Arabidopsis cmt3-krommethylase-mutationer blokerer ikke-CG-methylering og lyddæmpning af et endogent gen | Jiotower
resultater og diskussion
for at identificere faktorer, der styrer methylering og lyddæmpning af vs-PAI-generne, isolerede vi en mutant variant af vs, pai1C251Y, hvor lyddæmpning af det methylerede singlet-PAI2-gen kan visualiseres ved intensiteten af en blå fluorescerende plantefænotype under ultra-CG-genet, og violet (UV) lys (bartee og Bender 2001). I pai1c251y-stammen er de eneste potentielle kilder til PAI-aktivitet PAI1-genet, som er lammet af en missense-mutation, og PAI2-genet, der er tavs. På grund af denne Pai-mangel akkumulerer stammen fluorescerende tryptophan-mellemprodukter samt visning af gulgrøn bladpigmentering, reduceret størrelse, øget bushiness og reduceret fertilitet. Imidlertid vil mutationer på andet sted, der lindrer PAI2-lyddæmpning, undertrykke de pai-mangelfulde fænotyper (Bartee and Bender 2001). Således mutageniserede vi pai1c251y-stammen og screenede for kimplanter med undertrykte svage fluorescerende fænotyper. Som en sekundær skærm, Vi testede PAI-methylering ved Southern blot-analyse med methyleringsfølsomme begrænsningssymboler. Specifikt analyserede vi methylering med isoschisomerer HpaII og MspI, som genkender sekvensen 5′-CCGG-3′. HpaII er følsom over for methylering af både de indre (CG) og de ydre (CNG) cytosiner, mens MspI kun er følsom over for methylering af de ydre cytosiner. Bender og Fink 1995; Luff et al. 1999; Jørgen et al. 1999).
fra denne screeningsstrategi isolerede vi 11 tab af funktion alleler i CMT3-genet (se nedenfor og materialer og metoder). Cmt3-mutanterne i pai1c251y-baggrunden viste stærkt reduceret fluorescens i den tidlige frøplanteudvikling og delvist reduceret fluorescens i voksne planter med øget størrelse, nedsat bushiness og øget fertilitet (Fig. (Fig.1).1). Disse mellemliggende fluorescerende cmt3-isolater vendte ikke tilbage til nonfluorescens, hvilket er diagnostisk for tab af resterende PAI2-methylering (Bender og Fink 1995) med en detekterbar frekvens. De viste delvist øget spaltning med HpaII og stærkt forøget spaltning med MspI for PAI-generne i forhold til forældrenes pai1C251Y (Fig. (Fig.2A).2A). Spaltningsmønsteret antydede, at cmt3-mutanterne var mest påvirket ved vedligeholdelse af CNG-methylering af PAI-generne. For at bestemme, om cmt3-mutanterne også påvirkede methylering af en stærkt gentaget genomisk sekvens, reprobed vi HpaII/MspI Southern blot med en sonde til 180-bp centromere-associeret gentagelse (CEN) sekvenser (Vogs et al. 1993). Denne sonde afslørede ringe effekt på HpaII-spaltning, men øgede mspi-spaltning i overensstemmelse med det mønster, der blev observeret for PAI-generne (Fig. (Fig.2B).2B). Et lignende mønster af øget mspi-spaltning blev også observeret ved det gentagne rDNA (data ikke vist). Alle testede 11 cmt3 alleler havde identiske methyleringsmønstre i disse analyser. Når cmt3-allelerne blev adskilt væk fra pai1C251Y-allelen i en vildtype vs-baggrund, viste de også identiske methyleringsmønstre i disse analyser (Fig. (Fig.2).2). PAI-og CEN-methyleringsmønstrene var forskellige fra mønstrene induceret af de karakteriserede ddm1-og met1-methyleringsmangelmutationer (Fig. (Fig.2; 2; Bartee og Bender 2001).
Pai1c251y cmt3 plantefænotyper. (A) to uger gamle kimplanter af de angivne genotyper dyrket på agarmedium er vist under synligt (øverst) og UV (nederst) lys. (B) fire uger gamle voksne planter af de angivne genotyper dyrket i jord er vist under synligt (øverst) og UV (nederst) lys. (C) repræsentative 2 uger gamle T2 generation transgene kimplanter af de angivne genotyper dyrket på agar medium er vist under synligt (top) og UV (bund) lys. Fænotyperne af den viste cmt3G456D-allel er repræsentative for fænotyperne observeret med 10 andre cmt3-alleler.
cmt3-mutationer giver reduceret Pai og CEN-methylering. (A) genomiske DNA ‘ er fremstillet af 4 uger gamle planter af de angivne genotyper blev spaltet med enten HpaII (H) eller MspI (M) og anvendt til Southern blot-analyse med en PAI-probe (Bender og Fink 1995). (P1-P4) PAI1–PAI4; (P2) PAI2; (P3) PAI3; (P1) Columbia (Col) stamme PAI1; stjerner angiver placeringen af arter methyleret på interne HpaII/MspI-steder (Bender og Fink 1995; Luff et al. 1999). Col-stammen er inkluderet som kontrol for positionerne for umethylerede PAI2-og PAI3-arter. (B) blot vist i A blev irettesat med en 180-bp CEN gentagelsessonde. Fænotyperne af den viste cmt3G456D-allel er repræsentative for fænotyperne observeret med 10 andre cmt3-alleler.
