: Figur S2). For at eliminere muligheden for, at kondensinbundne tRNA-gener kun forekommer hos promotorer, fjernede vi tRNA-gener, der var inden for 1 kb af et transkriptionsstartsted (TSS) og fastslog, at overlapningen af tRNA-og kondensinbindingssteder forblev signifikant (23% og 6% af tRNA ‘ er overlappet med henholdsvis kondensin i-IDC og II-steder, P = 0,0002). Kondensinbinding ved tRNA-gener antyder, at tfiiisk-medieret kondensinrekruttering kan bevares mellem C. elegans og gær .

bindingen var højest inden for 500 bp af TSS (yderligere fil 5: figur S3A), og 45% af kondensin i-IDC og 62% af kondensin II-toppe var placeret hos promotorer. Kondensinbinding ved promotorer korrelerede positivt med transkriptionsaktiviteten af nedstrømsgenet (figur 2b,C), men ikke alle aktive promotorer blev bundet (figur 2D). Gen ontologi term analyse af bundne promotorer viste en lille (1,3 gange) men signifikant (P = 3,5 e-17) berigelse for gener med embryoudviklingsfunktion (yderligere fil 6: tabel S2). 20% af stærkt udtrykte gener (øverste kvartil efter RNA-niveau) havde et kondensin II-bindingssted inden for 1 kb, og omkring 70% af kromosom-gener havde et kondensin i-IDC-bindingssted inden for 1 kb. Selvom transkriptionsaktivitet er vigtig, er det derfor ikke tilstrækkeligt at forklare specificiteten af kondensinbinding hos visse promotorer.

vi bemærkede, at alle kondensinbindingssteder viste en fremtrædende berigelse af GC-indhold sammenlignet med omgivende regioner og tilfældige koordinater (figur 2e). I C. elegans er GC-indholdet af kromosompromotorer højere end for autosomale promotorer . Det er muligt, at højere GC-indhold er en DNA-sekvensfunktion til kondensinbinding, og promotorer udviklet sig til at indeholde højere GC-indhold for at understøtte kondensin IDC-binding.

Kondensinbindingssteder falder signifikant sammen med en delmængde af transkriptionsfaktorer

for at bestemme yderligere faktorer, der adskiller kondensinbundne promotorer, sammenlignede vi kondensin-og TF-bindingssteder og fandt en delmængde af TFs, der bundet til de samme promotorer som kondensiner (figur 3a). Tidligere undersøgelser viste, at flere TF ‘ er binder til et sæt bindingssteder med høj belægning (HOT) . Der var en overlapning på henholdsvis 5% og 22% af kondensin i-IDC og kondensin II-steder med varme steder (P = 0,0002). Betydningen af overlapning med TFs forblev den samme, da varme steder blev fjernet fra analysen (yderligere fil 5: figur S3B). Procenter af overlapning for hver TF afhang af antallet af bindingssteder og er vist i yderligere fil 5: figur S3C. blandt individuelle TF ‘ er fandt vi, at 69% af kondensin II-steder og 53% af LIN-13-steder overlappede hinanden, hvilket gjorde LIN-13 til den øverste TF, der signifikant overlappede med kondensin II.

Lin-13 har et retinoblastomprotein (pRb) interaktionsmotiv og fungerer i vulvaludvikling med den enkelte pRb homolog LIN-35 i C. elegans . I D. melanogaster reduceres kondensin II-underenhed dCAPD3-binding til kromatin ved pRb-mutation . Hvis LIN-13 i C. elegans rekrutterer kondensin II gennem LIN-35, skal De Lin-13-steder, der også er bundet af LIN-35 (576), overlappe hinanden med kondensin II mere end de LIN-13-steder, der ikke er bundet af LIN-35 (1.033). Overlapningen af Lin-13 og LIN-35 co-besatte steder med kondensin II-steder var kun lidt højere end for LIN-13-steder uden henholdsvis LIN-35, 60% og 50% (figur 3b). Omvendt var overlapningen af LIN-35 med kondensin II højere på de steder, der også var bundet af LIN-13 (45%) sammenlignet med ubundne steder (9%). Dette antyder, at den potentielle interaktion mellem LIN-13 og kondensin II for det meste er lin-35 uafhængig. LIN – 35 fungerer inden for et konserveret multiproteinkompleks kaldet DRM i C. elegans (hDREAM hos mennesker), der også indeholder EFL-1 og DPL-1 . De 555 DRM-bindingssteder, der var bundet af LIN-13, viste en større overlapning med kondensin II (63%) sammenlignet med 787 DRM-steder, der ikke var bundet af LIN-13 (13%). Vi delte kondensin II-stederne i fire grupper i henhold til bindingsstedets overlapning med LIN-13 og LIN-35 (figur 3c). Denne gruppering indikerede, at et stort antal kondensin II-steder viser høj Lin-13-binding, men ikke LIN-35, hvilket antyder, at hvis pRb-medieret kondensin II-rekruttering bevares i C. elegans, kan LIN-35 afhænge af tilstedeværelsen af LIN-13 til kondensin II-rekruttering.

