hvordan designer man gRNA til CRISPR genomredigering?
gRNA guider CRIPR Cas9-systemet til det rigtige genomiske sted for at udføre en dobbelt strengbrud.Den målrettede specificitet af CRISPR Cas9-systemet bestemmes af 20 nukleotider i 5′ – enden af gRNA. GRNA-baseparrene til den komplementære streng af målsekvensen, og Cas9-nuklease udfører en dobbeltstrengsbrud.
mens designe en gRNA følgende ting skal tages i betragtning.
1) GC-indhold: Typisk interval er mellem 40% – 80%. Et højere GC-indhold stabiliserer RNA-DNA-dupleksen, mens destabilisering af hybridiseringer uden for målet
2) længde: længden kunne justeres og variere fra 17-24 basepar. En kortere sekvens fører til minimerede off target effekter. (17 bp er den laveste grænse for længden af styringssekvensen, enhver længde af styringssekvensen enhver længde kortere end 17 har en statistisk chance for at målrette mod flere genomiske loci.)
3) potentielle effekter uden for målet: Mismatchtolerance og målstedet er det, der fører til effekter uden for målet. Dette kan reduceres ved genom-bred mål effekt søgninger.
der er mange hjemmesider, der hjælper med at designe grna ‘ er. Nogle af dem er Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA designer og Biotools.
jeg forklarer, hvordan man bruger Chop Chop hjemmeside her,
1) Gå til https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Vælg arter
3) Vælg artsspecifikt gen-id eller klip og indsæt det nukleotid af interesse, og start analysen.
når analysen er udført, vises grafisk repræsentation af stedspecifik gRNA. Hver potentiel gRNA vil også vise de mulige off target effekter. Vælg dem med mindre off target effekter.
