stabilisering af heterochromatin med ur fremmer stamcelleforyngelse og bruskregenerering

antistoffer

til vestlig blotting: anti-ur (#5157, 1:1.000), anti-HP1a (#2616s, 1:1.000) og anti-HP1y (#2619, 1:3.000) fra CELLESIGNALERINGSTEKNOLOGI; anti-kap1 (Ab22553, 1:2.000), anti-Lamin B1 (ab16048, 1:1.000) og anti-LBR (Ab32535, 1:1.000) fra abcam; anti-Kris-actin (SC-69879, 1:3.000) fra Santa Crus bioteknologi.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) Fra r&D systemer.

til strømningscytometri: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) og anti-CD19 (555415, 1:200) fra BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) og anti-pDPN (17-9381-42, 1:200) fra eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-cd29 (303004, 1:200) og anti-cd13 (301705, 1:200), anti-cd166 (343903, 1:200) og anti-cd164 (324805, 1:200) fra biolegend (San Diego, CA, USA).

cellekultur

CLOCK+/+ hESCs (hescs, line H9, Vicell Research Institute) og CLOCK−/− hESCs blev opretholdt på føderlag, der bestod af mitomycin C-inaktiverede musembryonale fibroblaster (MEFs) i hESC-dyrkningsmedium. HESC-dyrkningsmediet indeholdt DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut-Serumudskiftning (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM ikke-essentielle aminosyrer (Neaa ‘ er, Thermo Fisher Scientific), 2 mM Glutamaks (Thermo Fisher Scientific), 55 lp-mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) og 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Alternativt blev hESC ‘ er dyrket på Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-belagte plader i mTeSR medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

både hESC-afledte hmsc ‘er og primære hmsc’ er blev opretholdt i MSc-medium indeholdende MEMa (Thermo Fisher Scientific) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) og 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR/Cas9-medieret genredigering i hESCs

CRISPR/Cas9-medieret genredigering blev udført via tidligere beskrevne metoder med nogle modifikationer.33,34,65 kort sagt blev et guide-RNA rettet mod ekson 5 af ur (CLOCK-gRNA) klonet til en gRNA-kloningsvektor (#41824, Addgen) (supplerende information, tabel S1). Efter behandling med en ROCKINHIBITOR Y-27632 (S1049, Selleck) i 24 timer blev hESC ‘ er (5 liter 106) resuspenderet i 100 liter Opti-mem (Thermo Fisher Scientific) indeholdende plasmidcocktailen, som bestod af donorplasmidet indeholdende homologiarmene, CLOCK-gRNA og hCas9 (#41815, Addgen) og elektroporeret i et 4D-Nukleofektorsystem (Lone). Celler blev derefter podet på MEF-feederceller. G418 (100 liter/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) blev tilsat for at initiere positiv selektion 2-4 dage efter elektroporation. Efter 2 ugers udvælgelse blev G418-resistente kloner plukket og overført til en 96-brøndsplade for yderligere karakterisering og ekspansion. Genomisk PCR og vestlig blotting blev brugt til genomisk redigeringsidentifikation. Derudover fjernede vi neomycin-modstandskassetten i ur – / – hESC ‘ er via elektroporation med pCAG-FLpo-2a-puro-vektoren. Tre dage efter transfektion blev 1 liter/mL puromycin (Thermo Fisher Scientific) anvendt til at berige puromycin-resistente celler i 48 timer. efter 8-12 dages udvælgelse blev de nye kolonier plukket og udvidet til efterfølgende undersøgelse.

hmsc-generation og karakterisering

hmsc ‘er blev differentieret fra hESC’ er efter en tidligere offentliggjort protokol.25,86,87 kort sagt blev hESC ‘ er dissocieret i embryoide kroppe (EBs) og behandlet med differentieringsmedium (MEMa (Invitrogen) suppleret med 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm Neaa ‘ er (Thermofisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGF-liter og 1% penicillin/streptomycin (Gibco)) på Matrigelbelagte plader i 10 dage indtil 95% sammenløb. Derefter blev de sammenflydende MSc-lignende celler fordøjet og belagt på Matrigelbelagte plader behandlet med MSC-dyrkningsmedium indeholdende MEMa (Invitrogen) suppleret med 10% FBS, 0,1 mM Neaa ‘ er, 1 ng/mL bFGF og 1% penicillin/streptomycin (Gibco). Derefter blev de sammenflydende MSc-lignende celler passeret til gelatinebelagte plader. Hmsc ‘ erne blev oprenset med forskellige antistoffer svarende til hMSC-specifikke markører (CD73, CD90 og CD105) ved FACS. CD73 -, CD90-og CD105-triple-positive celler blev yderligere karakteriseret ved overfladeantigenmarkører, inklusive positive markører, såsom CD44, CD166, CD29, HLA-ABC og CD13, og negative markører, såsom CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 og PDPN. Funktionaliteten af hmsc ‘ er blev yderligere verificeret ved differentiering mod chondrocytter, adipocytter og osteoblaster. Osteoblasterne, chondrocytter og adipocytter afledt af hmsc ‘ er blev karakteriseret ved von Kossa-farvning (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) og osteocalcin-farvning (indikerer osteogenese), toluidinblå (T3260, Sigma) og aggrecan-farvning (indikerer chondrogenese) og Olierød o (O1391, Sigma) – farvning (indikerer adipogenese) efter producentens anvisninger.

