injicerbare humane rekombinante kollagenmatricer begrænser negativ remodeling og forbedrer hjertefunktionen efter myokardieinfarkt

studiedesign

her gennemførte vi en undersøgelse for at (i) designe klinisk relevante kollagenhydrogler ved hjælp af rekombinante humane collagener type I og type III; (ii) karakterisere og sammenligne de fysiske egenskaber ved rHCI-og rHCIII-materialerne; (III) evaluere det terapeutiske potentiale af materialerne til behandling af MI hos mus; og (iv) identificere mekanismer, der ligger til grund for de observerede terapeutiske virkninger af rHC-behandling. Til in vivo-eksperimenter blev LAD-arterieligering hos mus valgt som en klinisk relevant og veletableret dyremodel for MI. Til funktionelle, histologiske og molekylære evalueringer blev antallet af dyr pr. Mus blev tilfældigt tildelt behandlingsgrupper, og alle analyser blev udført blindet.

fremstilling og karakterisering af rHC-matricer

en 1% kollagenopløsning blev fremstillet ved opløsning af 0,1 g lyofiliseret kollagen (rHCI og rHCIII, fra Fibrogen) i 10 ml ultrarent ddh2o. chondroitinsulfat (CS; vako), n-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) og N-hydroksysuccinimid (NHS)) blev tilsat for at fremstille en endelig blanding med et masseforhold på 1:4:0,5:0,3 for kollagen:cs:NHS:EDC. Materialerne blev fremstillet på is under anvendelse af et lukket system, der tillader homogen blanding uden tilsætning af bobler. Efter grundig blanding blev pH justeret til 7.4 af NaOH (1.0 N). Matricer uden CS blev fremstillet på samme måde, men med PBS tilføjet for at kompensere for volumenet af CS. Matricer mærket med 594-NHS blev fremstillet ved at tilsætte 20-NHS af farvestofopløsningen (1 mg/mL i DMSO) til gelerne, før NaOH (25 nmol farvestof pr.hydrogel) blev tilsat, efterfulgt af 20 blandingstrin.

materialeviskositet

Viskositetsmålinger blev udført under anvendelse af en Brookfield R/S plus rheometer (Brookfield) ved 37 liter C. En C25–2/30 konisk spindel blev brugt til at komprimere materialet (50 liter forskydning) på en temperaturstyret piedestal. Viskositeten blev målt med en ramperotationsblok med en hastighed på 1/min enheder forudindstillet til en forskydningshastighed på fem enheder over en tid på 30 min.

grad af tværbinding

Differentialscanningskalorimetri (DSC) eksperimenter blev udført for at vurdere graden af tværbinding. Kort sagt blev der udført målinger i et differentialscanningskalorimeter (ta-instrumenter) i 2000 i intervallet 8 til 80 liter C ved hjælp af en scanningshastighed på 5 liter C min−1. Kollagenmatricer (5-20 mg) blev overfladetørret med filterpapir og hermetisk forseglet med et aluminiumslåg (t nul; Ta-instrumenter) i en aluminiumsprøvepande (Tnul; Ta-instrumenter). Denatureringstemperaturen (Td) blev målt ved begyndelsen af den endotermiske top.

vandindhold

materialernes vandindhold blev målt ved vejning af prøveens våde Vægt (Vægt 0), ækvilibreret i PBS i 96 timer ved 4 liter C. materialet blev derefter vakuumtørret ved stuetemperatur i 96 timer for at opnå den tørre masse (vægt). Det samlede vandindhold i hydrogelerne (vægt) blev derefter beregnet i henhold til ligningen:

nedbrydning

blev målt ved anvendelse af 50-100 mg hydrogel anbragt i 5 ml type i-kollagenase (10 E/ml i PBS) ved 37 liter C. Den resterende faste masse blev målt over en periode på op til 24 timer. nedbrydningshastigheden beregnes ud fra den indledende hældning af plottene for den resterende masse vs. tid og rapporteres som mg/min.

