raffinering af phylum Chlorobi ved at løse fylogeni og metabolisk potentiale hos repræsentanten for en dybt forgrenet, ukultiveret afstamning

genomisk rekonstruktion af NICIL-2

mikrobiel samfundssammensætningsanalyse af termofile bakteriekonsortier tilpasset til at vokse på biomassesubstrater (cellulose, kylan og koblingsgræs) som deres eneste kulstofkilde ved 60 liter C identificerede konsekvent en allestedsnærværende OTU97, der var fjernt relateret til kultiverede medlemmer af phylum Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Metagenomisk sekventering af et konsortium tilpasset til at vokse på ionisk-flydende forbehandlet koblingsgræs, hvor den Chlorobi-relaterede OTU97 var rigelig, blev udført for at forstå fylogeni og metabolisk potentiale i befolkningen, der var repræsenteret af denne OTU97. Samling (Se materialer og metoder) og automatisk binning (vu et al., 2014) af metagenomet i dette konsortium gav 20 genomiske skraldespande (supplerende tabel S3), blandt hvilke de mest rigelige skraldespande var en population tæt beslægtet med chitinophagaceae stamme NYFB (61,8%), som blev isoleret fra en beslægtet berigelse dyrket på cellulose (Eichorst et al., 2013), og den Chlorobi-relaterede bin (23,1%). Siloer til stede ved >1% omfattede flere ukulturerede populationer, der var grupperet med Paenibacillaceae (siloer 003 og 006), en ukultiveret populationsklynge med Verrucomicrobia underafdeling 3 (bin 004) og en population, Der var nært beslægtet med Thermobipora bispora (bin 005), en actinobakteriel termofil.

Den Chlorobi-relaterede bin blev navngivet NICIL – 2 (For Nyby Island Compost Ionic væske-2.i overflod). Analyse af proteinerne forudsagt fra NICIL – 2-genomet var i overensstemmelse med dets identifikation som en population, Der var fjernt beslægtet med medlemmer af FCB superphylum, hvor Bacteroidetes (33%) og Ignavibacteria (15,7%) havde de mest nært beslægtede proteinsekvenser (Figur 1). Det genvundne NICIL – 2-trækgenom var relativt lille (2,67 Mbps) og næsten komplet (95,3%; 102 ud af 107 enkeltkopi markørgener i 152 stilladser). N50 længde for NICIL – 2 Udkast genom var 168 929 bp og den største contig var 1.1 MB, hvilket tyder på, at de fleste stilladser repræsenterede en samling af høj kvalitet (tabel 1).

fordelingen af den bedst matchede afstamning for alle NICIL-2 proteiner. Procenter estimeres ved at dividere proteintællinger, der matchede hver slægt mod antallet af alle NICIL-2-proteiner. Se materialer og metoder for detaljer.

fylogenetisk analyse af NICIL-2

et 16S rRNA-gen (1451 bp) blev genvundet fra NICIL-2-trækgenomet. Ribotypen, der er mest beslægtet med 16S rRNA-genet af NICIL-2 (>99% identisk), blev sekventeret fra en fosmid-klon (JFF029_06), der blev genvundet fra en termisk strøm (70 liter C) i en japansk guldminesekvens (Nunoura et al., 2005). 16S rRNA-gener fra dyrkede repræsentanter for Bacteroidetes og Chlorobi var <85% identiske med NICIL-2-sekvensen. Et fylogenetisk træ konstrueret ved at justere 16S rRNA-gensekvenser relateret til NICIL-2 viste, at slægten indeholdende NICIL-2 var forskellig fra Bacteroidetes og Chlorobi (figur 2). NICIL – 2-slægten indeholdt to nedstigningslinjer baseret på temperaturen i prøvetagningsmiljøet. Klyngen ved høj temperatur (afbildet i rødt i figur 2) omfattede ribotyper, der primært blev genvundet fra miljøer med høj temperatur, der spænder fra 55 liter C til 80 liter C, såsom klonen OPB56., 1998). Den anden klynge omfattede ribotyper, der primært blev genvundet fra miljøer med moderat temperatur, der spænder fra 20 liter C til 32 liter C (afbildet i grønt i figur 2). Da OPB56 var den første opdagede klon, der er tilknyttet denne fylogenetiske klynge, kaldes slægten indeholdende NICIL-2 som OPB56-kladen. Et udvidet billede af 16S rRNA gentræ er afbildet i supplerende figur S1.

