minimumsinformation for rapportering om Kometanalysen (MIRCA): anbefalinger til beskrivelse af kometanalyseprocedurer og resultater

MIRCA-retningslinjerne er udarbejdet af medlemmer af hCOMET COST Action med det formål at forbedre analysen og rapporteringen af kometanalyseresultater (http://www.hcomet.eu/). Forfatterne er kometassayeksperter med mindst otte års erfaring med disse analyser (15 af forfatterne har >20 års relevant erfaring). Vi har brugt et internetbaseret spørgeskema til at prøve udtalelser fra forfatterne om vigtigheden af rapporteringsoplysninger (tabel 1; supplerende Data). Hvert stykke information blev klassificeret af forfatterne som ‘væsentlig’, ‘ønskelig’ eller ‘ikke vigtig’, og en tærskel på K. 75% kongruens blev brugt til klassificeringerne. Hvis antallet af besvarelser af væsentlige oplysninger ikke nåede op på grænsen på 75%, blev svarene vedrørende væsentlige oplysninger og ønskelige oplysninger kombineret, og oplysningerne blev klassificeret som ønskelige oplysninger, hvis forfatterne på 75% var enige om, at de enten var væsentlige eller ønskelige. I tabel 1 indeholder vi forklarende bemærkninger til hver anbefaling.

specifikke MIRCA-anbefalinger for hvert trin i kometanalysen

trin 1a: Isolering af celler og fremstilling af enkeltcellesuspensioner

da kometanalysen anvender suspensioner af enkeltceller, skal prøver, der ikke opnås som enkeltceller, behandles mekanisk eller ensymatisk for at forstyrre cellernes binding til en ekstracellulær matrice eller til hinanden. Dette kan føre til fjernelse af DNA-læsioner på grund af aktiviteten af endogene DNA-reparationssymmer eller øge DNA-skadeniveauerne ved at frigive nukleaser fra cellerne. Sammensætningen af homogeniseringsbufferen er ‘ønskelig’ information, især med hensyn til de komponenter, der er nødvendige for at bevare DNA-integritet (f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre)24,25. En beskrivelse af proceduren for isolering af enkeltcellesuspensioner, herunder homogenisering af vævet, anses for at være ‘ønskelig’ information, der skal rapporteres i artikler.

blodprøver bruges ofte i humane biomonitoreringsundersøgelser. Fordi blod repræsenterer en heterogen population af celler, er detaljerede oplysninger om cellepopulationen ‘væsentlige’ i publikationer. Teksten skal præcist beskrive, om prøverne er fuldblod (inklusive røde blodlegemer), leukocytter, mononukleære blodlegemer eller en delmængde af celler (f.eks. lymfocytter). Det kan også være nyttigt at medtage oplysninger om proceduren for venepunktur, type antikoagulant og efterfølgende metode til celleisolering (dvs.centrifugering og vasketrin) for dem, der gentager eksperimentet, så dette klassificeres som ‘ønskelig’ information. Oplysninger om opbevaringsbetingelserne for cellerne eller vævene, hvis de er kryokonserverede, samt frysemetoden (f.eks. snapfrysning på tøris eller i flydende nitrogen eller en langsom fryseprocedure) og optøningsprocedure betragtes som ‘væsentlige’ oplysninger, der skal rapporteres, da disse processer har vist sig at påvirke det basale niveau af DNA-migration26.

trin 1b: Forberedelse af substratceller til in vitro DNA-reparationsanalysen

enhver eukaryot celletype kan bruges som en substratcelle til in vitro DNA-reparationsanalysen, og celletypen og densiteten er ‘ønskelige’ oplysninger at rapportere. Det er’ vigtigt ‘ at rapportere metoden og typen af genotoksisk forbindelse, der anvendes til at inducere DNA-læsioner i substratcellerne og efterfølgende cellelagringsbetingelser, hvorimod det samlede niveau af DNA-læsioner, der kan påvises i substratcellerne (f. eks., antallet af FORMAMIDOPYRIMIDIN DNA glycosylase-følsomme steder i celler behandlet med Ro19-8022 plus lys) anses kun for at være ‘ønskelig’ information.