isolering og kultur af primære hmsc ‘er

primære hmsc’ er blev isoleret fra tandkød fra forskellige individer.23,33,34,65 vævene adskilt fra gingivaen blev skåret i små (1 mm2) stykker ved hjælp af en saks i TrypLE. De fordøjede vævssuspensioner blev neutraliseret af MSC-dyrkningsmedium og centrifugeret ved 200 liter g i 5 minutter ved stuetemperatur. De resulterende pellets blev resuspenderet i MSc-dyrkningsmedium indeholdende MEMa (Invitrogen) suppleret med 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF og 1% penicillin/streptomycin (Gibco) og belagt på gelatinebelagte plader til vækst af primære hmsc ‘ er.

Luciferase reporter assay

per2-dluc plasmidet var en venlig gave fra E. E. Jang.88 celler, der huser PER2-dLuc, blev dyrket til sammenløb i 24-brøndskulturplader og synkroniseret med 20 karrm forskolin (S2449, Selleck) i 2 timer. mediet blev derefter erstattet med MSC-dyrkningsmedium indeholdende 0,25 mM luciferin (LUCK-1g, GoldBio). Celler blev overvåget i et LumiCycle-luminometer ved 37 liter C i 5-7 dage; de genererede data blev analyseret med LumiCycle-analyseprogrammet (Actimetrics). Dataene fra den første 24-h-cyklus blev udelukket fra vores statistiske analyse.

in vitro hmsc-synkronisering og cirkadisk analyse

hmsc ‘ er blev belagt på gelatinebelagte plader med MSC-medium indtil 95% sammenløb. Til synkronisering blev celler derefter behandlet med 20 liter Forskolin i 2 timer og opbevaret igen i MSC-medium efter vask to gange med PBS. Celler blev opsamlet startende fra 24 timer efter synkronisering med 3-h intervaller for 9 tidspunkter, efterfulgt af RNA-ekstraktion og RT-kpcr-detektion. Den ikke-parametriske test JTK_CYCLE blev brugt til at verificere cirkadiske svingninger som tidligere beskrevet.89 tidsforløbstråde af hmsc ‘ er med både p-og K-værdier < 0,05 blev betragtet som rytmiske.

vestlig blotting

celler blev lyseret i SDS-buffer indeholdende 4% SDS og 100 mm Tris-HCl. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved anvendelse af et BCA-kvantificeringssæt (Thermo Fisher Scientific), og ~20 liter protein pr.prøve blev udsat for SDS-side og elektrotransfereret til PVDF-membraner (Millipore). Derefter blev membraner blokeret med 5% mælk og inkuberet med primære antistoffer og derefter med peberrodsperidase (HRP)-konjugerede sekundære antistoffer. Immunoreaktive bånd blev visualiseret i et Chemidoc-system (Bio-Rad). Statistiske analyser blev kvantificeret ved hjælp af billede J (NIH). Hver gruppe havde tre uafhængige eksperimenter. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

transmissionselektronmikroskopi

sen passage (P9) ur+/+ og ur-/− hmsc ‘ er blev høstet ensymatisk med TrypLE (Thermo Fisher Scientific) og centrifugeret ved 500 liter g i 5 minutter ved stuetemperatur. De resulterende pellets blev fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 7,4) på is natten over. Celler blev efterfølgende dehydreret i en graderet serie af ethanoler, permeabiliseret og indlejret i Lavkrylharpiks HM20. Sektioner (200 nm) blev opnået og afbildet med et Spirit transmission electron microscope (FEI Company), der opererer ved 100 kV.