Materialeporøsitet

lavtemperaturscanningselektronmikroskopi (Cryo-sem) målinger blev udført ved -50 liter C ved hjælp af en Tescan (Model: Vega II-HMU) udstyret med en prøveholder til koldtrin, en backscatter – elektrondetektor (BSE) og en sekundær elektrondetektor (SE). Porestørrelser blev målt fra mindst 250 individuelle fra 4 til 6 tilfældige områder af prøven ved hjælp af ImageJ-program. Diameter for porer blev kvantificeret ved hjælp af porens længdeakse ved hjælp af lige linjeværktøj. Område af billedet blev justeret mod størrelsen skala bar opnået fra Tescan Vega II system65.

dyreforsøg

alle procedurer blev godkendt af Dyreplejeudvalget og udført i henhold til National Institute of Health Guide til pleje og brug af forsøgsdyr.

MI model

MI blev induceret i 9 uger gamle kvindelige C57BL/6 mus (Charles River; antal mus/gruppe er i figuren legender) og behandling levering blev udført ved hjælp af en etableret protokol26,27. Mus blev bedøvet (2% isofluran), intuberet, og hjertet blev eksponeret via fjerde interkostale thoracotomi. Den venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) blev derefter ligeret lige under dens fremkomst fra venstre atrium. Denne procedure resulterer i en stor MI, der involverer de anterolaterale, posterior og apikale dele af hjertet, hvilket blev bekræftet på operationstidspunktet ved myokardieblanchering i det område, der leveres af arterien. Kortvirkende buprenorphin blev administreret mindst en time før operationen, og langtidsvirkende buprenorphin blev administreret subkutant umiddelbart før operation for perioperativ analgesi. 1 uge efter MI (baseline) blev mus tilfældigt tildelt til at modtage behandling af PBS (kontrol), rHCI eller rHCIII-matricer, leveret i fem ækvivolumetriske intramyokardiale injektioner (10 liter hvert sted, 50 liter i alt) gennem en 27 G nål ved hjælp af en ultralydsstyret lukket brystprocedure. Sprøjten er fastgjort i en mikromanipulator (VisualSonics), og inden injektionsproceduren er både nålen og RMV scanhead-sonden justeret langs hjertets langakse. Via ultralydsfeltet bruges mikromanipulatoren til at placere nålespidsen var på det ønskede sted i myokardiet til levering af injektionerne (se supplerende Fig. 1 og supplerende Video 1). Mus blev dræbt ved terminalanæstesi 2 dage eller 4 uger efter behandling, og hjerter blev opsamlet til histologi og/eller målinger af de mekaniske egenskaber.

ekkokardiografi

Transthoracic ekkokardiografi blev udført på langaksevisninger ved hjælp af et vevo770-system i B-tilstand med en 707b-serie real-time mikrovisualisering scanhead probe (VisualSonics). Billeddannelsen blev udført ved baseline før behandlingsinjektion (7 dage efter MI) og 28 dage efter injektion for at bestemme venstre ventrikulær ejektionsfraktion (LVEF), fraktioneret arealændring (FAC), slut-systolisk volumen (ESV), slutdiastolisk volumen (EDV), slagvolumen og hjerteudgang. Bemærk, at LVEF, ESV og EDV anvendes som kliniske forudsigere for HF og overlevelse efter MI44.

eks vivo billeddannelse af 594-mærket matrice

de kemisk mærkede rHC-matricer (25 nmol farvestof pr. Dyr blev dræbt 2 timer, 2 dage og 7 dage efter behandling, og hjerter blev høstet og afbildet eks vivo af IVIS larp Spectrum (PerkinElmer) for at visualisere rhci og rHCIII fordeling inden for hjerterne (genekspression: 570 nm; oprensning: 640 nm). Til histologi blev vævssektioner fremstillet i acetone og derefter farvet med DAPI efterfulgt af billeddannelse ved hjælp af en Leica Aperio Versa-glidescanner med en endelig forstørrelse på kr20 og en å-stak med otte trin ved 1,5 KRM.