Kondensin II-mutation forårsager transkriptionsdefekter, der antyder en undertrykkende funktion

i gær og D. melanogaster er kondensin blevet impliceret i transkriptionel undertrykkelse . En nylig undersøgelse i D. melanogaster indikerede, at kondensin II-underenheden CAPD3 er påkrævet til transkriptionel aktivering af en klynge af antimikrobielle peptidgener . For at forstå rollen som kondensin II i transkriptionsregulering udførte vi RNA-sekv i KLE-2 null mutant L2/L3 larver. Maternalt indlæst KLE-2 tillader kle-2 null mutant (ok1151 allel) at vokse op til at være sterile voksne. Vi sammenlignede genekspression i heterosygøse og homosygøse kle-2-mutanter i L2/L3-larver, før kimlinjen spredes og således indeholder næsten udelukkende interfasekerner. Differentialekspressionsanalyse ved hjælp af Desek2 identificerede 356 gener, hvis ekspression var signifikant forskellig i homosygot sammenlignet med heterosygotlarver (falsk opdagelsesrate < 5%; Desek2-resultater er præsenteret i yderligere fil 7: tabel S3). Størstedelen af differentielt udtrykte gener steg (70%) snarere end faldt (30%) i ekspression. Gen ontologi term analyse afslørede ikke en bestemt gruppe af gener, der blev påvirket af KLE-2 mutationen. I lighed med offentliggjorte data for kondensin IDC var der ingen direkte sammenhæng mellem KLE-2-binding og ændringer i genekspression. Det er vigtigt, at blandt de 46 differentielt udtrykte og KLE-2-bundne gener steg 83% i ekspression sammenlignet med 67% af 310 gener, der ikke var kle-2-bundne (figur 3D), hvilket antyder, at den direkte virkning af kondensin II-binding stort set er undertrykkende.

Histonmodifikationer forbundet med åben kromatin korrelerer positivt med kondensinbinding

for at forstå kromatinkonteksten for kondensinbinding analyserede vi forholdet mellem kondensinbindingssteder og kromatinfunktioner kortlagt af modENCODE . Vi observerede en generel positiv sammenhæng mellem kondensinbinding og mærker af aktivt kromatin. I gær korrelerer antallet af kondensinbindingssteder gennem cellecyklussen direkte med kromosomlængde. Antallet af C. elegans kondensin II bindingssteder var ikke proportional med kromosomlængde (figur 4a), men positivt korreleret med længden af kromosomer forbundet med aktive histonmærker (figur 4b). Kromosomet var en undtagelse, måske på grund af doseringskompensationsmekanismerne, der ændrer dets kromatin . Kondensin i-IDC og II-binding på tværs af genomet korrelerede positivt med åbne kromatinmærker såsom H3K27ac og negativt med heterochromatinmærker såsom H3K27me3 og H3K9me3 (figur 4C og yderligere fil 8: figur S4). Denne korrelation var på domæneniveau (som analyseret i 1 kb vinduer), da vi ikke så en bestemt histonmodifikation, der toppede på kondensinsteder i en ‘metagen’ type analyse (data ikke vist). I immunofluorescensundersøgelser overlappede centromerproteiner med kondensin II-binding i mitotiske celler . Vi observerede ikke en positiv sammenhæng mellem cenp-A og kondensin II ChIP-sekv signaler i blandede fase embryoner, hvilket tyder på, at der i interfasekerner (de fleste kerner i blandede fase embryoceller) ikke er nogen overlapning. Alternativt, da CENP-A kun binder til en lille delmængde af CENP-a-positive regioner i genomet pr.celle , kan overlapningen af CENP-A med kondensin II muligvis kun ses i enkeltceller. For at forstå, hvilke kromatinfaktorer der bedst forudsiger kondensinbinding, brugte vi en maskinindlæringsmetode. I C. elegans, h4k20me1 er stærkt beriget på tværs af kromosom af DCC, og dermed H4K20me1 var den mest diskriminerende faktor for kondensin IDC binding (figur 4D). For kondensin II er meget forudsigelige kromatinfunktioner H3K27ac og CBP, begge markører for aktive forstærkere, hvilket antyder, at kondensinbinding er beriget ved aktive forstærkere . Blandt 201 kondensin II-bindingssteder, der var 2 kb væk fra en kommenteret TSS, overlappede 58 med et CBP-bindingssted (P = 0,0002).