det maksimale sandsynlighed fylogenetiske træ bygget til den nye afstamning NICIL-2 ved hjælp af 16S ribosomalt RNA-gen. Kladen tættest på art NICIL-2 var fra en fosmid isoleret fra en japansk guldmine (Nunoura et al., 2005). Arter temperaturområder blev bestemt ud fra litteraturen forbundet med hvert NCBI-tiltrædelsesnummer. Indbyggertemperaturen for arter blev markeret med rød (>55 liter C), grøn (20-32 liter C) eller sort (ubestemt). Skala bar angiver 0,05 ændringer pr nukleotid site. Detaljer for træ bygning findes i materialer og metoder. Det udvidede fylogenetiske træ, der viser alle noder, findes i supplerende figur S1. En fuld farve version af dette tal er tilgængelig på ISME Journal online.

for at etablere den fylogenetiske tilknytning af NICIL-2 og OPB56-kladen mere fuldstændigt blev yderligere ribosomale proteinsekvenser opnået fra data genvundet fra naturlige prøver. Homologer af 22 konserverede ribosomale gener i NICIL-2 blev fundet i to japanske termiske fjederfosmidkloner (JFF029_C06 og JFF027_B02). Dette sæt af 22 ribosomale proteiner blev brugt til at søge metagenomiske datasæt fra miljøer med høj temperatur. Komplette sæt af disse konserverede ribosomale gener blev identificeret i fire metagenomiske datasæt opnået fra miljøer med høj temperatur. Automatiseret binning af disse datasæt gendannede seks næsten komplette (>90% komplette) udkast til genomer, der indeholdt sekvenser for de konserverede 22 ribosomale proteiner i NICIL-2-genomet og den japanske guldmine fosmid-kloner (supplerende tabel S4). Fem af de seks sammenkædede proteinsekvenser grupperet med i OPB56 afstamning med NICIL-2, mens en af sekvenser fra Gulsten fe falder grupperet med Ignavibakterier (figur 3a). Dette fylogenetiske træ viste, at Chlorobea, Ignavibacteria og OPB56 dannede en monofyletisk klade med høj tillid (97%). Bacteroidetes dannede en særskilt klynge, og familien Rhodothermaceae, hvis tilknytning til Bacteroidetes er blevet stillet spørgsmålstegn ved (Nolan et al., 2009), var tilknyttet Bacteroidetes med høj tillid (>80%). Et andet fylogenetisk træ blev konstrueret ved at sammenkæde en justering af 86 enkeltkopi gener delt mellem Bacteroidetes, Chlorobi og Fibrobacter (figur 3b). Dette træ reproducerede topologien observeret for genet Bygget fra de 22 ribosomale gener, hvilket yderligere understøtter tilknytningen af Chlorobea, Ignavibacteria og OPB56.

den maksimale sandsynlighed fylogenetisk træ bygget til den nye afstamning NICIL-2 ved hjælp af (a) 22 ribosomale proteiner og (b) 86 single-copy proteiner delt blandt Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 og Fibrobacter klynger. Skala bar angiver 0,1 ændringer pr aminosyre site. Detaljer for træ bygning findes i materialer og metoder.

en komplementær tilgang til forståelse af evolutionære forhold mellem Bakteriodeter og Chlorobi har været at identificere indels i konserverede proteiner (Gupta og Lorensini, 2007). Indsættelser i DNA-polymerase III (28 aa) og alanyl-tRNA-syntetase (12-14 aa), der er konserveret blandt GSB og fraværende blandt Bakteriodeterne, blev tilskrevet som karakteristisk for phylum Chlorobi. Justeringer af disse to proteiner (supplerende figurer S2 og S3) indikerer, at DNA-polymerase III-indsættelsen i GSB-proteinsekvenserne ikke er til stede i de forudsagte proteiner fra Ignavibacteriae-og NICIL-2-genomerne, mens 2-3 aminosyrer af indsættelsen i GSB alanyl-tRNA-syntetasesekvenserne bevares i Ignavibacteria-og NICIL-2-proteinsekvenserne.

