Makrofagudtømning med Clodronatholdige Liposomer reducerer Neointimal dannelse efter Ballonskade hos rotter og kaniner

inflammatoriske celler spiller en vigtig rolle i vaskulær reparation, rekrutteret umiddelbart efter skade.1,2 makrofaginfiltration i atherektomivæv og aktiveringsstatus for blodmonocytter korrelerer med en øget restenosehastighed.3,4 virkningerne af makrofager i restenose er sandsynligvis forårsaget af deres evne til at udtrykke adskillige vækstfaktorer, cytokiner og ensymer, der bidrager til udviklingen af restenose.5 vi antog således, at systemisk inaktivering af monocytter og makrofager kan føre til dæmpning af neointimal dannelse, og at makrofager spiller en central rolle i patogenesen af restenose.

makrofagudtømning kan opnås ved systemisk injektion af liposomer indeholdende clodronat.6 Clodronat tilhører familien af bisfosfonater (BPs), knoglesøgende midler, der er potente hæmmere af osteoklaster. Som andre BPs har clodronat dårlig cellemembranpermeabilitet.7 Liposomer optages let af celler i det reticuloendoteliale system, især makrofager. Liposommedieret afgivelse af clodronat inaktiverer og dræber makrofager efter effektiv fagocytose8, men er ikke toksisk for nonphagocytiske celler.6

metoder

Liposomer

Clodronat (Sifavitor) og rhodamin RE (Avanti polære lipider) blev indkapslet i Liposomer sammensat af 50 liter/L distearoyl-phosphatidylglycerol (DSPG) (Avanti), 100 liter/L kolesterol (Sigma-kemikalier) og 150 liter/L 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (Dspc) (Avanti) ved omvendt fase fordampning teknik, som beskrevet andetsteds.9 Den gennemsnitlige størrelse af liposomer var henholdsvis 190 liter 18 nm, 24,5 mmol/L og 20 mmol/L, clodronat og lipider.

validering af LC biologisk aktivitet blev bestemt på makrofaglignende rå 264 celler. LC, men ikke frit clodronat, reducerede signifikant antallet og proliferationen af levedygtige celler på en dosisafhængig måde og påvirkede ikke glatmuskelceller (SMC ‘ er) eller endotelceller (EC) levedygtighed og proliferation i koncentrationer op til 500 liter/L (data ikke vist) i overensstemmelse med de offentliggjorte data.8,10

Kaninmodel

hvide kaniner (Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel), der vejer 2,5 til 3.5 kg blev brugt i overensstemmelse med retningslinjerne for dyrepleje fra det hebraiske universitet i Jerusalem og National Institutes of Health (USA). Dyr blev fodret med en atherogen diæt på 2% kolesterol og 6% jordnøddeolie, startende 30 dage før angioplastik. Hypercholesterolæmi blev konstateret (plasmakolesterol >1200 mg/dL). Dyrene blev bedøvet med ketamin (7 mg / kg) og ketamin (40 mg/kg). Heparin (200 E / kg), atropin (0,05 mg) og nicotinat (70 mg) blev givet. Ballonskade blev udført på den venstre fælles halspulsårer med et 3 mm angioplastikballonkateter (Cordis, 2 til 1 minuts inflation ved 8 atm). Dyr blev tilfældigt tildelt intravenøst liposomalt eller frit clodronat (15 mg/kg), tomme liposomer eller buffer. En efterforsker blindet for typen af eksperimentel gruppe udførte eksperimenterne. Efter eutanasi med pentothal blev arterier perfusionsbestemt in situ med 150 mL 4% formaldehydopløsning (pH 7.4), behandlet til morfometrisk analyse, og farvet med verhoeff elastin farvning, Mayer hæmatoksylin og eosin, og modificeret Movat pentachrome.

rottemodel

han Sabra rotter (Harlan laboratorier), der vejer 350 til 420 g, blev anvendt. Rottehalspulsskademodellen blev udført som beskrevet tidligere.11,12 liposomalt clodronat (15 mg/kg) blev injiceret på dag -1 og +6. Organer blev høstet på dag 14 og behandlet som beskrevet ovenfor.

