Infektiøs nekrotisk hepatitis forårsaget af Clostridiumnovyi type B i en hest: sagsrapport og gennemgang aflitteratur | Jiotower

infektiøs nekrotisk hepatitis (INH) er forårsaget af Clostridium novyitype B. sygdommen rammer typisk får, hvor den også kaldes”sort sygdom” i betragtning af den mørke misfarvning af det subkutane væv forårsaget afintense venøs trængsel set i slagtekroppe af dyr, der dør af denne sygdom.6 selvom INH også menes at forekomme hos andre arter,herunder kvæg, geder og heste, er der meget begrænset information tilgængelig om denne sygdom hos andre dyr end får.2,3,19,15 på grund af sin strenge anaerobe karakter opnås isolering og identifikation af C. novyi type B sjældent.15 af denne grund er rapporter om INH almindeligvis begrænset til formodendediagnose baseret på histopatologi, fluorescerende antistoftest (fedt) og/orimmunohistokemi (IHC). Typen af C. novyi er sjældentbestemt. Heri præsenterer vi et bekræftet tilfælde af heste Inh forårsaget af C.novyi type B, og også gennemgå litteraturen om sygdommen.

en 14-årig, 511-kg bay kvartal hest vallak blev forelagt San Bernardinobranch af California Animal Health and Food Safety Laboratory System tilpostmortem undersøgelse og diagnostisk oparbejdning. Dyret havde en 3D-historie medprogressive neurologiske tegn, rektal temperatur på 38,8–40,5 liter C og var blevet behandlet uden held med ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler før døden.En fuld obduktion blev udført ~6 timer efter døden.

ved obduktion var hesten i god ernæringstilstand med tilstrækkelig mængde fedtreserver og i moderat tilstand af nedbrydning efter døden. Der var gulfarvning af sclera, subkutant og fedtvæv og artikulærbrusk. Multifokale ekkymotiske-til-suffusive blødninger var til stede i de flestemuskler, serosa i tarmkanalen, mesenteri, milt, pleura og inpapillære muskler i hjertet. Venøst blod var dybt rød-sort. Perikardialsac blev udspilet med en stor mængde serosanguinøs væske, og der var ~5l af en lignende væske indeholdende rigelige fibrinstrenge i bughulen.Leveren blev markant forstørret og havde afrundede kanter; den venstre lap var fast,mørkerød til sort og havde adskillige subkapsulære og dybe parenkymale gasbobler og rigeligt fibrin over kapslen (Fig. 1A). På skåret sektion af denne lap var der et ~15 cm diameter,bleg område omgivet af en tynd hæmoragisk kant (Fig. 1B). Hjernehindenoverliggende hjerne og rygmarv var diffust overbelastet, og der varpetechiale blødninger i hele hjernebarken. Der blev ikke observeret andre signifikante groslesioner i resten af slagtekroppen.

prøver af hjerne -, lunge -, hjerte -, membran -, lever -, milt -, mave -, tarm -, bugspytkirtel -, binyre -, mesenteri -, nyre-og urinblære blev opsamlet og fikseret i 10% bufret formalin (pH 7,2) i 48 timer og blev rutinemæssigt behandlet til produktion af 4 H&e) – farvede sektioner. Lever – og nyresektioner blev også farvet med henholdsvis Gram-og Okajima-pletter.

prøver af lever blev opsamlet aseptisk og udsat for aerob og anaerobisk kultur på 5% får agarplader i 48 timer. PCR blev udført for Vestnilvirus (VNV)på puljede prøver i centralnervesystemet og for ækvivalent herpesvirus 1 (EHV-1) på en næsepind. En tungmetalskærm inklusive bly, mangan, jern,kviksølv, arsen, molybdæn, sinc, kobber og cadmium blev udført på leverprøver.Cerebrospinalvæske blev testet for antistoffer mod Sarcocystisneurona ved anvendelse af et indirekte fedt. Leverudstrygning blev behandlet af FATfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelliog C. novyi ved hjælp af kommercielle konjugater (Vmrd, Pullman, V). Derudover blev formalinfastgjorte, paraffinindlejrede dele af leveren behandlet af en indirekte immunoperoksidaseteknik til C. novyi ved hjælp af et kommercielt kit (RTU VECTASTAINELITE ABC-system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroksidaseaktivitet blev slukket med en 3% brintoverilteopløsning efterfulgt af pepsinbehandling til antigenudtagning. Prøver blev derefter inkuberet med BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) for at blokere uspecifik binding, før incubation med goat anti–C. novyi polyklonalt antistof (vmrd) ved37 liter C i 60 minutter. Vector NovaRED chromogen blev brugt til visualisering (Vektorlaboratorier). Sektioner af lever inkuberet med normalt gedeserum i stedet forprimære antistoffer blev anvendt som negativ kontrol. Lever fra en ko, hvorc. novyi var blevet identificeret ved Kultur, og PCR blev anvendt som en positiv kontrol.