for mere præcist at bestemme methyleringsmønstre i cmt3-mutantbaggrunden udførte vi genomisk sekventering af methyleringsmønstre i pai1-og PAI2-promotorregionerne i en repræsentativ cmt3-allel ved anvendelse af natriumbisulfitmutagenese (Frommer et al. 1992). Denne analyse viste, at størstedelen af methylerede cytosiner (87% i PAI1 og 70% i PAI2) forekom ved CG-rester (Fig. (Fig.3; 3; Tabel Tabel1).1). Sammenlignet med vildtype vs PAI1 promotor (Luff et al. 1999; tabel Table1), 1), CG-methylering blev reduceret 34%, CNG-methylering blev elimineret, og asymmetrisk methylering blev reduceret 93%; i PAI2-promotoren blev CG-methylering reduceret 8%, CNG-methylering blev reduceret 92%, og ikke-CG-methylering blev reduceret 75%. Således har tab af CMT3-funktion en stærk effekt på vedligeholdelse af CNG og asymmetrisk methylering og en svagere effekt på vedligeholdelse af CG-methylering. Disse resultater er i overensstemmelse med rapporter om, at Arabidopsis CMT3 og majsmet2 er vigtige for vedligeholdelse af CNG-methylering på forskellige genomiske steder (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), men de viser endvidere, at CMT3 også er vigtig for vedligeholdelse af asymmetrisk methylering for PAI-generne. Dette resultat indebærer enten, at CMT3 direkte styrer både symmetrisk og asymmetrisk methylering, eller at reduktionen i symmetrisk methylering i cmt3-mutantbaggrunden forårsager reduceret asymmetrisk methylering som en sekundær konsekvens. Fordi de methylerede sekvenser i promotoren og den første ekson af PAI2-reportergenet (Kurt 370 bp) kun indeholder 16 dispergerede CG-motiver, hypomethylerer tab af ikke-CG-methylering signifikant denne region af genet (Fig. (Fig.3), 3), der tegner sig for forbedret PAI2-ekspression i suppressormutanten.
sekventering af Pai-promotormethylering i cmt3-mutanten. Bisulfitgenomisk methyleringssekventering blev udført som beskrevet (Jeddeloh et al. 1998; Luff et al. 1999) for de øverste dele af pai1-og PAI2-initiativtagerne i Pai1c251y cmt3G456D DNA. For hver region blev otte uafhængige molekyler sekventeret. Lodrette linjer angiver positioner af cytosiner, hvor højden på hver linje repræsenterer, hvor mange sekventerede molekyler der havde 5-methyl-cytosin. (Sort) CG-cytosiner; (blå) CNG-cytosiner; (rød) andre cytosiner. Stjerner angiver steder uden methylering. Den sorte vandrette linje angiver regionen med PAI-identitet, og den grå vandrette linje indikerer flankerende opstrøms heterolog sekvens unik for hvert gen. Ekson-og intronstrukturerne for PAI1 og PAI2 er vist som henholdsvis åbne kasser og stiplede linjer under hver sekvens. Disse strukturer er baseret på cDNA-sekvenser i fuld længde for hvert gen. 1999).
tabel 1
virkninger af en cmt3-mutation på mønstre af PAI-promotor cytosinmethylationa
| stamme | PAI-gen | CG | CNG | andet C | i alt C |
|---|---|---|---|---|---|
| vs | PAI1 | 115 (100%) | 61 (100%) | 149 (100%) | 325 (100%) |
| cmt3b | PAI1 | 76 (66%) | 0 (0%) | 11 (7%) | 87 (27%) |
| vs | PAI2 | 122 (100%) | 53 (100%) | 184 (100%) | 359 (100%) |
| cmt3 | PAI2 | 112 (92%) | 4 (8%) | 45 (25%) | 161 (45%) |
cmt3 mutant locus i pai1C251Y cmt3 suppressorisolater blev kortlagt af kryds med den polymorfe stamme Nd-0, som har et lignende arrangement af tæt methylerede PAI-gener som fundet i VS. 1999). F2-afkom med svagt fluorescerende fænotyper diagnostisk for homosygositet for både pai1C251Y og cmt3 blev identificeret ved visuel inspektion under UV-lys og bekræftet af Mspi Southern blot for stærk PAI-spaltning svarende til den, der blev observeret i forældresuppressorisolaterne. En kortlægningspopulation af F2-planter, der opfyldte disse kriterier, blev derefter brugt til at score for genomiske loci knyttet til den undertrykte fænotype. Kortlægningsanalysen afslørede kobling til et enkelt locus på underarmen af kromosom 1. Fordi CMT3 formodede cytosinmethyltransferase gen kort til dette locus, fokuserede vi på dette gen som kandidat. Inden for hver kortlægningspopulation fandt vi fuldstændig binding til en polymorf markør, der ligger inden for 100 kb af CMT3-genet. For at bekræfte, at CMT3-genet faktisk var stedet for methyleringsundertrykkende mutationer, klonede og sekventerede vi genet fra de 11 mutante isolater. Sekventering afslørede en enkelt baseændring i CMT3-kodningssekvensen i hvert isolat. Tre af de mutante alleler påvirkede absolut konserverede aminosyrer i det methyltransferase-katalytiske domæne, inklusive den repræsentative cmt3G456D-allel anvendt til bisulfitsekventering. En anden allel blev forudsagt for tidligt at afslutte proteinet. To alleler skabte splice junction mutationer. De resterende fem alleler påvirkede aminosyrer mellem methyltransferase motiv IV og C-terminalen af proteinet, der er stærkt konserveret blandt CMT-generne (Fig. (Fig.4).4).