Morfometrisk analyse

otte til 10 sektioner i hvert dias blev analyseret ved hjælp af computeriseret morfometrisk analyse (NIH-billede) af en efterforsker blindet for typen af den eksperimentelle gruppe. Sektionen med den største luminale indsnævring af neointima blev analyseret som tidligere beskrevet.11 det resterende lumen, det område, der er afgrænset af det indre elastiske lamina (det oprindelige lumen), og det område, der er afgrænset af det ydre elastiske lamina (det samlede arterielle område), blev målt direkte. Graden af neointimal fortykning blev udtrykt som forholdet mellem området af neointima og det oprindelige lumen (% stenose) og som forholdet mellem det neointimale område og medieområdet (N/m). Graden af ombygning, indsnævring (negativ) og ekspansiv (positiv) og ombygningsforhold (RR) blev estimeret ved at sammenligne forholdet mellem det samlede arterielle område af det ballonskadede segment med det for et tilstødende, ikke-skadet referencesegment.

Strømningscytometri

antikoaguleret blod (200 liter) blev inkuberet i 30 minutter (4 liter C, i mørke) med mus anti-human RPE-konjugeret anti-CD14 (DAKO). FACS lysing opløsning (1: 20 fortynding) blev tilsat i 15 minutter. De resterende celler blev vasket (1500 rpm, 5 minutter, 4 C) i FACS-medium (PBS, 1% BSA, 0,02% natriumatsid) og suspenderet i 1 mL FACS-medium til strømningscytometri. Monocytter blev identificeret i henhold til deres relative størrelse, sidespredning og fluorescens.

Distribution af liposomer

kaniner blev injiceret med rhodaminmærkede liposomer (0, 4 mg/kg) og LC eller buffer på dag -1 og euthaniseret på dag +1 og +6. Blodmonocytter blev adskilt ved anvendelse af en Ficollgradient (Sigma) og centrifugering (kun 1500 omdr. / min., 5 minutter). Høstede væv blev skyllet i saltvand; sektioner blev monteret på dias og observeret ved konfokal mikroskopi (Seiss LSM 410).

immunhistokemi

Eksplanterede prøver blev udskåret efter kort saltvandsperfusion og straks frosset i OCT-forbindelse til kryosektionering (Ted Pella, Inc). Dias blev deparaffiniseret, inkuberet med 1% H2O2 i methanol (10 minutter) for at blokere endogen peroksidase og derefter med 10% hesteserum PBS i (20 minutter). Primære antistoffer mod kanin RAM-11 (DAKO) eller PCNA (PC10, DAKO) blev påført i 1 time ved 37-C. Sektioner blev derefter vasket med PBS efterfulgt af biotinyleret sekundært antistof (hest anti-mus IgG, Vektorlaboratorium) og et avidin-biotin-peroksidasekompleks (ABC Elite kit, Vektorlaboratorium) i 30 minutter hver. Udvikling af farve blev opnået ved 5 minutters eksponering for 3,3 ‘ – diaminobensidintetrahydrochlorid (DAB peroksidasesubstrat, Sigma Chemical Co) i nærvær af peroksidasesubstrat (Sigma). 3 hæmatoksylin (Sigma). Positiv farvning blev evalueret under et mikroskop (Olympus, BKS40) ved 2 liter/0,25 10 liter/0.25 forstørrelse og digitaliserede videobilleder. Forekomsten af makrofager blev vurderet som det gennemsnitlige procentvise areal besat af positivt farvede celler i 5 til 6 højeffektfelter.

IL-1 liter produktion og transkription

Separate grupper af dyr blev anvendt til disse undersøgelser. Arterier og lever blev homogeniseret i kollagenasebuffer, og ekstraheret IL-1-kar blev målt ved hjælp af kommercielle ELISA-sæt (R&D-systemer).

til revers transkription–polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse blev RNA fra carotidarterierne ekstraheret ved anvendelse af et RNA-isolationssæt (Life Technologies). Kvaliteten, størrelsen og mængden af RNA blev undersøgt, og værdierne af båndene blev normaliseret til mRNA-ekspression af mRNA.13