leverprøver blev behandlet til DNA-ekstraktion (Chiaamp DNA FFPE tissue kit, Chiagen,Hilden, Tyskland) efter producentens anvisninger. Det ekstraherede DNA blev brugt som skabelon til en multipleks PCR-analyse til at amplificere segmenter af flagellingener (fliC) af C. septicum, C. novyi type A, C. novyi type B, C. chauvoeiog Clostridium haemolyticum, sombeskrevet tidligere.17 derudover udviklede vi en konventionel PCR til at forstærke et segment af theC. novyi type B alfa toksin(tcna) gen (GenBank tiltrædelse JENV01000127.1), den vigtigste virulensfaktor af dettemikroorganisme. Følgende oligonukleotidsekvenser blev designet: 5 ‘-TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′ (CNtBaF) og 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3’ (CNtBaR),som forstærker et ~342-BP DNA-fragment af målgenet. Konventionel PCR varudført i et samlet volumen på 25 liter indeholdende 5 liter ekstraheret DNA, 0.25 liter af hver primer (10 liter), 7 liter nucleasefrit vand og 12,5 liter PCR-Masterblanding(2 gange, Promega, Madison), indeholdende Tak DNA-polymerase (pH 8,5, 50 E/mL), dNTPs(400 liter) og MgCl2 (3 mM). Termocyclerprofilerne var som følger:94 liter C i 5 minutter, 30 cyklusser på 94 liter C i 1 minut, 55 liter C i 1 minut og 72 liter C i 1,5 minutter efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 72 liter C i 7 minutter. Prøverne blev holdt ved 4 liter Cuntil PCR-reaktionerne blev visualiseret under ultraviolet lys i ethidiumbromid (Amresco, Solon, OH)-farvede 1% agarosegeler (Agarose SFR, Amresco). Dnaekstraheret fra C. novyi type B (ATCC 25758), C. novyi type A, C. septicum, C. chauvoei og C. haemolyticum kulturer blev anvendt som positive kontroller. Vand i stedet for DNA blev brugt i negativ kontrolreaktioner.

mikroskopisk blev leverkapslen dækket af rigeligt fibrin blandet med celldebris, og der var subkapsulære og dybe parenkymale emfysematøse bullae afforskellige størrelser. Det mest slående fund var multifokal til fokalt omfattendekoagulativ nekrose, omgivet af en rand med et stort antal levedygtige ogdegenererede neutrofiler, blødning, fibrin, celleaffald og store aggregater afgram-positive bakteriestænger, hvoraf nogle havde subterminale sporer (Fig. 1C,, D).G). I interventionparenchyma og i den mindre berørte lever var der galdestase, multifokalhemorrhages og segmental-til-diffus fibrinoid nekrose af blodkar, mange afsom også indeholdt fibrintrombi. Det renale tubulære epitel havde mildcytoplasmatisk vakuolering, og protein og granulære afstøbninger var til stede i lumenof nyretubuli. Afstøbningerne farvede positivt med Okajima-plet (Fig. 1E). I hjernen var der diffus overbelastning, multifokal og tilfældigt spredt perivaskulærblødninger og moderat til markant udvidelse af Virchov–Robin-rummet medacidofilt ødem. Det viscerale peritoneum var dækket af rigeligt fibrin blandet med et stort antal levedygtige og degenererede neutrofiler; de fleste peritoneale blodfartøjer var overbelastede og/eller indeholdt fibrintrombi. Nogle få små arterier ogvener i binyrebarken og medulla i binyrerne havde også fibrintrombi. Disse patienter havde vaskulær overbelastning og multifokale parenchymale og kapselblødninger. Lungerne var diffust overbelastede og havde multifokale blødninger og ødem, ud over nogle få blodkar indeholdende fibrintrombi. Der blev set multiplesubendokardiale, subepicardiale og subpleurale blødninger.