positioner af mutationer i CMT3. De forudsagte aminosyresekvenser af CMT3, CMT2 og majsmet2 er vist justeret langs deres konserverede C-terminale regioner. N termini, opstrøms for backslash i begyndelsen af hver sekvens, er ikke relateret. CMT3-introner er angivet med Inverterede trekanter over sekvensen. CMT3 missense mutationer er angivet over de berørte rester. Stopmutationen er angivet med en stjerne, og splice donor og acceptor site mutationer er angivet med en H til henholdsvis venstre eller højre over de berørte introner. Rester, der er identiske mellem proteiner, fremhæves med fed skrift. Konserverede sekvensmotiver er angivet under justeringen. Genbanktiltrædelsesnr. er: AF383170 for CMT3 og af383171 for CMT2.
for yderligere at bekræfte, at CMT3-genet var det mutante locus, transformerede vi pai1c251y cmt3-isolaterne med en vildtype-genomisk klon af CMT3-genet. Transformerende frøplanter var stærkt fluorescerende på samme måde som dem fra pai1c251y-stammen (Fig. (Fig.1).1). Transformantlinjer analyseret ved Southern blot-analyse i T2-generationen viste remethylering af PAI2-genet til de niveauer, der blev observeret i den oprindelige pai1c251y-stamme (data ikke vist). Således kunne det klonede CMT3-gen supplere de mutante methyleringsdefekter. Som kontrol blev den repræsentative pai1c251y cmt3G456D-mutant også transformeret med en vildtype-genomisk klon af CMT2-genet. CMT2-transformerende frøplanter var svagt fluorescerende på samme måde som for den ikke-transformerede forældrestamme (Fig. (Fig.1), 1), og viste ikke detekterbar remethylering af PAI2. Denne analyse viser, at CMT2 ikke kan erstatte CMT3-funktionen. I denne henseende er det interessant at bemærke, at CMT2 adskiller sig fra CMT3 primært i sin N-terminale sekvens (Fig. (Fig.44).
tidligere karakteriserede methyleringsmangel Arabidopsis-stammer med defekter i enten det SVI2/SNF2-kromatinomdannelsesfaktorrelaterede gen ddm1 (Jeddeloh et al. 1999) eller det Dnmt1-relaterede MET1-cytosinmethyltransferase-gen viser progressive udviklingsmæssige abnormiteter (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Vores foreløbige analyse af seks generation-indavlet pai1C251Y cmt3 og to generation-indavlet cmt3 stammer afslørede ingen åbenbar adskillelse af morfologiske ændringer. Denne forskel mellem cmt3 og andre methyleringsmangelmutanter afspejler sandsynligvis det faktum, at CG-methylering bevares i højere grad i cmt3 end i ddm1 eller met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee og Bender 2001). Fordi mange af de endogene methylerede steder i Arabidopsis-genomet, såsom CEN-gentagelserne (Fig. (Fig.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), og promotoren af homeo-domænegenet (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), bære primært CG-methylering, cmt3-mutationer forventes ikke at påvirke disse loci stærkt. I stedet fungerer CMT3 sandsynligvis som en forstærkende metylase, der tilføjer et ekstra lag methylering til bestemte genomiske regioner, såsom PAI-generne, hvor den øgede methyleringstæthed fører til øget lyddæmpning. En specifik model er, at det basale lag af CG-methylering leveret af andre funktioner såsom MET1 kunne tjene som en guide til CMT3, som derefter ville dekorere basallaget med ekstra CG og ikke-CG-methylering. CMT3-rekruttering til målrettede regioner kan involvere kromatinproteininteraktioner med chromodomain-motivet (Henikoff og Comai 1998) sammen med interaktioner medieret af de unikke N-terminale sekvenser.
fordi svampe såsom Neurospora crassa og Ascobolus immersus kan opretholde ikke-CG-methylering (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), kan disse organismer kode CMT-gener. Omvendt, fordi dyr som mennesker og mus mangler ikke-CG-methylering, forudsiges disse organismer at mangle CMT-gener, som det er tilfældet fra analyser af aktuelle sekvensdatabaser. Den tilsyneladende mangel på CMT-lignende methylaser i dyregenomer (Finnegan og Kovac 2000) antyder, at dyr har udviklet alternative mekanismer til forstærkning af kromatintilstande.