Metalloproteinase-2-aktivitet

supernatanten af arteriehomogenat i kollagenasebuffer blev analyseret for kollagenaseaktivitet. Prøver blev adskilt på gelatineimprægneret (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyacrylamidgeler under ikke-reducerende forhold, rystet 30 minutter i 2,5% Triton H-100 (BDH), inkuberet i kollagenasebuffer (16 timer, 37 liter C) og farvet med 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) i methanol/eddikesyre/H2O (30:10:60). Båndintensitet blev bestemt ved computeriseret densitometri (molekylær dynamik type 300A).

statistik

Data er udtrykt som middelkr. Sammenligninger af histologiske fund mellem kontrol-og behandlingsgruppe blev foretaget af den uparrede studerendes t-test. Sammenligninger af blodmonocytter og cytokiner over tid blev foretaget med 2-vejs ANOVA-analyse. Forskelle blev betegnet statistisk signifikante ved P< 0,05.

resultater

forebyggelse af Postangioplasti hyperplasi

massiv proliferation af SMC ‘ er og ekstracellulær matricsdannelse blev set hos kontroldyr efter ballonskade (Figur 1, a og b). Der blev ikke fundet signifikante forskelle mellem behandling med tomme liposomer, saltvand eller frit clodronat i opløsning (resultater samlet som kontroller). N / m-forholdet var 1,4 g 0,44 (figur 1e), og luminal stenose var 75 g 8%. LC (15 mg/kg, dag -1 og +6) reducerede n/m-forholdet til 0,66 liter 0,2 (Figur 1,c, d og e) og luminal stenose til 41 Liter 8%. Mild ekspansiv ombygning forekom i begge kontroller (RR=1. 22 g 0,24) og LC-behandlede dyr (RR=1,29 g 0,25). Det mediale område, knoglemorfologi og mineralsammensætning blev ikke påvirket af LC-behandling (data ikke vist). Ingen åbenlys infektion og ingen påviselige systemiske bivirkninger blev observeret.

for at fastslå effekten af makrofagudtømning i en nonhypercholesterolemisk dyremodel (ingen skumceller) blev rottehalspulsskademodellen anvendt.11 den markerede neointima blev undertrykt ved LC-behandling uden nogen signifikant ændring i medialt og totalt arterielt område (tabel).

virkningsmekanisme

reduktion af blodmonocytter og vævsmakrofager

baseline-monocytniveauet var 2, 8 liter 0, 5% af de hvide blodlegemer. Før operationen, 24 timer efter LC-injektion, blev monocytter kraftigt reduceret til <0,2% af det samlede leukocyttal (figur 2,a og b), mens antallet af leukocyttal forblev uændret. Tre dage efter operationen blev blodmonocytter let forøget til 3,5 liter 0,4% hos kontroldyr og 0,7 liter 0,7% hos LC-behandlede dyr og vendte tilbage til baseline-niveauer efter 6 dage (figur 2C).

lever-og miltmakrofager blev reduceret med LC (RAM 11-farvning) 6 dage efter skade (figur 3). Det positivt farvede område i leveren blev signifikant reduceret fra 21,5-4% til 14,7-2,9% og i milten fra 33,3-1,5% til 11,4-3% i henholdsvis kontrol-og LC-behandlede kaniner. Tilsvarende blev nedsat arteriel RAM – 11-farvning for makrofager observeret hos LC-behandlede kaniner 3 og 6 dage efter skade (figur 4).

reduktion af monocytter og makrofager blev også påvist ved injektion af fluorescerende liposomer (FL). Markant reduktion af det fluorescerende signal blev observeret i blodmonocytter (såvel som reduceret antal) og i leveren og milten hos LC-behandlede dyr (figur 5). FL blev påvist i sårede, men ikke i intakte arterier. FL coadministreret med LC reducerede signifikant det fluorescerende signal i den skadede arterievæg (figur 5).

