kollagensyntese

regulering af Knoglekollagensyntese

kollagensyntese i organkulturer af gnaver calvariae og cellekulturer er blevet vurderet ved hjælp af flere forskellige assays . I det mest anvendte assay inkuberes calvariae og celler med radioaktivt mærket prolin i flere timer inden kulturens afslutning. Inkorporeringen af radioaktivt mærket prolin i kollagenase-fordøjeligt protein (CDP-mærkning) og ikke-kollagenprotein (NCP-mærkning) måles i ekstrakter af kulturerne ved hjælp af stærkt oprenset bakteriel collagenase . Den procentvise kollagensyntese beregnes ud fra CDP-og NCP-værdierne efter korrektion for den større overflod af prolin i kollagen i forhold til ikke-kollagenproteiner . Kollagenproduktion kan også bestemmes ved at måle indholdet af hydroksyprolin i celle-eller organkulturer, da hydroksyprolin er praktisk talt unik for collagener. Disse metoder skelner ikke mellem forskellige typer fibrillært kollagen. Imidlertid er kollagenet syntetiseret af knogleorgankulturer og de fleste osteoblastiske cellekulturer stort set type i (>95%), så CDP-mærkningsværdien normalt afspejler type i-kollagensyntese. Om ønsket kan produktionen af forskellige kollagentyper skelnes ved ionbytningskromatografi og polyacrylamidgelelektroforese af radioaktivt mærkede ekstrakter af celle-eller organkulturer . Type i-kollagenekspression i humane cellekulturer er også blevet vurderet ved måling af sekretion af procollagen i C-terminal propeptid . Endelig er specifikke cDNA-prober i nordlig blotting og allelspecifikke primere i revers transkriptase-polymerasekædereaktionsassays blevet brugt til at vurdere kollagen mRNA-ekspression i knoglemodeller. Måling af effekten af 1,25 (OH) 2D3 på kollagensyntese og mRNA-niveauer har givet sammenlignelige resultater ved hjælp af disse forskellige assays.

1,25(OH)2D3 hæmmer kollagensyntese i organkulturer af 21-dages føtal rotte calvariae og neonatal mus calvariae med ringe eller ingen effekt på ikke-kollagenproteinsyntese. Maksimal hæmning af kollagensyntesen med 1,25 (OH) 2D3 i rotte calvariae (ca .50%) forekommer ved 10 nM. 1,24 R, 25 – (OH)3D3 hæmmer også kollagensyntese, men er mindre potent end 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 og 24R,25(OH) 2D3 ændrer ikke kollagensyntesen under 100 nM . D-vitaminmetabolitter hæmmer kollagensyntese og stimulerer resorption af føtale rotte lange knogler med lignende relative styrker, der korrelerer med affiniteten af metabolitterne til skelet-VDR ‘ erne . For at bestemme celleselektiviteten af 1,25(OH)2D3-inhiberingen af kollagensyntese blev organkulturer af føtal rotte calvariae behandlet med 1,25 (OH)2D3 i 22 timer og derefter inkuberet med tritieret prolin til den endelige 2 h kultur. Den centrale knogle (modne osteoblaster) blev dissekeret fri for periosteum (mindre modne osteoprogenitorer og fibroblaster), og begge rum blev analyseret separat for inkorporering af tritieret prolin. 1,25 (OH)2D3 nedsætter kollagensyntesen i den centrale knogle, men ikke periosteum, hvilket indikerer selektivitet af 1,25(OH) 2D3-effekten for modne osteoblaster . Ved anvendelse af en in vivo-protokol, hvor neonatale rotter fik flere injektioner af tritieret prolin til radiomærkning af nyligt syntetiseret knoglematrice, 25 ng af 1,25(OH)2D3 givet på dag 1, 3 og 5 hæmmet knoglematricesyntese som vurderet ved histomorfometri af autoradiografer af tibia og calvariae .

1,25(OH)2D3 hæmmer også kollagenproduktion i rotte osteoblastisk osteosarkom ROS 17/2 , 8 celler , primære rotte-og Muse osteoblastiske celler og en udødeliggjort Murin osteoblastcellelinie (MMB-1). 1,25 (OH) 2D3 har en større hæmmende virkning på type i-kollagensyntese under logfasevækst af primære murine osteoblastiske celler end ved sammenløb, måske fordi prolifererende celler indeholdt flere VDR ‘ er . Ligeledes er 1,25 (OH)2D3-hæmning af kollagensyntese større i sparsomme kulturer af MMB-1-celler, der har højere VDR-niveauer end sammenflydende MMB-1-celler . 1,25 (OH)2D3 hæmning af kollagensyntese er ækvivalent i sparsomme og sammenflydende rotte primære osteoblastiske celler , men VDR-antallet ændrede sig ikke under cellernes vækst . Samlet set viser disse data, at omfanget af inhibering af kollagensyntese med 1,25(OH)2D3 i vid udstrækning bestemmes af den cellulære mængde VDR ‘ er. 1,25 (OH) 2D3 hæmmer kollagen mRNA-niveauer i den proliferative fase af langvarige kulturer af rotte primære osteoblastiske celler og forhindrer dannelsen af mineraliserede knogleknuder ved disse kulturer . Disse undersøgelser viser, at 1,25 (OH)2D3 hæmmer differentieringen af osteoprogenitorer, der danner mineraliserede knuder i primære rotte osteoblastiske cellekulturer . Imidlertid kan inhiberingen af knudedannelse med 1,25(OH)2D3 være sekundær til undertrykkelsen af type i-kollagensyntese i kulturerne.

i modsætning til de ovenfor beskrevne inhiberende virkninger stimulerer 1,25(OH)2D3 forbigående kollagen og ikke-kollagenproteinsyntese (CA .dobbelt), som topper mellem 12 og 24 timer i den udødeliggjorte murine osteoblastiske cellelinie MC3T3-E1. I denne undersøgelse blev den procentvise kollagen syntetiseret af kulturerne (kollagen i forhold til total proteinsyntese) ikke rapporteret; som et resultat var det ikke muligt at bestemme selektiviteten af 1,25(OH)2D3-effekten for kollagensyntese. 1,25 (OH) 2D3 øger også kollagenekspression i den humane osteoblastiske osteosarkomcellelinie MG-63 og primære kulturer af humane osteoblastiske celler . Interessant nok blokeres stigningen i kollagensyntese med 1,25(OH)2D3 i mg63-celler af insulinlignende vækstfaktorbindende protein 5, som interagerer direkte med VDR og forhindrer heterodimerisering med retinoid-receptoren RKSR . I andre undersøgelser har 1,25 (OH) 2D3 imidlertid vist sig at reducere den procentvise kollagensyntese i MC3T3-E1-celler . MC3T3-E1 og MG-63 repræsenterer præosteoblastiske celler, der gennemgår in vitro osteogen differentiering med ascorbinsyre; 1,25(OH)2D3 hæmmer cellevækst og øger osteocalcin-ekspression og alkalisk phosphataseaktivitet i begge cellelinjer. MC3T3E1-celler, som de fleste udødelige osteoblastiske cellelinjer, viser signifikant fænotypisk variation . Derfor kan nogle af disse uoverensstemmende resultater skyldes variationer i de celler, der anvendes til eksperimenterne. Samlet set antyder disse data, at 1,25 (OH)2D3 kan fungere som et differentierende hormon i tidlige celler i osteoblast-slægten, hvilket resulterer i øget type i-kollagenekspression. I modsætning hertil hæmmer 1,25 (OH)2D3 type i-kollagenekspression i modne osteoblaster.