metabolisk rekonstruktion af NICIL-2

nicil-2 ‘ s fysiologi blev udledt ved metabolisk rekonstruktion og dets metaboliske potentiale sammenlignet med repræsentanter for GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus og Salinbacter ruber) og Ignavibacteria (Ignavibacterium album og Meliobacter roseus). Gener, der koder for fotosynteserelaterede proteiner, herunder homologer af C. tepidums fotosyntetiske reaktionscenterunderenheder (CT1020, PSCB, psC, pscD), chlorosomhylsterproteiner (csmabcdefhijks) og bakteriochlorophyll a-proteiner (fmoA) er fraværende i alle de andre genomer og skelner mellem GSB i dette sammenlignende sæt (Eisen et al., 2002). En visuel oversigt over den metaboliske rekonstruktion er vist i figur 4. For fuld geninformation, rubriknumre og forkortelser, se supplerende tabeller S5 og S6.

rekonstrueret metabolisme af NICIL – 2 udledt fra det genmonterede genom. For fuld geninformation, rubriknumre og forkortelser, se supplerende tabeller S5 og S6. Rød tekst repræsenterer ensymer eller biosyntetiske veje, der mangler fra genomet. Blå, grønne og lilla pile angiver henholdsvis ATP, NADH og NADPH.

kulstofmetabolisme

NICIL-2-genomet koder for et komplet sæt gener til glykolyse, TCA-cyklussen og glukoneogenese (figur 4). Gener til rTCA-cyklussen, som er til stede og udtrykt til autotrofisk carbonfiksering i GSB, er fraværende. Desuden antyder tilstedeværelsen af gener, der koder for liposyreholdige cofaktorer i pyruvatdehydrogenase-og Kurt-ketoglutaratdehydrogenasekomplekserne, at TCA-cyklussen fungerer i den oksidative retning. Det meste af RTCA-cyklussen er blevet rekonstrueret i R. marinus og I. en af de mest almindelige årsager til denne sygdom er, at det er svært at finde ud af, hvad der er nødvendigt. I. album og R. marinus genomer mangler ATP-afhængig citrat lyase, et kritisk udtryk for at fuldføre RTCA-cyklus (Buchanan og Arnon, 1990). Det er blevet foreslået, at I. album kan bruge en ATP-uafhængig citratlyase til at fungere i rTCA-cyklussen i stedet, skønt denne påstand ikke er testet eksperimentelt, og hverken I. album eller R. marinus har vist sig at vokse autotrofisk (Liu et al., 2012a).

på trods af sin høje relative overflod i tilpassede kulturer, der voksede på plantebiomasse, havde NICIL-2 en overraskende begrænset kapacitet til at dekonstruere kompleks biomasse. Sammenligningen af det metaboliske potentiale for polysaccharidhydrolyse blandt de 20 beholdere ekstraheret fra metagenomet fra forbehandlet-koblingsgrass berigelse viste, at NICIL-2 har relativt færre gener til cellulose og hemicellulose dekonstruktion sammenlignet med andre medlemmer af det mikrobielle samfund (supplerende figur S4). Især stamme NYFB, den verrucomikrobielle population og flere Gram-positive Firmicutes har mere omfattende repertoirer af gener til polysaccharidhydrolyse. Yderligere inspektion af de rekonstruerede OPB56-tilknyttede genomer fra naturlige prøver ved høj temperatur viste, at manglen på gener til polysaccharidhydrolyse var fælles for denne klade. Blandt genomerne, der klynger sig med Bacteroidetes og Chlorobi, R. marinus, M. roseus og Gulsten Obsidian Pool Bin 062, som klynger sig med Ignavibakterierne, havde et omfattende repertoire af glycosidhydrolaser for at dekonstruere plantebiomasse. Disse analyser tyder på, at NICIL-2 og beslægtede medlemmer af OPB56 clade sandsynligvis ikke er involveret i den primære dekonstruktion af biomasse i det tilpassede samfund og naturlige miljøer. Det kan tænkes, at NICIL-2 kan vokse på sukkermonomerer eller oligomerer; imidlertid blev kun et forudsagt disaccharidtransportørgen identificeret i genomet.