Stammeanalyse

Transthoracic ekkokardiografi blev udført på langaksevisninger ved hjælp af et vevo3100-system i B-tilstand med en MH400-serie i realtid mikrovisualisering scanhead probe (VisualSonics). Billeddannelsen blev udført ved baseline før behandlingsinjektion (7 dage efter MI) og 2 dage efter injektion for at bestemme langsgående endokardiel stamme på tidspunktet for lukning af aortaklappen (repræsenterer slutsystol). Stamme i Segment 5 (det forreste midtersegment), svarende til det grænseområde, der er målrettet til behandlingsinjektion, blev analyseret ved hjælp af vevostrain-applikationen af Vevo LAB 3.1.1-programmet (VisualSonics)41. Repræsentative eksempler for de udførte målinger er inkluderet i supplerende Fig. 10 for alle forsøgsgrupper plus et sundt (ikke-inficeret) dyr.

elektrokardiografi

elektrokardiogrammer blev opnået samtidigt med ekkokardiografi ved anvendelse af et vevo3100-system (VisualSonics) ved baseline før behandlingsinjektion (7 dage efter MI) og 2 dage efter injektion. Elektrokardiogrammer blev eksporteret fra VEVO LAB 3.1.1. programmer (VisualSonics). Længden af PR -, KVT-og KVR-intervallerne blev bestemt ved hjælp af ImageJ-programmer (supplerende tabel 1).

myocardiums mekaniske egenskaber

mus blev aflivet ved terminalanæstesi 2 eller 28 dage efter behandling, og hjerterne blev høstet. Rektangulære stykker (2,5 liter 5 mm) af venstre ventrikel omfattende ar og grænseområde blev udskåret. For at bestemme vævets trækelasticitet (Youngs modul) blev prøverne underkastet mekanisk test i en Instron mekanisk universal tester (Model 3342, Instron) udstyret med serie IK/s−programmer ved anvendelse af en krydshovedhastighed på 10 mm min-1.

histologi/immunhistokemi

Slides af myokardvæv sektioner blev fremstillet ud fra en delmængde af hjerter, der ikke blev anvendt til mekaniske egenskaber målinger. På 28 dage efter injektion, hjerter blev høstet, perfunderet med PBS, indlejret i OLT, og snapfrosset i flydende nitrogen. Sektioner på 10 liter blev skåret ved hjælp af en kryostat. For at vurdere arstørrelse blev vævssektioner fikseret i 4% PFA i 1 time og farvet med Massons trichrome procedure (Sigma). Billeder taget med et Olympus Bh 50-mikroskop ved hjælp af et mål på 2 liter og otte sektioner pr.mus blev brugt til at måle fjern vægtykkelse og til at bestemme arstørrelse ved hjælp af midterlinjebue-metoden ved hjælp af Mikvant programmel66. Til immunhistokemi blev vævssektioner fikseret i acetone i 20 minutter, permeabiliseret med 0,1% Triton i 10 minutter og derefter blokeret i 10% serum i 1 time ved stuetemperatur. Primære antistoffer blev påført natten over ved 4 kg C i 10% serum, og derefter blev dias skyllet og behandlet med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, inden de blev monteret med fluorescerende monteringsmedium (Dako). Til påvisning af blodkar og myofibroblaster, PECAM-1 (også kendt som CD31; Santa Cruce 101454, 1: 50) og karrus-SMA (Abcam 5694, 1:200) antistoffer blev anvendt og påvist med henholdsvis Af594 Anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) og af488 anti-rabbit (Life Technologies a11007, 1:500). M2-makrofager blev påvist af AF488-konjugeret anti-CD206-antistof (Biolegend 141710, 1:50). Til kardial troponin i-farvning blev sektioner inkuberet med af488-mærket hvedekimagglutinin (Termofisher, V11261) i 1 time ved 37 liter C efterfulgt af inkubation med goat cardiac troponin I primært antistof (Abcam ab56357, 1:200) og påvist af donkey anti-goat af594 sekundært antistof (Life Technologies a-11058, 1:500). Endelig blev sektioner inkuberet med conneksin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) og cardiac troponin I (Abcam ab188877, 1:200) primære antistoffer efterfulgt af påvisning med henholdsvis Af488 anti-kanin (Life Technologies a11007, 1:500) og donkey anti-goat af594 sekundært antistof (Life Technologies a-11058, 1: 500). Fluorescerende billeder blev opnået ved hjælp af et Observatørmikroskop med et 20-mål og til forbindelsen 43 farvede sektioner blev der anvendt en Leica Aperio Versa-glidescanner med et 20-mål. For alle IHC-pletter blev fire sektioner pr. mus analyseret, og for hvert afsnit 2-4 billeder inden for grænseområdet blev infarkt og fjerntliggende regioner anvendt til analyse. Til H&e-farvning blev vævssektioner fikseret i 10% formalin. 2 i 7 minutter efterfulgt af syrealkoholdifferentiering og derefter 0,5% eosin i 7 minutter efterfulgt af dehydrering (alle opløsninger fra Sigma). Billeder blev taget med et Olympus Bh 50 mikroskop. Grænseområdet blev betegnet som FOV direkte ved siden af hver side af infarktområdet, der begynder, når 50% af LV er fibrotisk arvæv (se supplerende Fig. 11 for en skematisk skildring).