DNA-sekvensmotiver beriget ved kondensinbindingssteder viser specifikke træk

selvom kondensin II bundet til kondensin I-IDC-stederne på Kondensin i-IDC bandt kondensin i-IDC ikke til de fleste af de autosomale kondensin II-bindingssteder (figur 1D). For at forstå specificiteten af rekruttering af kondensin IDC og II søgte vi efter DNA-sekvensfunktioner, der adskiller kondensin II og kondensin IDC-binding. Tidligere undersøgelser har vist, at kondensin IDC først rekrutteres til cirka 100 steder og derefter spreder sig til andre kromosomale steder . Et 10 bp DNA-sekvensmotiv blev beriget på kondensin – IDC-rekrutteringsstederne (figur 5A) og mutation af motivet afskaffede kondensin-IDC-rekruttering på ekstrachromosomale arrays , hvilket indikerer, at kondensin-IDC-DNA-sekvensmotivet spiller en vigtig rolle i kondensin-IDC-rekruttering.

vi fandt et GCGC-indeholdende DNA-sekvensmotiv, der blev beriget under kondensin II-bindingssteder (figur 5a). Det er interessant at bemærke, at både kondensin II-og kondensin-IDC-motivet inkluderede GCGC-kernen, men kondensin-IDC-motivet blev udvidet på den ene side af AGGG, hvilket antyder, at KS-specificitet af kondensin-IDC-rekruttering opnås af cofaktorer, der genkender AGGG. Genom-bredt var 11% af kondensin II-motiverne bundet af kondensin II. i lighed med andre TFs (for eksempel) var kun en del af de potentielle DNA-sekvensmotiver bundet af kondensin II. andre faktorer såsom kromatintilgængelighed og ukendte co-faktorer kan være involveret i bindingsspecificitet. Faktisk, hvis vi tog de motiver, der var i et 2 kb-vindue, der var signifikant beriget for et aktivt histonmærke, såsom H4K16ac, steg procentdelen af motiver, der var bundet, fra 11% til 29%. Derudover fandt vi, at 1 kb genomiske vinduer, der indeholdt mere end et kondensin II-motiv, var omkring 2,5 gange mere tilbøjelige til at være bundet af kondensin II sammenlignet med dem med kun et motiv. Derfor hjælper motivklyngning og åben kromatinkontekst med at specificere valg af de motiver, der er bundet.

ikke alle kondensin II bindingssteder har motivet. På disse kondensin II-steder uden motivet kan andre faktorer være ansvarlige for binding. Alternativt kan den lave andel af kondensin II-steder (27%), der indeholder et motiv, forklares ved potentiel spredning af kondensin II efter rekruttering. Spredningssteder forventes ikke at indeholde motivet. For eksempel for kondensin IDC indeholder en høj procentdel af potentielle rekrutteringssteder (56%) motivet, men ikke spredningssteder (8%) . En systematisk analyse af rekrutteringskapaciteten på de identificerede kondensin II-steder er nødvendig for at tackle, hvis der er nogen spredning.