trin 1C: Assay controls

i denne artikel henviser assay controls til prøver, der er inkluderet i hvert comet assay eksperiment; disse kaldes undertiden referencestandarder, interne kontroller eller tekniske kontroller16,27. Analysekontrollerne er typisk kryokonserverede alikvoter fra en enkelt batch af celler, der er blevet udsat for et DNA-strengbrydningsmiddel (f. eks. eller en behandling, der forårsager en bestemt type DNA-læsion (f.eks. fotosensibilisatoren Ro19-8022 plus lys eller kaliumbromatbehandling for at inducere DNA-iltning). Der er forskellige analysekontroller til standard alkaline comet assay og den modificerede komet assay. Den forbindelse, der anvendes til det modificerede assay, bør ikke generere DNA-strengbrud, da disse reducerer det dynamiske område for de følsomme steder. I biomonitoreringsundersøgelser såvel som tværsnits -, interventions-og kliniske undersøgelser kan ueksponerede celler bruges som analysekontrol. Det er’ vigtigt ‘ at rapportere skadesniveauer i analysekontroller og analysevariation (standardafvigelse) i både standard-og kometassayet.

in vitro DNA-reparationsanalysen bruger interne eksperimentelle kontroller, som også bruges til beregning af reparationsaktiviteten snarere end assaykontroller i sig selv. Det er ‘væsentlig’ information at rapportere niveauet af DNA – reparationsinsnit i nukleoider Fra (i) ikke-eksponerede substratceller inkuberet med reaktionsbuffer for at bestemme det basale niveau af DNA-skade i substratets DNA (dvs. ‘baggrundskontrol’); (ii) eksponerede celler inkuberet med reaktionsbufferen for at afsløre niveauet for eventuelle uspecifikke DNA-strengbrud eller abasiske steder som følge af behandlingen med det skadelige middel (dvs. ‘behandlingskontrol’); (iii) ikke-eksponerede substratceller inkuberet med proteinekstrakt fra prøven for at kontrollere for uspecifik indsnits-eller spaltningsaktivitet (dvs. ‘specificitetskontrol’) og (iv) eksponerede substratceller inkuberet med læsionsspecifikt, svarende til analysekontroller for den modificerede komet-analyse (dvs. ‘inkubationsreaktionskontrollen’).

trin 1D: Negative og positive kontroller

i denne artikel henviser negative og positive kontroller til forsøgsgrupperne, som beskrevet i OECD guideline (TG 489) for in vivo comet assay i dyrevæv18. Således vedrører negative og positive kontroller hele eksperimentet. En positiv kontrol henviser til en direkte eller indirekte virkende genotoksisk forbindelse, der producerer DNA – strengbrud eller følsomme steder detekteret med kometanalysen. Der findes ingen liste over positive kontroller, der svarer til de forbindelser, som OECD opregner som positive kontroller for den alkaliske kometanalyse (til inducering af DNA-strengbrud) i specifikke dyrevæv. Derudover findes der ikke en positiv kontrol for humane biomonitoreringsundersøgelser, da raske mennesker ikke bevidst kan udsættes for et genotoksisk middel. Positive kontroller betragtes allerede som obligatoriske i cellekultureksperimenter inden for genetisk toksikologi og vil de facto være ‘væsentlige’ oplysninger i artikler, der bruger kometanalysen. I dyreforsøg, dog til praktiske formål comet data om assay kontrol (dvs., prøver nævnt i afsnittet ovenfor med titlen ‘trin 1C, Assay Controls’) er tilstrækkelige, mens resultater fra ægte negative og positive kontroller kun anses for at være ‘ønskelige’ oplysninger.

Trin 2: indlejring af cellerne i agarose

kometanalysen blev oprindeligt udviklet ved hjælp af tre lag agarose på glasskinner, hvor det midterste lag indeholder cellerne. Det øverste lag af agarose er imidlertid ikke nødvendigt, og visse procedurer bruger ikke et bundlag (f.eks. Det er’ ønskeligt ‘ at rapportere typen af dias og størrelse (dvs., overfladeareal) af gelerne, da andelen af cellerne nær kanten af gelen øges, når gelstørrelsen falder, og DNA ‘ et i nukleoider ved kanten af gelen kan migrere forskelligt fra det i nukleoider mod midten af gelen22. Den endelige koncentration af agarose (med cellerne indlejret deri) er ‘væsentlig’ for at rapportere, da migrationen af DNA afhænger af gelens densitet.