selvom udvælgelsen for NICIL-2 fandt sted under aerobe forhold, kan den have kapacitet til gæring. Gener til fermentativ produktion af ethanol er til stede (via alkoholdehydrogenase, EC 1.1.1.1), mens gener for formiat (via pyruvatformiatlyase, EC 2.3.1.54), lactat (via lactatdehydrogenase, EC 1.1.1.27) og propionat (via methylmalonyl-CoA-transferase, 2.1.3.1) er fraværende. NICIL – 2-genomet koder for et gen for phosphotransacetylase (EC 2.3.1.8), men ikke acetatkinase (EC 2.7.2.1), som begge er nødvendige for fermentativ acetatproduktion. Både I. album og M. roseus indeholder gener til produktion af lactat og acetat, mens C. tepidum ikke gør det.

Nitrogen-og svovlmetabolisme

gener til ammoniumassimilering, glutaminsyntase (EC 6.3.1.2) og glutamatsyntase (EC 1.4.1.13) blev påvist i NICIL-2-genomet. Imidlertid blev der ikke identificeret nogen gener til uensartet nitratreduktion, assimilatorisk nitratreduktion, denitrifikation, nitrogenfiksering og nitrifikation. C. tepidum koder for nif-gener, der kræves til N2-fiksering, mens M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012a) og R. marinus (Nolan et al., 2009) gør det ikke. C. tepidum er en obligatorisk svovl iltningsmiddel og kan derfor ilte sulfid, thiosulfat, sulfit og elementært svovl. C. tepidum ilter fortrinsvis sulfid til elementært svovl, derefter elementært svovl og thiosulfat til sulfat (Chan et al., 2008). Derudover kan sulfit iltes, når det leveres i vækstmediet, men det kan ikke opretholde C. tepidum som den eneste elektrondonor., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus og R. marinus mangler alle gener, der kræves til iltning af reducerede svovlforbindelser.

aminosyre biosyntese

NICIL-2 genomet mangler mange nøglegener til biosyntese af aminosyrer. Komplette veje er kodet for alanin, arginin, asparagin, aspartat, Kurt-alanin, glutamat, glycin, lysin og methionin. NICIL – 2 mangler ilvC og leuABCD og har derfor ufuldstændige veje for valin, leucin og isoleucin biosyntese. Tilsvarende, I. albumgenom manglede alle gener, der kræves til valin, leucin og isoleucin biosyntese fra pyruvat bortset fra forgrenet kæde amino transferase (ilvE), mens M. roseus og C. tepidum indeholder komplette veje. Hverken NICIL – 2 eller I. album koder for gener, der kræves til prolinbiosyntese fra glutamat (proBAC), mens både C. tepidum og M. roseus gør. Det serbiske gen til biosyntese af serin mangler i NICIL-2, I. album, M. roseus, og findes i nogle GSB, herunder C. tepidum. NICIL – 2 kan også bruge aminosyrer som vækstsubstrater. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). I stedet er størstedelen af gener arrangeret uafhængigt i det største NICIL – 2 stillads (nuoGHI, nuoJK, nuof, nuoD, nuoE og nuoMN), og de resterende gener findes på tre mindre stilladser (nuoAB, nuoL og nuoC), hvilket indikerer, at fraværet af en operonstruktur ikke er en samlingsartefakt. C. tepidum indeholder et sæt gener, der koder for NADH: allestedsnærværende oksidoreduktase, der mangler nuoEFG (11 underenheder). I. album og M. roseus indeholder to sæt nuoABCDHIJKLMN og et sæt nuoEFG hver (supplerende figur S6). Interessant nok er kompleks i fra NICIL – 2 mest beslægtet med Rhodothermus marinus og Salinibacter ruber af Bacteroidetes, som begge indeholder et komplet sæt gener til NADH:allestedsnærværende oksidoreduktase (figur 5a). Homologer til 11 komplekse i-underenheder blev også identificeret i alle seks NICIL-2-relaterede beholdere genvundet fra Gulsten og stor kogende forår, og en sammenkædet samling af disse proteinsekvenser grupperet med sekvenserne fra NICIL-2.

nabo sammenføjning unrooted sammenkædede protein træer af kompleks i (A) og alternativ kompleks III (b). Tal i parentes angiver antallet af underenheder, der bruges til at bygge træet. Skala bar angiver ændringer pr aminosyre site.