cks3cr1-EGFP-museksperimenter

for at evaluere rekrutteringen af cirkulerende mononukleære celler til myokardiet efter rHC-behandling blev B6.129p-Cks3cr1 tm1Litt/J-mus (Cks3cr1-EGFP) købt fra Jackson-laboratoriet. Disse mus udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein i monocytter, dendritiske celler, NK-celler og hjernemikroglia og er en model rapporteret til undersøgelsen af mononuklear cellerekruttering til hjertet67. Ved 1-ugers post-MI modtog mus behandling af 50 liter PBS, rHCI eller rHCIII som beskrevet ovenfor. Dyr blev dræbt 2 dage efter behandlingen, og blod blev opsamlet i EDTA-rør. Hjerter blev også perfunderet med PBS, og den højre ventrikel og den apikale region i venstre ventrikel blev opsamlet. Vævene blev skyllet med HBSS og fordøjet i 2.4U / ml dispase i (Roche) og 1 mg/ml Collagenase B (Roche) i 40 minutter ved 37 liter C. prøver blev vasket tre gange med PBS, centrifugeret i 5 minutter ved 400 g, og de isolerede celler blev forberedt til strømningscytometri (FACS Aria III; Becton Dickinson). Celler blev mærket med APC-anti-mus/human CD11b (Biolegend 101211), PE-anti-mus Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5-anti-mus F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7-anti-mus CD38 (Biolegend 102717) og Aleksa Fluor list 700-anti-mus CD206 (Biolegend 141733), efter producentens anbefalede fortyndinger (0.25 liter / L pr.1 liter 106 celler for CD11b, Ly-6 g/6c, CD38 og CD206 og 1 liter/L pr. 1 liter 106 celler for F4/80). Se Supplerende Fig. 12 til sortering/gating strategi.

celleisolering og strømningscytometri for monocytundersæt

to dage efter behandling blev injektionsmus dræbt ved CO2-inhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Blod blev opsamlet fra mus gennem hjertepunktur i en 50 mM EDTA-opløsning, og RBC ‘ er blev lyseret med røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer i henhold til producentens protokol (Biolegend 420301). Celler blev isoleret fra høstede mushjerter ved hjælp af en fordøjelsesbuffer indeholdende: DNAse i (50 U/liter; Sigma D5025), collagenase type II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), collagenase D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) og hyaluronidase (10 U/mL; Sigma H3506). Efter en times fordøjelse ved 37 liter C, isolerede hjerteceller blev ført gennem et 70 liter filter. Endelig blev høstede musemelter mashed og tritureret gennem et 70 liter filter efterfulgt af inkubation med røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer. Cellepellets blev opsamlet ved centrifugering ved kr400 g i 5 minutter ved kr4 kr. Isolerede celler fra alle væv blev inkuberet med vandfastgøreligt levedygtighedsfarvestof (1: 500, Biolegend 423101) i 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev Fc-receptorer blokeret med TruStain – reagens (1: 100, Biolegend 103319) i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter inkuberet med en antistofcocktail i 45 minutter ved stuetemperatur indeholdende CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegend RA3-6B2), F480-Af647 (1:100, Biolegend BM8) og Ly6C-BV421 (1:80, Bd Biosciences AL-21). Strømningscytometri blev udført under anvendelse af en BD FACS Aria III, og data blev analyseret med Strømningsjo V10.5.2-Program (Se supplerende Fig. 12 til sortering/gating strategi). Det samlede levedygtige celletal for hver vævspostisolering blev bestemt ved trypanblå udelukkelse ved anvendelse af et hæmocytometer. Det totale antal celler inden for hver leukocytpopulation blev bestemt ved anvendelse af procentdelen af levende celler for en given cellepopulation, og det totale antal levende celler tællede post-isolering, som derefter blev normaliseret til mg væv eller mL blod opsamlet. Gating strategi: enkeltceller blev gated baseret på FSC-A og FSC-H. levende enkeltceller blev gated på lav farvning for levende levende/dødt farvestof. Fra denne levende enkeltcellepopulation var leukocytter CD45+. Leukocytundersæt blev karakteriseret som følger: neutrofiler CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C lave monocytter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C høje monocytter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofager CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−celler CD45+CD11b−Ly6G− CD3+B220−og B−celler CD45+cd11b−Ly6g-CD3-B220+. Note til blod F480 ekspression blev ikke brugt i gating strategi. Porte blev indstillet i forhold til isotype-kontroller.

