Kromosommaleri
8 Kromosomområder
i stedet for at blive spredt gennem kernen indtager hvert kromosom et særskilt volumen, kaldet et kromosomområde. Dette er blevet demonstreret ved kromosommaleri – en FISKEBASERET teknik, hvor genomet hybridiseres til et stort antal kromosomspecifikke prober for at muliggøre visualisering af individuelle kromosomer i kernen. Den radiale positionering af et kromosom påvirkes stærkt af dets sammensætning—genfattige kromosomer har tendens til at indtage positioner tættere på den nukleare periferi, mens genrige kromosomer oftere er placeret mod det indre . Denne tendens illustreres af humane kromosomer 18 og 19, som er meget ens i størrelse, men har meget forskellig sekvenssammensætning: kromosom 18 er genfattig, mens 19 er genrig. Bickmore lab brugte kromosom territory FISH til at undersøge positionerne for de to kromosomer i kernen og fandt, at kromosom 18 konsekvent var placeret tættere på den nukleare periferi end kromosom 19 i både lymfoblastoide og fibroblastcellelinjer . Den radiale positionering af kromosomer i kernen viste sig også at være vævsspecifik, med mere nært beslægtede celletyper, der udviser mere lignende kromosompositionering . Det humane genom indeholder også fem akrocentriske kromosomer, der indeholder rDNA-sekvenser—kromosomer 13, 14, 15, 21 og 22, som normalt er grupperet omkring nukleolus-stedet for transkription og behandling af ribosomalt RNA.
den radiale regel for kromosompositionering påvirker også placeringen af alternerende genrige og genfattige segmenter inden for kromosomer-i dette tilfælde er genrige segmenter placeret mere centralt, mens genfattige regioner besætter regioner tættere på periferien. Derudover er transkriptionelt inaktive segmenter inden for kromosomområder placeret internt, og transkriptionelt aktive segmenter er på overfladen af territoriet . Dette arrangement tillader transkriptionelt aktive regioner klar adgang til transkriptionsmaskineriet og domæner rig på mRNA metaboliske faktorer såsom SC-35 foci . Imidlertid er den fine detaljerede struktur af kromosomområder endnu uklar, hvilket afspejler vores manglende viden om kromatinstrukturerne, der former dem.
fra et genomstabilitetsperspektiv vedrører en vigtig konsekvens af kromosompositioneringsmønstre translokationer, den hyppigste kromosomale abnormitet, der ses i den menneskelige befolkning. Det er veletableret, at den fysiske nærhed af to kromosomer i kernen påvirker sandsynligheden for, at der forekommer en translokation mellem dem (Fig. 23.3).
figur 23.3. Foretrukne positioner af kromosomer i kernen påvirker translokationsfrekvensen.
kromosomer med den samme foretrukne radiale position i kernen (f.eks. kromosomer 17 og 19) er mere tilbøjelige til at være involveret i translokationer end kromosomer med forskellige radiale positioner (f. eks. kromosomer 17 og 18).
en analyse mellem frekvenserne af forskellige ikke-patogene translokationer i den menneskelige befolkning og de foretrukne radiale positioner af kromosomer i kernen viste, at kromosomer med lignende nukleare positioner danner translokationerhyppigere end forventet ved en tilfældighed . En anden undersøgelse var i stand til at demonstrere nærhed mellem BCR og ABL loci, involveret i den velkarakteriserede t(9; 22) translokation, der danner et “Philadelphia” kromosom i kronisk myeloid leukæmi. Forfatterne viste, at BCR-og ABL–loci var tættere på B-lymfocytter end i hæmatopoietiske stamceller, hvilket antyder, at celletypespecifikke aspekter af nuklear organisation kan bidrage til sammenhængen mellem visse translokationer med bestemte kræfttyper. I 2013 offentliggjorde Misteli lab en undersøgelse, der undersøgte dynamikken i dobbeltstrengede pauser og efterfølgende translokationsdannelse i et elegant system: NIH3T3duo-celler koder for et lille antal SceI-begrænsningssteder integreret på forskellige kromosomer, hvor nogle steder støder op til et LacO-array og andre steder, der støder op til et TetO-array. Det var muligt at spore pauserne, der var markeret med fluorescerende mærket Lac (LacR) og Tet (TetR)-repressor proteiner; translokationsdannelse blev indikeret ved langvarig, stabil co-lokalisering af LacR-og TetR-signalerne. Forfatterne var i stand til at demonstrere, at de fleste translokationer dannes af loci, der er tæt placeret inden brudinduktion (Kontakt-første model) snarere end som et resultat af en bevægelse af dobbeltstrengede pauser til proksimale placeringer (brud-første model).
ud over metoder til analyse af kromosomområder anvendes to hovedkomplementære metoder til at studere 3D-organisationen af genomet på niveau med højere ordens domænestruktur: Fisk – baserede metoder og kromosom bekræftelse fangstmetoder . Fisk er afhængig af hybridisering af fluorescerende mærkede prober for at visualisere individuelle loci, definerede dele af genomet eller hele kromosomer. Det giver et øjebliksbillede af nuklear struktur på enkeltcelleniveau, men ulemperne er, at det er tidskrævende og giver en begrænset mængde information ved lav opløsning. Kromatinkonformationsindfangningsteknikker (3C) er afhængige af at “fryse” den nukleare struktur ved tværbindingsinteraktioner i kernen, ligere DNA-fragmenter, der holdes i nærheden af tværbindingerne, efterfulgt af PCR eller næste generations sekventering for at identificere hybrid-DNA-fragmenter, hvilket indikerer kontakter. I den mest sofistikerede ende kan disse teknikker teoretisk identificere alle mulige interaktioner i hele genomet, men der er også ulemper. I modsætning til fisk arbejder 3C-teknikker på populationer af celler snarere end på et enkelt celleniveau og producerer et befolkningsgennemsnit, der kan afspejle et antal forskellige kontaktkonfigurationer på enkeltcelleniveau. På trods af advarslerne har 3C-metoder været meget indflydelsesrige inden for 3D-genomorganisation og bidraget med begrebet topologisk tilknytning af domæner (TADs). Tad ‘ er defineres som regioner, der måler 900 kb, hvor kontaktkort viser øgede interaktioner; FISKEBASEREDE undersøgelser har vist, at prober placeret inden for en TAD er fysisk tættere end prober, der ikke er placeret inden for den samme TAD, men adskilt af en lignende “lineær” genomisk afstand . Det fulde humane genom er opdelt i cirka 2000 Tad ‘ er, som også overlapper fordelingen af histonmærker og andre genomiske træk såsom replikationstiming (beskrevet senere). De er dog ikke celletypespecifikke, og spørgsmålet om, hvilket niveau af strukturel organisation de afspejler, og deres funktionelle betydning er stadig åben for debat. Interessant nok kan translokationsfrekvensmønsteret set med kromosomområder også spores til TAD—organisationsniveauet-en undersøgelse udført i B-celler viste, at sandsynligheden for translokation mellem to loci er stærkt relateret til kontaktfrekvensen mellem dem, som defineret af kromosombekræftelsesfangstgenererede kontaktkort .
