påvisning og identifikation ved PCR af Clostridium chauvoei i kliniske isolater, bovin fæces og substrater fra biogasanlæg

prøver fra mistænkte tilfælde af blackleg

for muskelprøver fra mistænkte tilfælde af blackleg blev resultaterne fra kultur på FAA-plader efterfulgt af PCR fra kolonimateriale i aftale med eller udført endnu bedre end den biokemiske identifikationsmetode (tabel 2). Disse resultater er i overensstemmelse med Usal et al. . Denne undersøgelse viste, at DNA-præparat fra kultur før PCR gav bedre resultater end PCR anvendt direkte på biomasse.

Kultur efterfulgt af biokemiske identifikationsmetoder er kompliceret i prøver med et højt indhold af kontaminerende flora på grund af behovet for ren kultur, og følsomheden var væsentligt lavere end for Kultur og PCR. I otte tilfælde var det umuligt at påvise C. chauvoei ved Kultur og biokemisk identifikation, men organismen blev påvist ved PCR (tabel 2). Til diagnosticering af blackleg tages muskelvæv ved obduktion, da mængden af C. chauvoei sandsynligvis er højere i muskelvæv end i blod. Den enkelte blodprøve blev taget forkert, men spørgsmålet var blackleg.

ligeledes gav Kultur og detektion ved PCR i en tidligere undersøgelse af et blackleg-udbrud bedre resultater end biokemisk analyse . I et af tilfældene blev den primære kultur af en muskel på en blodagarplade vokset af C. septicum, men gav klare positive resultater for C. chauvoei i PCR.

i de fleste kliniske tilfælde af blackleg mængden af C. chauvoei i inficeret væv er højt og kan let påvises ved PCR-metoden uafhængig af kontaminerende flora. Desuden er PCR-metoden meget hurtigere end den traditionelle biokemiske detektionsmetode, der tager mindst fem dage, og det er vigtigt at have en ren kultur af stammen, hvilket kan kræve ekstra tid til kultur. For at undgå kontaminerende flora bør muskelvævet ikke være for lille; cirka 100-200 g ville være tilstrækkeligt. Uden ren kultur kan ingen stammer være til efterfølgende undersøgelser i fremtiden, hvilket er en ulempe ved at anvende PCR-detektion som den eneste metode.

hos kvæg eksperimentelt inficeret med C. chauvoei blev der udført PCR-analyser på hakket muskel og andre organer, og C. chauvoei blev påvist i alle testede organer . Hakkede muskelstykker fra mistænkte tilfælde af blackleg blev direkte testet ved PCR og sammenlignet med kultur. Påvisningen ved PCR gav bedre resultater end Kultur og biokemisk identifikation , hvilket er uenig med resultaterne i den foreliggende undersøgelse, hvor kun 12% (3 ud af 24) af blod-eller muskelstykkerne var over DETEKTIONSTÆRSKLEN for PCR, mens 9% af kødsaftprøverne var over detektionstærsklen (tabel 2). Hæmmende stoffer er sandsynligvis til stede i muskelvæv. Der er identificeret inhibitorer af PCR-amplifikation i lever, milt og nyre, og der kan være lignende inhibitorer til stede i muskelvæv. Resultaterne fra muskelstykker, der er macereret i sterile fysiologiske saltvandsprøver (26%), svarede ikke godt til resultaterne fra den biokemiske test. Direkte PCR på muskelvæv eller andre lignende prøver er sandsynligvis ikke egnet til at erstatte dyrkningstrin efterfulgt af biokemiske tests eller ved PCR.

Muskelprøver indsamlet af vatpinde

for at undersøge, om det er nødvendigt at sende muskelvæv til analyse af C. chauvoei, eller om det er tilstrækkeligt at bruge vatpinde til prøveindsamling, blev en posttjeneste simuleret. Af de 22 undersøgte muskelvæv var 64% over DETEKTIONSTÆRSKLEN for PCR. For vatpinde fra de samme prøver efter posttjenestesimuleringen var 36% Til 47% vatpinde over detektionstærsklen (tabel 3). Det ville være mere praktisk at tage prøver med vatpinde i stedet for muskelvæv, hvis vatpinde er tilstrækkelige til analyse af C. chauvoei. Imidlertid gav muskelvæv flere positive prøver end vatpinde, når begge blev analyseret ved Kultur og PCR (tabel 3). Forekomsten af C. chauvoei på vatpinde fra de positive muskelvævstilfælde syntes at være tilfældig. Det så imidlertid ud til at gøre ringe eller ingen forskel, om vatpindene blev opbevaret i 1, 3 eller 6 dage.

prøver fra biogasanlæg

Clostridium chauvoei blev påvist i 3 prøver ud af 11 i biogassubstrat før pasteurisering, men det kunne ikke påvises efter pasteurisering eller efter fordøjelse (Tabel 4). Bakterierne i denne type prøver kan stamme fra gødning eller fra animalske biprodukter fra slagteriet, da begge disse kilder anvendes til biogasproduktion. Ingen af de bedrifter, der blev udtaget prøver i denne undersøgelse, sender deres gødning til biogasanlæggene på grund af den geografiske afstand, men dyr sendes til det lokale slagteri. Der er også rapporteret tilfælde af blackleg i biogasanlæggets afvandingsområde.