PCNA, IL-1-karrus og Metalloproteinase-2

det område, der var positivt farvet for PCNA 6 dage efter skaden, blev signifikant reduceret fra 5,6-karrusel 2,6% hos kontroldyr til 1,7-karrusel 1,3% hos LC-behandlede kaniner (figur 6, a og b). Neointima blev næppe observeret på dette tidlige tidspunkt, hvor SMC-proliferation er maksimal.

analyse af IL-1-niveauer i arterievæv efter skade afslørede et klokkeformet mønster, der toppede 6 dage efter skade og vendte tilbage til basale niveauer efter 30 dage (figur 7a), og et signifikant fald i IL-1-niveauer blev observeret efter 3 og 6 dage hos LC-behandlede dyr. Hos kontroldyr var IL-1-mRNA-transkription stærkere på dag 3 end det svagere udtryk 1 dag efter skade, men begge blev signifikant reduceret ved LC-behandling (figur 7b). IL-1-niveauer i leveren blev også reduceret efter en enkelt injektion af LC på dag -1, hældning til basale niveauer efter 30 dage (data ikke vist).

arteriel matrice metalloproteinase (MMP-2) aktivitet steg efter skade, der udviste et klokkeformet mønster, der toppede efter 6 dage (292 liter 46) og vendte tilbage til basale niveauer efter 14 dage (figur 7c). LC betydeligt lindret MMP-2 aktivitet, og på dag 6 var det kun 52 til 17.

Diskussion

denne undersøgelse viser for første gang, at inaktivering af makrofager ved systemisk administration af liposomindkapslet clodronat hæmmer luminaltab efter ballonskade hos både rotter og hypercholesterolemiske kaniner. Disse resultater validerer vores hypotese om, at makrofager spiller en central rolle i patogenesen af accelererede arteriopatier. Den observerede stigning i luminalområdet blev hovedsageligt opnået gennem reduktion i neointimal hyperplasi. En mild stigning i ekspansiv ombygning blev også demonstreret, men dens bidrag til forskellen i luminalområdet var minimal.

Clodronat tilhører familien af BPs, lægemidler, der anvendes klinisk i knoglerelaterede lidelser, herunder osteoporose. At være meget hydrofil og negativt ladet, er fri BP ‘ er næsten ude af stand til at krydse cellulære membraner.7 BP-optagelse af knogleresorberende osteoklaster (med oprindelse som makrofager fra blodmonocytter) opstår, når cellerne opsluger lægemiddelbelagt knogle.7 hverken frit clodronat eller LC hæmmede SMC-eller EF-proliferation eller neointimal dannelse. Effektiv og selektiv endocytose af clodronat i makrofager opnås ved at indkapsle clodronat i Liposomer.9,10,14 efter fagocytose forstyrrer lysosomal virkning de fede dobbeltlag af liposomet, og frit clodronat frigives i cellen, hvilket forårsager irreversibel funktionel skade og apoptose.8,15

LC-administration afbrød sandsynligvis den tidlige fase respons på skade, som medieres af makrofagmigration som reaktion på MCP-1-ekspression.16 injektion af LC før skade kraftigt udtømt blodmonocyt (figur 2) og makrofagantal og aktivitet i leveren, milten og den skadede arterievæg (figur 3, 4 og 5). Reduktionen i monocytter, der var tilgængelige på skadetidspunktet, reducerede intimal hyperplasi, måske svarende til virkningerne set med deaktivering af blodmonocytter ved IL-10.17 blokering af monocyt/makrofagmigration til det skadede kar fra lumen og/eller adventitia (figur 5) forhindrede virkningerne af disse celler på SMC-migration og proliferation.

IL-1 og MMP-2 niveauer blev reduceret i skadede arterielle segmenter efter LC-behandling. Disse vigtige produkter af aktiverede makrofager, udskilt efter arteriel skade, bidrager til processen med neointimal proliferation.18-20 reduceret SMC-proliferation kan også bidrage til reduktion af IL-1-kur og MMP-2.21 ikke desto mindre, da LC ikke påvirker SMC ‘ er og ECs og ikke har nogen effekt på fibroblaster,9 makrofagen er sandsynligvis det primære mål for LC. Inhiberingen af intimal hyperplasi i rottemodellen uden skumceller i arterien understøtter yderligere systemisk udtømning af makrofager, da mekanismen, der driver, reducerede SMC-proliferation og neointimal dannelse. Samlet set reducerede denne forbigående systemiske immunmodulerende og antiinflammatoriske virkning SMC-migration og proliferation og arteriel restenose.