Trin 3: Lysis af cellerne

der er flere procedurer til lysering af celler i kometanalysen. Oplysninger om sammensætningen af lyseopløsningen er ‘væsentlige’. Med proteinase K) kan være påkrævet for visse typer celler, og detaljer om inkubationen skal også rapporteres som ‘væsentlige’ oplysninger. Nogle rapporter antyder,at varigheden af lysis kan påvirke stabiliteten af visse typer DNA-læsioner28,29, 30, så varigheden af lysis og temperaturen af lysis-opløsningen er ‘ønskelig’ information at rapportere.

trin 4a: Da lysis-opløsningen kan hæmme reparations-aktiviteten,er det ‘ønskeligt’ at fastslå, om der blev udført et vasketrin mellem lysis-trinnet og behandling (dvs.sammensætningen af vaskebufferen, antal vaskninger og varighed). Det er vigtigt at videreformidle oplysninger om kilden til reparationssymmer, da forskellige producenter har vist sig at være forskellige i både deres aktivitet og deres specificitet over for nukleobaselæsioner16. I de fleste kometundersøgelser udføres titreringskurveeksperimenter for at identificere optimale betingelser for behandling31; resultaterne af titreringskurver rapporteres dog sjældent og klassificeres her som ‘ønskelig’ information (henvisning til en tidligere undersøgelse kunne foretages i stedet), selvom vi betragter det som ‘vigtigt’ at rapportere behandlingens varighed og temperatur. Det foretrækkes at rapportere koncentrationen i enheder (U/ml), selvom proteinkoncentrationen (mg/ml) også er nyttig. Inkubator, glidevoldgrav eller 12-gel-system) og inkubationsmåde er ‘ønskelige’ oplysninger, der skal rapporteres. Det skal angives, om inkubationen blev udført (i) i et bad eller med en dråbe og dækglass på objektglasset, (ii) i en standard 2-gel-version, 12-gel-eller flerbrøndssystem eller (iii) i en befugtet kasse i en inkubator, på en varmeplade eller i en opvarmet objektglasgrav.

trin 4b: Ekstraktionspræparation og inkubation til in vitro DNA-reparationsanalysen

det er ‘ønskeligt’ at rapportere antallet af celler eller vævsmasse, der bruges til at fremstille proteinekstrakterne, mens det er ‘vigtigt’ at rapportere den endelige proteinkoncentration af celle-eller vævsekstrakter, der tilsættes til substratets DNA. Sammensætningen af ekstraktionsbufferen (‘ønskelig’ information) er mindre afgørende end sammensætningen af inkubationsbufferen (‘væsentlig’ information), fordi sidstnævnte kan påvirke baggrundsniveauet for DNA-migration. Det er ønskeligt at rapportere resultaterne fra titreringseksperimenter eller henvise til tidligere undersøgelser fra det samme laboratorium, hvor disse er blevet udført. Mængden af ekstrakt tilsat til de gelindlejrede substratceller er ‘ønskelig’ information. Det er’ vigtigt ‘ at rapportere inkubationsperiodens varighed og temperatur, fordi disse påvirker antallet af reparationsindsnit. For det første er det nødvendigt at foretage en undersøgelse for at sikre, at der ikke er nogen risiko for, at en sådan undersøgelse finder sted. Oplysninger om identiteten af det anvendte middel til inkubationsreaktionskontrol (med angivelse af mængden af DNA-læsioner i substratcellerne) og sammensætningen af den buffer, der anvendes til baggrundsniveauet for DNA-reparationsinsnit I ikke-eksponerede substratceller, er ‘væsentlige’, fordi de er afgørende for at påvise pålideligheden af DNA-reparationsinsnittets aktivitet.

Trin 5: alkalisk behandling

den høje alkaliske pH-opløsning forstyrrer hydrogenbindingen, der holder DNA-strengene sammen og omdanner også visse nukleobase-læsioner til DNA-strengbrud. Varigheden af alkalisk behandling kan således påvirke niveauet af DNA-migration i den efterfølgende elektroforese32, 33, 34. Specifikke oplysninger om sammensætningen af den alkaliske opløsning, pH, temperatur og behandlingsvarighed er således ‘væsentlige’ oplysninger, der skal rapporteres.

Trin 6: elektroforese

de vigtigste drivkræfter for DNA-migration er varigheden af elektroforese og det elektriske potentiale (spændingsfald over elektroforesetankplatformen)35. Det er’ vigtigt’, at sammensætningen af elektroforesebufferen, styrken af elektroforese (spændingsgradient (V/cm) over elektroforesetankplatformen) og varigheden af elektroforese rapporteres. Høj temperatur under elektroforese kan påvirke DNA-migrationen36; således er information om temperaturen af elektroforeseopløsningen ‘essentiel’, og dette kan ledsages af beskrivelser af trin, der er taget for at holde temperaturen konstant (f.eks. afkøling af platformen eller cirkulation af bufferen).