det store flertal af intralesionale gram-positive stænger observeret i leveren varpositiv for C. novyi IHC (Fig. 1F). Fedt var positivt for C.novyi, men negativ for de andre testede clostridiale arter. Leverprøver var positive for C. novyi type B fliCand TcnA-gener og negative for fliC-generne af de andre testede clostridia (Fig. 2). Prøver af cerebrospinalvæske var negative for S. neurona immunofluorescerende antistofassay. PCR for VNV og EHV-1 var negativt. Ingen signifikant bakterievækst blev opnået ved aerob eller anaerobkultur. Tungmetalskærmen afslørede en forhøjet koncentration af jern ileverprøver (1.500 ppm; referenceinterval: 100-300 ppm).

vi lavede en formodet diagnose af INH baseret på brutto og mikroskopiske ændringer,kombineret med resultater af fedt og IHC for C. novyi. Diagnosen af INH produceret af C. novyi type B blev bekræftet ved PCR-detektion af fliC-og TcnA-generne af dettemikroorganisme. Så vidt vi ved, er kun 6 tilfælde af mistanke om IHN blevet rapporterettidligere hos heste. Tre tilfælde forekom i Australien,8,9,11 og en hver i USA,23 Skotland,19 og USA (Montana).16 i disse tilfælde var en formodet diagnose baseret på brutto-og mikroskopiske læsioner kombineret med påvisning af C. novyi ved fedt, 9,16,19 IHC,23 og/eller kultur.9,19 typen af C. novyiinvolved blev imidlertid ikke fastlagt i nogen af disse tilfælde.

C. novyi er en gram-positiv, sporeformende, anaerob bacillus,som almindeligvis findes i jord og afføring af dyr.15 det klassificeres i type A, B og C baseret på det producerede interval af toksiner.4C. novyi type A producerer hovedsageligt det dødelige, ødeminducerende alfatoksin (TcnA) og den ikke-dødelige phospholipase, gamma-toksin; denne bakterie er forbundet med gasgangren hos mennesker og dyr, som normalt virker sammen medandre clostridier. C. novyi type B producerer også tcnatil det nekrotiserende og hæmolytiske beta-toksin, selvom førstnævnte betragtes som den vigtigste virulensfaktor for patogenesen af INH. C. novyi type C anses for at være ikke-toksigen ogikke-patogen.13,15 C. haemolyticum var tidligere kendt som C. novyitype D, og det er stadig omtalt af dette navn af nogle forfattere; derfor vidiskutere også denne mikroorganisme her. C. haemolyticum producerer også beta-toksin,men i meget større mængder end C. novyitype B; dette toksin betragtes som den vigtigste virulensfaktor for denne mikroorganisme, og den er ansvarlig for bacillær hæmoglobinuri (BH), en sygdom, der påvirkerhovedsageligt kvæg, der klinisk og patologisk ligner INH.11,10,14