Immunofluorescensfarvning

celler podet på dækglas (Thermo Fisher Scientific) blev vasket to gange med PBS. Derefter blev cellerne fikseret med 4% PFA i 30 minutter, permeabiliseret med 0,4% Triton H-100 i PBS i 30 minutter og blokeret med 10% æselserum i PBS (Jackson Immuno Research) i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering blev celler inkuberet med primære antistoffer ved 4 kg C natten over. Derefter blev celler vasket tre gange med PBS, inkuberet med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time og vasket tre gange med PBS. Kerner blev farvet med Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Billeddannelse blev udført med et Leica SP5 konfokalt system. Statistisk analyse af antal, intensitet og område af fluorescenssignaler blev kvantificeret ved hjælp af billede J-program (NIH). Celler blev opsamlet fra tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test. 3D rekonstruktion af h3k9me3 farvning som vist i Fig. 2f blev udført ved seriel sektionering med 50 nm intervaller i en konventionel tilstand for op til 50 billeder med et Leica SP5 konfokalt system og yderligere behandlet til 3D-rekonstruktion af Imaris-programmet (version 7.4.2) som tidligere beskrevet.90

sa-karrus-gal-farvningsassay

sa-karrus-gal-farvning blev udført som beskrevet i tidligere undersøgelser.33,34 kort sagt blev cellerne fikseret med fikseringsbuffer (2% formaldehyd og 0.2% glutaraldehyd) i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev faste celler farvet med frisk farvningsopløsning ved 37 liter C natten over. Synsfelter blev tilfældigt udvalgt i hver brønd, og procentdelen af Sa-LARP-gal-positive celler blev bestemt ved hjælp af ImageJ-programmer. Hver gruppe havde tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

klonal ekspansionsanalyse

en klonal ekspansionsanalyse blev udført som tidligere rapporteret.34,65 kort sagt blev 6000 celler pr. brønd podet i 6-brøndsplader og dyrket i 9-12 dage. Celler blev vasket to gange med PBS, fikseret med 4% PFA og farvet med 0,2% krystalviolet i 1 time ved stuetemperatur. Synsfelter blev scannet af en scanner og yderligere målt af ImageJ (NIH). Hver gruppe havde tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

Co-IP

HEK293T celler transficeret med plasmider, der udtrykker Flag-Luc eller Flag-Ur og Hmsc ‘ er blev lyseret i CHAPS lysis buffer (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) og komplet proteasehæmmercocktail (Roche)) ved 4 liter C i 4 timer og blev derefter centrifugeret ved 14.500 liter g ved 4 liter C i 40 minutter. For Co-IP med eksogene proteiner blev supernatanterne blandet med Anti-Flag antistof-koblede perler (a2220, Sigma) og roteret natten over ved 4 liter C. For Co-IP med endogene proteiner blev supernatanterne blandet med de angivne antistoffer natten over ved 4 liter C med rotation og blev derefter inkuberet med Protein A/G-PLUS Agaroseperler (sc-2003, Santa Cruce) i yderligere 4 timer ved 4 liter C med rotation. Perlerne blev vasket seks gange med CHAPS buffer og derefter elueret med Flag peptider eller ved kogning i 1 liter SDS lastning buffer til 10 min for vestlige blotting.

LC-MS/MS-analyse og proteinidentifikation

de eluerede proteiner opnået ved immunudfældning blev udsat for 10% SDS-side og farvet med coomassie strålende blå (VB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Gelbåndene indeholdende proteinprøverne blev udskåret, skåret i små propper, dehydreret (100% acetonitril), reduceret (10 mM DTT i 25 mM NH4HCO3 i 45 minutter ved 56 liter C) og alkyleret (40 mM iodacetamid i 25 mM NH4HCO3 i 45 minutter ved stuetemperatur i mørke). Derefter blev gelpropperne tørret og fordøjet med modificeret trypsin af sekventeringskvalitet (40 ng pr.bånd) i 25 mM NH4HCO3 natten over ved 37 liter C. endelig blev myresyre til en 1% endelig koncentration anvendt til at afslutte den endelige reaktion. Den resulterende opløsning blev derefter overført til et prøvehætteglas til LC-MS/MS-analyse.

nanolc-MS/MS-eksperimenterne blev udført på et krævende massespektrometer (Thermo Scientific) i dataafhængig tilstand, hvilket tillod MS-dataindsamling i en høj opløsning på 70.000 (m/å 200) på tværs af et m/å-interval på 300-1.600. De rå data fra den nøjagtige analyse blev analyseret med proteom Discovery (version 1.4) ved hjælp af Sekvest-ht-søgemaskinen til proteinidentifikation og percolator for false discovery rate (FDR) – analyse. Dataene blev søgt mod UniProt human protein database (opdateret den 06-2013). FDR-analyse blev udført med Percolator, og FDR < 1% blev sat som tærsklen for proteinidentifikation. Peptidtilliden blev sat til høj til peptidfiltrering.