SDC-2 er påkrævet til binding af kondensin i-IDC, kondensin II og cohesin loader til kromosomale DCC rekrutteringssteder

hos metaser er proteiner, der er involveret i kondensinrekruttering til kromosomer, ikke godt forstået. I gær overlapper kondensinbindingen med cohesin-loading kompleks Scc2 / 4, hvilket øger kondensinforeningen med kromosomer . For at teste, om overlapningen med Scc2 / 4 er konserveret mellem gær og C. elegans, vi udførte ChIP-sekv analyse af SCC-2 (også kendt som PKN-85) og fandt ud af, at en bemærkelsesværdig 95% af SCC-2 steder overlappede med kondensin i-IDC på H og 60% med kondensin II genom-bred (figur 5b). Overlapningen forblev ens, når varme områder blev udelukket (yderligere fil 9: figur S5A). Ikke alle kondensinsteder overlappede med SCC-2, hvilket antyder, at kondensin i modsætning til gær ikke afhænger af SCC-2 til binding . SCC-2-bindingen var højere ved promotorer og positivt korreleret med transkription (yderligere fil 9: figur S5B). Et GAGA-indeholdende DNA-sekvensmotiv var til stede i 58% af SCC-2-bindingssteder (yderligere fil 9: figur S5C). I modsætning til Drosophila Nipped-B og ligner S. cerevisiae Scc2, SCC-2-binding var ikke høj inden for transkriberede regioner, men forblev intergen (figur 5c).

næsten fuldstændig overlapning (96%) af kondensin II-bindingssteder med kondensin i-IDC på kromosom understøtter eksistensen af fælles mekanismer til kromosombinding af forskellige kondensiner. Siden kondensin II og SCC-2 bundet til kondensin IDC rekrutteringssteder på H (figur 5D og yderligere fil 9: Figur S5D), antog vi, at kondensin IDC-rekrutterere også rekrutterer kondensin II og SCC-2. Hermafroditspecifik rekruttering af kondensin IDC til kromosom udføres ved hjælp af SDC-2, SDC-3 og DPY-30 . Vi udførte HCP – 6 og KLE-2 (kondensin II), DPY-26 (kondensin i-IDC) og SCC-2 Chipsekv i sdc-2 null mutante embryoner. I sdc – 2-mutanten blev DPY-26, HCP-6, KLE-2 og SCC-2-bindingen afskaffet på et KS-specifikt kondensin-IDC-rekrutteringssted (KS-2) (Figur 5e). Det er uklart, hvorfor HCP-6 og KLE-2-bindingen ved reks-2 blev formindsket i stedet for at ligne et autosomalt kondensinsted. SCC-2-binding på autosomer og kromosom-steder, der er uafhængige af SDC-2, forblev ens i sdc-2-mutanten sammenlignet med steder, der var bundet af SDC-2 (Figur 5F). Vores resultater tyder på, at SDC-2, Den hermafroditspecifikke TF, der rekrutterer kondensin IDC til kromosom, også rekrutterer kondensin II og cohesin loading kompleks underenhed SCC-2 til de samme steder (yderligere fil 10: figur S6). Tidligere genetiske undersøgelser fastslog, at en sdc-2 null-mutation ikke forårsager embryonal dødelighed hos mænd, således er funktionen af kondensin II og SCC-2 rekruttering af SDC-2 ikke afgørende for generel kromosomkondensation og segregering . Det er muligt, at SCC-2 og kondensin II rekruttering af SDC-2 har en hermafroditspecifik genregulerende funktion.

for at teste, om SCC-2 har en effekt på kromosomal tilknytning af kondensin-IDC på rekrutteringsstedet, udførte vi kvantitativ PCR-analyse af DPY-27-ChIP i kontrol versus SCC-2-nedslagsembryoner. Ved at fodre RNAi var vi i stand til at slå ned niveauerne af SCC-2 med cirka 80% (yderligere fil 9: figur S5E). Efter SCC-2-nedslag så vi ikke en signifikant ændring i DPY-27-binding ved reks-1 eller reks-2 (Figur 5g). Konsekvent viste immunofluorescensanalyse af kondensin i og II binding på meiotiske kromosomer ikke en signifikant forskel mellem vildtype og SCC-2 mutanter .

Genomdækkende analyse af kondensinbinding i Caenorhabditis elegans