sporerne af C. novyi er meget modstandsdygtige over for miljøforhold, og i betragtning af at sporerne ofte findes i jord, kan græssende dyr indtage dem ofte.6,19 selvom det ikke er fuldt bevist, er den nuværende dogme, at sporerne af C. novyi type B efter indtagelse absorberes fratarmen og nå leveren via portalcirkulationen, hvorefter de erspredt til andre organer. Sporerne fagocytiseres og forbliver latente i Kupfferceller i leveren og i makrofager i milten og knoglemarven.2,6 INH er almindeligt anset for at være modstykke til BH, fordi begge sygdomme antages at forekomme efter leverskade, hvilket forårsager nekrose og de tilknyttede anaerobe tilstande, der er nødvendige for spiring af latente sporer og produktion af toksiner.14 Migration af umodne former for Fasciola hepatica igennemleveren betragtes som den vigtigste prædisponerende faktor for både BH og INHin drøvtyggere, og begge sygdomme er mere almindelige i områder med høj forekomst af fascioliasis.1 INH af drøvtyggere har også været forbundet med Cysticercustenuicollis og andre parasitter, herunder Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum ogthysanosoma actinoides, 2,6,15,21,selvom disse parasitters rolle i patogenesen af sygdommen ikke er påvist.Imidlertid kan enhver leverskade, der fører til dannelse af anaerobe tilstande, være endisponerende faktor for INH. Disse inkluderer, men er ikke begrænset til, leverabscesser, biopsier, fedtforandring, telangiektasi og giftige stoffer. Når TcnA er produceret og frigivet af de vegetative former for C. novyi type B, dets monoglycosyltransferaseaktivitet inaktiverer flere guanosin5 ‘ – triphosphat (GTP)-bindende proteiner i værtsceller, hvilket resulterer ialteration og omfordeling af actincytoskelettet.3 tcna forstyrrer også vimentin-og tubulinsystemet.7,18 disse ændringer ser ud til at være mere dramatiske i kapillært endotel, hvilket fører til den udbredte væskeekstravasation set i INH15 og sandsynligvis den multisystemiske trombose observeret i hesten i vores rapport. Hos får gør sygdommens meget akutte karakter detekteringen afkliniske tegn vanskelige, med dyr, der normalt findes døde. I tilfælde hvor tegnobserveres, de er uspecifikke og omfatter svaghed, sløvhed, anoreksi,hypertermi, tachypnea, hyperpnea og endelig recumbency. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at foretage en undersøgelse for at sikre, at patienten er i stand til at kontrollere, om han eller hun er i stand til at kontrollere,om han eller hun er i stand til at kontrollere, om han eller hun er i stand til at kontrollere, om han eller hun er i stand til at behandle sygdommen.15,19

da kun 6 tilfælde af formodet INH tidligere er beskrevet hos heste,er tilgængelige epidemiologiske, kliniske og patologiske oplysninger ringe. På baggrund af dette begrænsede antal tilfælde er der ingen åbenbar køns-eller racefordeling i tilfælde af heste INH, og både unge og voksne dyr kan blive påvirket. Det kliniske forløb er normalt længere hos heste end hos drøvtyggere, der varer 12-72 timer,og resultatet har altid været dødeligt. Kliniske tegn varierer fra mild til svær depression og modvilje mod at bevæge sig, neurologiske tegn, herunder ataksi og headtilt, hyperæmiske og/eller icteric slimhinder og okulær sclera,mavesmerter og recumbency.20,23 i et tilfælde, hvor abdominocentese blev udført, en forøget mængde uklar væske med forhøjet proteinkoncentration ogspecifik tyngdekraft blev opnået.9

Klinikopatologiske profiler af heste med INH er meget variable, og de kan repræsentere forskellige stadier af toksæmi og leverskade. Disse ændringer kan omfatte neutrofili med venstre skift, forhøjet leveraktivitet, trombocytopeni, hyperfibrinogenæmi, hyperbilirubinæmi og faldetkoncentration af elektrolytter.9,16,19 derudover er der rapporteret om øgetaktiveret partiel tromboplastin, protrombin og thrombintider.23 disse ændringer i kombination med den observerede kapillære mikrothrombi er antagelig for dissemineret intravaskulær koagulation, en proces, der sandsynligvis vil forekommei løbet af toksæmi og hæmolyse hos store dyr.22,23 Det resulterende forbrug af koagulationsfaktorer, deres nedsatte syntese på grund afhepatisk svigt og den synergistiske virkning af TcnA på vaskulært endotel er repræsentativt ansvarlig for de udbredte blødninger observeret i tilfælde afinh.

selvom icterus ikke er beskrevet hos drøvtyggere, kan heste undertiden udvise dette tegn forbundet med INH.19,23 Icterus synes at være relateret til sværhedsgraden afhepatisk skade og til en vis grad til hæmolyse, som i vores tilfælde, hvorhæmoglobin blev visualiseret i nyretubuli ved Okajima plet. Hesten i voresundersøgelse havde moderat øget jernkoncentration i leveren, hvilket tyder på ahemolytisk proces.5 Dette niveau af jern i leveren er imidlertid et almindeligt fund hos heste, der dør af forskellige årsager, og det betragtes ofte som et tilfældigt fund, der er forbundet med overbelastning og autolyse efter døden (forfatteres upublicerede overvågning).