RT-kpcr og RNA-sek

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede humane celler eller musefuger ved hjælp af Trisol (Thermo Fisher Scientific), og genomisk DNA blev fjernet ved hjælp af et DNA-frit sæt (Thermo Fisher Scientific). cDNA blev genereret med GO Script Reverse transskription System (Promega). RT-kpcr blev udført ved hjælp af Kpcr-blanding (Toyobo) i et CF-384 realtidssystem (Bio-Rad). Hver gruppe havde fire godt replikater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test. Alle RT-kpcr-eksperimenter blev udført med mindst tre eksperimentelle replikater og uafhængigt gentaget i mindst to gange. RNA-prøver fra knæleddet fra den samme behandlingsgruppe af ældre mus injiceret med lentivirus, der udtrykker Luc (n = 12 mus) eller ur (n = 12 mus) blev blandet ligeligt i masse, og RNA-sekv blev udført med to tekniske replikater. To biologiske replikater blev undersøgt. Et sekventeringsbibliotek blev konstrueret ved hjælp af en Nebnæste Ultra RNA Bibliotek Prep Kit til Illumina efter producentens protokol. De genererede biblioteker blev sekventeret på Illumina hisek ti platforme med parret sekventering med 150-bp læselængder. Kvalitetskontrol og sekventering blev udført af NoVo gen Bioinformatik teknologi. Primere anvendt til kpcr blev vist i supplerende oplysninger, tabel S2.

RNA-sek databehandling

RNA-sek databehandling pipeline er blevet rapporteret tidligere.34 rå parrede ende læser blev trimmet i Trim Galore program (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Rene læsninger blev kortlagt til UCSC human hg19 genom eller mus mm10 genom ved hjælp af hisat2 (version 2.0.4).91 sam-filerne blev konverteret til bam-filer af SAMtools med parameteren “- S-B-K 10”.92 derefter blev læsetællinger beregnet af Htsek (version 0.11.0), og kun kortlagte læsninger af høj kvalitet (kortlægningskvalitet > 20) blev bevaret.93 fragmenterne pr. Kilobase pr.Million (Fpkm) værdi for hvert gen blev beregnet ved hjælp af StringTie (version 1.2.3).94 differentielt udtrykte gener (DEGs) blev beregnet ved hjælp af Desek2-pakke (version 1.22.2) med afskæringen “K-værdi (justeret p-værdi, padj) < 0,05 og |log2 (foldændring)| > 1 for hMSCs eller |log2 (foldændring)| > 0,5 for musefuger”. Gen ontologi (GO) berigelsesanalyse blev udført med Toppgen.95 gensæt berigelsesanalyse blev udført af GSEA (version 2.2.4). SASP gensæt blev opnået fra en tidligere undersøgelse.42

DamID-seks

Plgv V5-EcoDam og Plgv EcoDam-V5-EMD var gaver fra Prof. Bas van Steensel (det nederlandske Kræftinstitut (NKI)). DamID-sek blev udført som beskrevet, 58 med modifikationer. Kort sagt blev dæmningen og dæmningen-EMD lentivirus genereret fra HEK293T-celler koncentreret ved ultracentrifugering ved 19.400 liter g i 2,5 timer. viruspellets blev resuspenderet i PBS. CLOCK+/ + og CLOCK – / – hMSCs blev podet i seks-brønds retter på 2 til 105 celler pr. Hver gruppe havde tre biologiske replikater. Den næste dag blev dyrkningsmediet erstattet med 2 mL frisk dyrkningsmedium indeholdende enten Dam eller Dam-EMD lentivirus. Ved 72 timer efter transduktion blev celler høstet, og genomisk DNA blev isoleret ved hjælp af et DNA-blod & Vævssæt (69504, Chiagen). Dpni (R0176S, Ny England Biolabs) fordøjelse, adapterligering, dpnii (R0543S, Ny England Biolabs) fordøjelse, PCR-amplifikation og oprensning blev udført som tidligere beskrevet.58 til adaptertrimning blev det forstærkede DNA sonikeret og fordøjet med Alvi (R0513s, Ny England Biolabs). DNA-biblioteket blev konstrueret ved hjælp af en Nebnæste Ultra DNA Bibliotek Prep Kit til Illumina (E7370S, Ny England Biolabs). Bibliotekerne blev samlet og udsat for parret sekventering med 150-bp læselængder på Illumina Novaseksekvensere.