neonatale kardiomyocytundersøgelser

neonatale rotte ventrikulære myocytter (Nrvm ‘ er) blev frisk isoleret ved hjælp af en etableret protokol68. Venstre ventrikler indsamlet fra 2 dage gamle rotter (Harlan) blev fordøjet af trypsin (Amersham Biosciences) og collagenase type II (Biochemical). Isolerede celler blev re-suspenderet I m-199-mediet (Life Technologies) suppleret med 10% FBS, 19,4 mM glucose, 2 mM L-glutamin, 2 U/mL penicillin, 0,8 liter/mL vitamin B12, 10 mM HEPES og 1 liter MEM ikke-essentielle aminosyrer (Sigma-Aldrich). To runder på 60 min forplettering blev udført, hvor hjertefibroblaster fastgøres til skålbunden, hvilket beriger den ikke-adherent population for Nrvm ‘ er. De ikke-adherent celler (Nrvm ‘ er) blev derefter podet på de forskellige kollagenmatricer i 24-brøndsplader (40.000 celler/cm2). Til overlevelsesanalysen blev 3-dages dyrkede Nrvm ‘ er udsat for M-199-medier indeholdende 50 liter brintoverilte i 3 timer, hvorefter en Terminal Deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick-end-mærkning (TUNEL) – analyse blev udført, og døde celler blev talt i tre tilfældige synsfelter.

cellekulturer

ved anvendelse af en etableret protokol blev knoglemarvsafledte makrofager isoleret fra 8-12 uger gamle C57BL/6J mice69. Mus blev aflivet ved CO2-inhalation og cervikal dislokation, og skinneben blev opsamlet og skyllet med medier for at isolere knoglemarven. Knoglemarvsisolatet blev pipetteret gentagne gange for at opnå en enkeltcellesuspension, som derefter blev ført gennem en cellesil. Frisk isolerede celler blev dyrket i 1 uge i DMEM suppleret med 10% FBS, 20% l929-konditionerede medier og penicillin–streptomycin og derefter genbelagt på rHC-hydrogellerne i 3 dage. Celler blev opsamlet fra rHC-hydrogelerne ved anvendelse af 3 mM CaCl2 Hanks buffersaltopløsning indeholdende 250 enheder collagenase i (Gibco). Makrofagpolarisering blev vurderet ved strømningscytometri (FACS Aria III; Becton Dickinson) ved anvendelse af CD86 og CD206 (Biolegend) til at identificere henholdsvis M1 og M2 makrofager. Til mononukleær celleisolering blev knoglemarv fra tibia knogler opsamlet som beskrevet ovenfor. Mononukleære celler blev oprenset ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af Histopakelig Karrus (Sigma) i henhold til producentens anvisninger. Celler blev mærket med 0.5 liter/ml DAPI (Sigma) i 30 minutter ved 37 liter C.