selvom det kan antages, at heste er mere modtagelige end andre artertil virkningen af det hæmolytiske beta-toksin produceret af C. novyitype B, er hæmoglobinuriske ændringer ikke blevet beskrevet i formodede tilfælde afinh.16,23 sammenlignet med C. haemolyticum producerer C. novyi type B lavere niveauer af beta-toksin;15 derfor antages dets bidrag til patogenesen af INH at beminor, hvilket forårsager en vis grad af hæmolyse hos heste, men ikke nok til at inducere betydelige hæmoglobinuri-associerede ændringer. Derudover udelukkede ingen af de foregående tilfælde C. haemolyticums rolle som sygdomsfremkaldende middel, så der kan ikke drages endelige konklusioner fra disse tilfælde. C. haemolyticum er blevet impliceret i et tilfælde af septisk peritonitis ina hoppe ved identifikation med MALDI-TOF; imidlertid blev PCR-eller toksinidentifikation ikke forsøgt i det pågældende tilfælde.11

den prædisponerende faktor for INH hos heste er ikke altid blevet bestemt, selv om hepatiske migrationer af F. hepatica og beslægtede trematoder, såvel som medlemmer af Strongylidae-familien, er blevet foreslået.9,12,19 derudover er anthelminthisk behandling forud for sæt af kliniske tegn blevet foreslået som en potentiel udløser afsygdom,9,16,23 formodentlig ved at forårsage en vis grad af hepatisk nekroseassocieret med ødelæggelsen af migrerende parasitter. Imidlertid er der ingen videnskabeligbevis til rådighed for at understøtte denne hypotese. Desværre ingen kendtprædisponerende faktorer blev bestemt i vores tilfælde.

som i vores tilfælde beskrev de fleste tidligere rapporter et enkelt (flere i et tilfælde19) fokus på nekrose, der påvirker leveren, konsekvent placeret i venstreben. Dette står i kontrast til Inh af får, hvor tilfældigt fordelt, lillenekrotiske foci er mere almindelige.6,15 årsagen til dettevariation i distribution er ukendt. Det er muligt, at overvejelsen aflæsioner på venstre lobe er relateret til såkaldt portalstrømning, hvilket eransvarlig for differentiel strøm af portalblod til bestemte lobes afleveren. Fordi C. novyi formodentlig absorberes fra den lilletarm, og blodet fra dette organ følger portalstrømning til leftlobe, kan dette resultere i, at denne lobe overvejende påvirkes.6 fraværet af ændringer i forbindelse med hepatisk encefalopati (f. eks.6 kan tyde på, at neurologiske tegn i dette og tidligere tilfælde varkonsekvens af blødninger, overbelastning og perivaskulært ødem noteret i hjernen,relateret til toksæmi og virkningen af TcnA på kapillærendotelet.

INH bør være på listen over differentielle diagnoser af heste med neurologiskekliniske tegn, toksæmi, akut leversvigt og peritonitis. Selv tankebehandling med høje doser penicillin og tetracycliner kan være effektiv modc. novyi resulterer den avancerede produktion af toksineri en dårlig prognose.19 i områder, hvor sygdommen klart er forbundet med leverflukes og/eller andre parasitter, kan man som forebyggende foranstaltninger forsøge at reducere den parasitære byrde og begrænse dyrenes adgang til dårligt drænet græsgange.15

da flere clostridiale sygdomme antages at være forbundet med accelereretnedbrydning efter døden, er en vigtig overvejelse for den korrekte diagnose afinh behovet for hurtig evaluering og bevarelse af væv efter dødenaf dyret.6,23 klinisk historie, rutinemæssig obduktion,histopatologi og immunfarvning af C. novyi i leverlæsioner er afgørende for at give en formodet diagnose af INH. Fordi isolering ikke altid ersuccesfuld, i betragtning af mikroorganismens strenge anaerobe krav,molekylær identifikation ved PCR er et værdifuldt redskab til at tilvejebringe en etiologiskdiagnose og at differentiere C. novyi type B fra andreklostridiale patogener.