efter biogasforarbejdning anvendes de fordøjede rester som gødning. Sporeformende bakterier kan overleve pasteurisering og fordøjelse i biogasanlæg, og fordøjede rester fra biogasanlæg kan derfor være i stand til at sprede blackleg til nye områder. Imidlertid, ingen C. chauvoei blev påvist i forarbejdet produkt, så måske er miljøet i digester ikke egnet til C. chauvoei, eller floraen i digester vokser C. chauvoei. Clostridial sporer kan overleve i lange perioder i jord , hvilket skal tages i betragtning i yderligere undersøgelser af C. chauvoei i digester.

prøver fra gårde

på trods af at alle undersøgte bedrifter havde rapporteret om mistanke om tilfælde af sortben i de senere år, testede alle prøver fra fæces, jord og ensilage negativt for C. chauvoei. Der kan være flere forklaringer på dette. Sporer kan stadig være til stede i materialet, men under detektionsniveauet. Desuden kan PCR-hæmmere være til stede i prøverne, og PCR kan hæmmes . Kvægafføring indeholder flygtige fedtsyrer (VFA), og jordprøverne kan indeholde spor af metal, som begge vides at interferere med PCR-reaktionen. Kulturtrinet før PCR reducerer imidlertid indflydelsen af hæmmende stoffer.

Siden C. chauvoei er en jordbakterie nogle sæsonvariationer kan forekomme, for eksempel kan kraftig nedbør bidrage til spredning af sporerne, og mængden af sporer i jorden kan være mere tilgængelig for kvæg. De fleste prøveudtagninger blev udført i det tidlige efterår, når vejret var solrigt, og koncentrationen af sporer i prøverne forventes derfor at være lav. Antallet af prøver kan have været utilstrækkeligt til påvisning af miljøforurening. Af praktiske grunde er der dog sjældent meget stort antal miljøprøver fra marken.

mistænkte tilfælde af sortben på gårdene var primært forekommet hos kalve og kvier, men en gård rapporterede om en sag hos en voksen ko. Syv af de elleve bedrifter A-K havde vaccinationsrutiner på plads på prøveudtagningstidspunktet (tabel 1).

to af gårdene lagrede gødning før spredning, og de andre gjorde det ikke, men ingen af gårdene spredte gødning på græsgange. Lokale dyrlæger har efter sigende set flere tilfælde af blackleg efter buskrydning på øen Prisland, især på Alvaret (en ufrugtbar kalkstenslette, næsten 40 km lang og 10 km bred, med speciel flora afhængigt af den tynde jord og høj pH). Alvaret bruges normalt som græsarealer af nærliggende gårde. Der var ikke gjort meget buskrydning i prøveudtagningsåret.

PCR

kulturelle procedurer er dyre og tidskrævende, og forurening med andre anaerobe bakterier, der vokser ud C. chauvoei forårsager ofte problemer . Ved anvendelse af PCR forstærkes DNA ‘ et af både levedygtige og ikke-levedygtige celler. Hvis kun levedygtige celler skal detekteres, kan der anvendes et berigelsestrin . I denne undersøgelseskultur på FAA-plader før PCR blev brugt til at undgå påvisning af ikke-levedygtige bakterier og falske positive PCR-reaktioner. DNA er let at forstærke fra rene kulturer, men der opstår problemer med forurenede prøver, såsom prøver fra bioaffald. Påvisning af DNA ved PCR kan hæmmes af adskillige stoffer, herunder huminsyrer, VFA, fedtstoffer og proteiner . Kulturtrinet før PCR blev imidlertid anvendt som et berigelsestrin og reducerer derfor indflydelsen af hæmmende stoffer. På grund af den sværmende flora kunne der ikke udføres nogen oprensning fra FAA-pladerne.

Detektionstærskel for PCR-metoden

detektionsniveauet var 200 cfu/g. Dette kan synes at være et dårligt detektionsniveau, men det kan forklares ved, at prøver som gødning, jord og biogassubstrat er stærkt forurenet af den omgivende flora. Sasaki rapporterede et detektionsniveau på 10 cfu/g, tilsyneladende i renere prøver. Da detektionsniveauet i vores undersøgelse imidlertid var 200 cfu/g, og da sådanne prøver forventedes at indeholde et lavt antal C. chauvoei. Den metode, der anvendes i denne undersøgelse, er således ikke praktisk anvendelig.

miljøaspekter

detektionstærsklen for PCR – metoden efter prækultur er næppe på nuværende tidspunkt egnet til at garantere, at dyr er fri for infektion eller til bestemmelse af græsgange. I stedet skal de aktuelt anvendte anbefalinger anvendes, da metoden ikke kan bruges som grundlag for vaccinationsrutiner. I områder, hvor sortben er endemisk, anbefales årlig vaccination før græsning på trods af omkostningerne og den krævede tid.

denne undersøgelse gav en vis indikation af, at C. chauvoei ikke passerer biogasprocessen. Antallet af C. chauvoei i bioaffald faldt måske i fordøjeren til under detektionstærsklen for metoden, og risikoen for spredning af fordøjede rester er således ubetydelig. Flere undersøgelser om clostridial overlevelse gennem biogasprocessen er nødvendige, før der kan drages konkrete konklusioner. Imidlertid opvejer fordelene ved fordøjede rester som gødning måske risikoen for spredning af sortben.