vores resultater er samtidige med de gavnlige virkninger observeret efter modulering af makrofagfunktion ved forskellige modaliteter. Reduceret dannelse af neointima efter skade blev opnået hos kaniner ved blokade af Mac-122 og hos MAC-1–mangelfulde mus.23 således, i overensstemmelse med de seneste rapporter, 9,17,22,23 den inflammatoriske proces spiller en central rolle i kaskaden af neointima dannelse. Makrofagudtømning reducerer også hyperplasi af venetransplantater.24 På trods af den forskellige patologi med hensyn til trigger, påvirket kar, den underliggende plak i den angioplastiserede arterie, sammensætningen af det stenotiske væv og varigheden af processen antyder den positive virkning i venetransplantatmodellen en fælles rolle af makrofager i stimulering af vaskulær intimal hyperplasi.

implikationer og begrænsninger

frit clodronat gennemsyrer ikke celler og har en kort halveringstid i den systemiske cirkulation.6 Clodronat, der lækker fra døde makrofager og liposomer, akkumuleres ikke i væsentlig grad i andet væv end knogler. Der blev ikke set nogen effekt på somatisk vækst eller på serummineralindhold efter LC-behandling, da resultatet af liposomalformuleringen, som med de fleste andre liposomer og partikelafgivelsessystemer, var i det reticuloendotheliale system. Desuden bør to injektioner af 15 mg/kg frit clodronat ikke have nogen virkning på normal knogle.25

inaktivering af makrofager bærer faren for immunsuppression og infektion. Imidlertid,som i undersøgelser af Mac-1–mangelfuld mice26 og rotter, 24 ingen åbenlys infektion blev observeret i vores undersøgelse med forbigående makrofagudtømning. Blodmonocytter blev fuldstændigt genvundet i denne undersøgelse 6 dage efter injektion, og IL-1-kilokoncentrationer vendte tilbage til basale niveauer. Andre har vist, at genopretning af makrofagfunktion 4 til 6 dage efter LC-induceret udtømning ikke fremkalder nogen langsigtede toksiske virkninger.6,14 de kliniske implikationer af forbigående, delvis udtømning af lever-og miltmakrofager med systemisk LC bør undersøges yderligere i humane forsøg.

et stort antal rapporter om farmakologiske forsøg på at hæmme intimal hyperplasi hos dyr blev ikke oversat til efterfølgende hæmning af restenose hos mennesker. Den aktuelle undersøgelse bruger LC som et efterforskningsværktøj til at belyse betændelsens rolle i vaskulær reparation og den mulige værdi af modulerende medfødt immunitet i reduktion af intimal hyperplasi efter skade. At fordelen blev observeret i to dyremodeller, rotten og den hypercholesterolemiske kanin, med forskellig skade og forskellige grader af betændelse, understøtter den største rolle af monocytter og makrofager i vaskulær reparation og øger den forudsigelige værdi for inhibering af restenose hos mennesker.

Makrofagrige områder er fremherskende i aterosklerotiske læsioner hos patienter med ustabil angina og akut myokardieinfarkt,3 og makrofager formidler sandsynligvis brud på den aterosklerotiske plak og pludselig begyndelse af akutte koronarsyndromer.27 yderligere undersøgelser er berettiget til at undersøge, om makrofagudtømning af liposomale bisphosphonater kan give en strategi til stabilisering af andre inflammatoriske medierede vaskulopatier og kardiomyopatier, herunder akutte koronarsyndromer.

afslutningsvis hæmmede administration af LC neointimal proliferation efter ballonskade hos rotten og i de hypercholesterolemiske kaninmodeller. Den foreslåede mekanisme er systemisk selektiv, forbigående modulering af monocyt / makrofagaktivitet. Selvom makrofager er relativt magre i neointimalt væv, spiller de en vigtig rolle i processen med neointimal proliferation. Derfor reducerer tidlig modulering og inaktivering af makrofager i 1 uge efter skade signifikant postangioplastik arteriel indsnævring på et senere tidspunkt.

fodnoter