makrofagadhæsionsanalyse

mononukleære celler blev isoleret ved skylning af tibias og lårben på 6 – til 12 uger gamle mus. Celler blev oprenset ved densitetsgradientcentrifugering under anvendelse af Histopakelig Kurt (Sigma) i henhold til fabrikantens anvisninger. Mononukleære celler blev talt og mærket med DAPI. Celler blev belagt på de forskellige biomaterialer i en koncentration på 50.000 celler/cm2 i 24 timer. celler blev fikseret med 4% PFA i 5 minutter, og celler blev talt. Dataene blev udtrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønde, dvs., TCPS) for at minimere effekten af Inter-donorcellevariabilitet.

makrofagmigrationsassay

Knoglemarvsmononukleære celler blev dyrket i Dmem suppleret med 10% FBS, 20% L929-konditioneret medium og Pen/Strep i 7 dage for at generere knoglemarvsafledte makrofager (BMDMs) og mærket med DAPI som beskrevet ovenfor. Bmdm ‘er (2 liter 105) blev derefter suspenderet igen i EBM uden vækstfaktorer og serum og indlæst i det øverste kammer i en Tværbrøndsplade (Life Technologies) belagt med 100 liter rHCI eller rHCIII. Bundkammeret indeholdt fulde makrofagmedier som beskrevet ovenfor. Efter 24 timer blev indsatserne fjernet, og antallet af Bmdm ‘ er, der vandrede gennem biomaterialet, blev kvantificeret på en blindet måde ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Dataene blev udtrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønde, dvs.TCP ‘ er) for at minimere effekten af Inter-donorcellevariabilitet.

makrofagpolariseringsassay

BMDMs blev genereret i DMEM suppleret med 10% FBS, 20% L929-konditioneret medium og Pen/Strep i 7 dage som beskrevet ovenfor. Til makrofagaktiveringseksperimenter blev celler stimuleret i 3 dage med lipopolysaccharid (1 liter/ml; Sigma) plus IFN-liter (50 ng/ml; Sigma) til M1-aktivering eller med IL-4 (20 ng/ml; r&d-systemer) til m2-aktivering. Det samlede RNA blev ekstraheret ved hjælp af Tri-reagens, ifølge producentens protokol. Første streng cDNA blev syntetiseret med Smartscribe revers transkriptase (Takara Bio USA) og tilfældige sekskamerprimere (Fisher Scientific). Målgen mRNA-niveauer blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR med LightCycler 480 SYBR Green i-Mastermiks (Roche) og et LightCycler 480 realtids-PCR-System (Roche). Sekvenser for primerpar er anført i supplerende tabel 2. Relative ændringer i mRNA-ekspression blev bestemt ved hjælp af mRNA ct-metoden, udtrykt som niveauer i forhold til 18S.dataene blev udtrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønde, dvs. TCP ‘ er) for at minimere effekten af Inter-donorcellevariabilitet.

overlevelse efter H2O2-eksponering

celler blev dyrket i 7 dage i DMEM suppleret med 10% FBS, 20% L929-konditioneret medium og Pen/Strep. På dag 7 blev medierne ændret til DMEM indeholdende 0,5 mM brintoverilte, og celler blev dyrket i 3 timer, før de blev farvet med 7-AAD til analyse ved strømningscytometri. Dataene blev udtrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønde, dvs.TCP ‘ er) for at minimere effekten af Inter-donorcellevariabilitet.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af Kaleida-graf 4.5-liter. Alle data præsenteres som middelkurs-sem. Til sammenligning af in vivo-data mellem behandlinger blev en ANOVA anvendt efterfulgt af Holms korrektion for flere sammenligninger. Scar størrelse blev analyseret ved hjælp af en multipel regression, herunder behandlingsgruppe (rHCI, rHCIII og PBS) og baseline LVEF. rHCI og rHCIII sammenlignet med PBS var signifikante forudsigere for infarktstørrelse ud over baseline LVEF. Korrelationskoefficienten for modellen er 0,6 ved anvendelse af stata multiple lineær regression. In vitro NRVM -, makrofag-og hjertefibroblastdata blev analyseret enten ved en studerendes t-test eller ved en envejs ANOVA med en Holms korrektion for flere sammenligninger, som specificeret i figurens legender.

Rapporteringsoversigt

yderligere information om forskningsdesign er tilgængelig i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.