ACIII er en ny klasse af bakteriemembranoksidoreduktaser, der findes i organismer, der ofte mangler bc1-komplekset (Yanyushin et al., 2005). Aciii fra R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) og filamentøs fototrofisk bakterie Chlorfleksus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) er blevet renset og undersøgt. For nylig blev der fundet et stort antal genklynger, der koder for aciii-underenheder, med variationer i forfatning og organisation i en række bakterielle genomer (Refojo et al., 2013). For eksempel indeholder R. marinus generne actABCDEF i en operon, der koder for seks aciii-underenheder; homologer af denne genklynge er blevet identificeret i flere medlemmer af Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Et fylogenetisk træ skildrer forholdet mellem ACIII fra NICIL – 2 til dets nærmeste slægtninge (figur 5b). GSB besidder ikke ACIII, og derfor er de ikke repræsenteret i dette træ. ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, som ikke er medlem af GSB, koder imidlertid for en aciii, der sandsynligvis fungerer i aerob respiration (Liu et al., 2012b). Det er vigtigt at bemærke, at både I. album og M. roseus er unikke blandt dette sæt ACIII, da de indeholder fem underenheder, med actDE-underenhederne identificeret som et fusionsprotein. Et komplet komplement af gener, der koder for alle aciii-underenhederne, som blev genvundet fra to NICIL-2-relaterede genomb ‘ er fra Gulstenmetagenomer, viste sig at indeholde actDE-fusionen og grupperet med I. album og M. roseus. NICIL – 2 indeholder ikke denne fusion, og generne for dets Aciii-kompleks er tættere forbundet med R. marinus og S. ruber.

NICIL-2 terminale elektronacceptorer inkluderer en type-AA3 cytokrom C oksidase (kompleks IV) og mulige alternative cytokrom C oksidaser, kommenteret som Coksmop. NICIL – 2 er sandsynligvis ikke mikroaerofil, fordi Type cbb3-oksidaser ikke blev påvist i genomet. Derudover var cytochrom bd uopdaget. Til sammenligning indeholder både I. album og M. roseus-genomer gener for cbb3-type cytokrom C-oksidase og et cytokrom BD-kompleks.

NICIL-2 genomet indeholder et ufuldstændigt sæt mænds gener til syntese af menakinon. En komplet menakinon biosyntetisk vej indeholder menfdhcebag (Bentley og Meganathan, 1982), og NICIL-2 genomet inkluderer kun menBAG. Til sammenligning, C. tepidum og I. album indeholder komplette mænds veje, mens M. roseus og R. marinus genomer har kommentarer til alle krævede gener undtagen menB og menH, henholdsvis. Det er en af de mest almindelige årsager til denne sygdom, der er forbundet med den., 2011), blev uopdaget i NICIL-2. Allestedsnærværende biosyntetiske gener er også fraværende. NICIL – 2-genomet kan have ufuldstændig dækning i dette område, og yderligere mænds gener kan findes med et fuldstændigt samlet genom. Alternativt kan NICIL – 2 deltage i kvinonudveksling med andre medlemmer af samfundet, som observeret for det fototrofiske konsortium ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu et al., 2013).

Flagella og kemotakse

gener, der koder for proteiner til basallegemet, krogen og filamentsamlingen, er til stede i NICIL-2-genomet. Imidlertid mangler NICIL – 2 gener, der koder for kemotaksmaskiner, bortset fra et regulerende protein, CheY. GSB anses for at være ikke-bevægelig og mangler kemotakse og flagella, mens I. album, M. roseus og R. marinus har flagellære og kemotakse maskiner.