Trin 7: Neutralisering

dette trin indebærer fjernelse af overskydende alkalisk opløsning fra diasene for at sikre effektiv farvning. Det er’ ønskeligt ‘ at beskrive sammensætningen af neutraliseringsopløsningen.

Trin 8: farvning og visualisering

DNA-bindende farvestoffer har forskellige bindingsaffiniteter til DNA og kan derfor påvirke beregningen af de primære kometassay-deskriptorer i billedanalyseprogrammet anderledes36,37,38. Farvetypen er ‘væsentlig’ information, mens koncentrationen er’ ønskelig ‘ information, ligesom tiden mellem farvning og visualisering. Lysets intensitet fra forskellige typer mikroskoplamper adskiller sig. Derudover varierer det på grund af lampens alder og den tid, den er tændt under scoringen af kometer. Der er imidlertid ingen standardprocedure til måling af lysets intensitet og korrigering af niveauet af DNA-migration i overensstemmelse hermed. Desuden kan den samme komet synes at have forskellige niveauer af DNA-migration ved forskellige forstørrelser af mikroskop. Det er således ‘ønskeligt’ at rapportere mikroskopforstørrelsen, der anvendes til scoringen. Det er ønskeligt at vise repræsentative billeder af kometer (f. eks., kontrol med ringe eller ingen migration, moderat og omfattende DNA-migration) sammen med de rapporterede niveauer af DNA-migration.

trin 9a: Scoring og dataanalyse

dette trin kræver rapportering af ‘væsentlige’ oplysninger til den primære kometassay-deskriptor (f. eks.. %DNA i Hale, halelængde, halemoment eller visuel score), antallet af kometer, der analyseres pr.prøve, og hvordan det samlede niveau af DNA-migration udtrykkes (f. eks. Det er ‘ikke vigtigt’ at rapportere det individuelle resultat af hver komet i hver gel; de kombineres for at beregne det samlede skadeniveau. Da det ikke kan udelukkes, at forskellige billedanalyseprogrampakker kan have forskellige måder at beregne den primære comet assay-forudsigelse på, er det ‘vigtigt’ at rapportere det anvendte program (programnavn, producent, version). Alle primære deskriptorer deler den begrænsning, at det er nødvendigt at have ekspertise i kometanalysen for at forstå, hvad de betyder, Mens hvis der oprettes en kalibreringskurve (ved hjælp af ioniserende stråling, som inducerer brud ved en kendt frekvens), kan resultaterne konverteres til relativ læsionsfrekvens sammenlignet med uændrede nukleotider eller nukleobasepar; sådanne data er utvetydige og formidler information, som alle forskere kan forstå39. Proceduren for at opnå en kalibreringskurve ved anvendelse af ioniserende stråling og konvertere DNA-migrationsniveauer til læsionsfrekvensen i forhold til uændrede nukleotider eller nukleobasepar er blevet rapporteret tidligere40. Det er således ønskeligt at rapportere resultaterne som niveauer af læsioner pr.109 uændrede nukleotider eller 106 nukleobasepar.

trin 9B: DNA-reparationsanalysen

inkubationen med DNA-reparationssymer øger niveauet af DNA-migration, da både det basale niveau af DNA-strengbrud og de specifikke læsioner bidrager til det samlede antal DNA-strengbrud. Da DNA-migrationen, der tilskrives det basale niveau af DNA-skade og specifikke læsioner, kan stamme fra forskellige mekanismer for genotoksicitet, er det utilstrækkeligt kun at rapportere det totale niveau af DNA-skade efter behandling med DNA. I stedet er det ‘vigtigt’ at rapportere genotoksiciteten som følsomme steder, hvor det basale niveau af DNA-migration er trukket fra DNA-migrationen i de behandlede dias.

Da in vitro DNA-reparationsanalysen bruger de samme substratceller med alle celle-eller vævsekstraktprøver, er det unødvendigt at have samtidige baggrunds-og behandlingskontroller for hver prøve i det samme eksperiment (dvs.assay run). Der kan være mere end et substrat (f. eks., når man analyserer både base-og nukleotidudskæringsreparationsaktivitet), og derfor er der behov for separate kontroller for hver type DNA-reparationsassay. Det er’ vigtigt ‘ at rapportere nettoindsnittene ved reparationsekstraktet i substratets DNA.

trin 9c: statistisk analyse af resultaterne

statistiske analyser er ‘væsentlige’. Typen af statistisk analyse afhænger af undersøgelsens design og følger de generelle antagelser i statistisk testning i genetisk toksikologi og biomonitoring41,42.