DamID-sek databehandling

rå aflæsninger af Dam-og Dam− EMD− data for CLOCK+/+ og CLOCK – / – hmsc ‘ er blev trimmet i Trim Galore-programmer (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmede læsninger blev kortlagt til UCSC human hg19 genom ved hjælp af Butterfly 2 (version 2.2.9).96 PCR-duplikater blev fjernet med Mærketduplikater.jar program i Picard værktøjer. Derefter blev læser sorteret med SAMtools (version 1.6). For at minimere effekten af sekventering bias og dybde, behandlet læser fra tre replikater for hver prøve blev fusioneret. Derefter blev det samme antal (110 millioner) af høj kvalitet læser for hver celletype tilfældigt udvalgt til nedstrøms analyse. For at visualisere DamID-signalerne beregnede vi log2-forholdet mellem aflæsningerne pr.Kilobase pr. Million kortlagte aflæsninger (Rpkm) af Dam− EMD og Dam− signalerne (log2 (Dam-EMD/Dam)) i CLOCK+/+ og CLOCK-/-hMSCs for hver 10-bp bin ved hjælp af bamCompare-programmet i deeptools (version 2.5.4-2-5ee467f).

til identifikation af LAD regioner i CLOCK+ / + og CLOCK – / – hMSCs, vi først beregnet DamID signaler (log2 forholdet mellem Rpkm af Dam-EMD og Dam signaler (log2 (Dam-EMD/Dam)) i CLOCK+/+ og CLOCK−/− hMSCs for hver 2-kb bin ved hjælp af bamCompare program i deeptools (version 2.5.4-2-5ee467f) programmel. Derefter implementerede vi r-pakken til skjulte Markov-modeller med T-emissioner (hmmt) (version 0.1) for at identificere gutter (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

for at sammenligne DamID-signalerne i LAD-regioner mellem CLOCK+ / + og CLOCK−/− hmsc ‘er fusionerede vi LAD− regioner identificeret i CLOCK+/+ og CLOCK−/− hmsc’ er til union− dem og beregnede det relative DamID-signal (DamID-signal i CLOCK – / – hmsc ‘er minus DamID-signal i CLOCK+/+ hmsc’ er) for hver union LAD-region. Derefter blev de relative DamID-signaler for LAD-regioner afbildet ved hjælp af R-pakke RIdeogram (version 0.2.2), som vist i supplerende information, Fig. S4d.97

ChIP-kpcr og ChIP-sekv

kort sagt blev 1 lp 106 ur+/+ og ur−/− hmsc ‘ er tværbundet i 1% (vol/vol) formaldehyd i PBS i 8 minutter ved stuetemperatur, og reaktionen blev afsluttet ved inkubation med 125 mM glycin i 5 minutter ved stuetemperatur. Prøver blev derefter lyseret på is i yderligere 10 minutter. Efter sonikering i Covaris S220 fokuseret ultralyd (Covaris) og centrifugering i 10 minutter ved 12.000 liter g ved 4 liter C blev supernatanter inkuberet natten over ved 4 liter C med Protein A Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004d) konjugeret med et anti-ur antistof, et anti-H3K9me3 antistof eller kanin IgG. Efterfølgende blev eluering og omvendt tværbinding udført ved 68 liter C i 2 timer i en termomikser. Derefter blev DNA isoleret via phenol-chloroform-isoamylalkoholekstraktion og ethanoludfældning. Det rensede DNA blev udsat for kpcr til evaluering af ur-eller h3k9me3-besættelse ved gentagne sekvenser. De berigede fragmenter blev konstrueret til biblioteker uden inkorporering af spike-in-kontroller via KAPA Hyper Prep-sæt med PCR-Biblioteksforstærkning/Illumina-serien (KK8504, Ny England Biolabs) efter producentens anvisninger. Alle forsøgene blev udført mindst to gange med lignende resultater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

ChIP-sek databehandling

til behandling af H3k9me3 ChIP-sek data, rå læser blev trimmet med Trim Galore program (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmede læsninger blev kortlagt til UCSC human hg19 genom ved hjælp af Butterfly 2 (version 2.2.9).96 duplikerede læsninger blev fjernet med Mærketduplikater.jar program i Picard værktøjer. Derefter blev læser sorteret med SAMtools (version 1.6). For at minimere effekten af sekventering bias og dybde, behandlet læser fra tre replikater for hver prøve blev fusioneret. Derefter blev det samme antal (130 millioner) af høj kvalitet læser for hver celletype tilfældigt udvalgt til nedstrøms analyse. For at visualisere ChIP-sekv-signalerne beregnede vi de normaliserede læsetællinger ved at bestemme rpkm-værdierne for hver 10-bp bin. Til h3k9me3 peak calling blev SICER (version V1.1) brugt med parameteren “-H 200-g 3”.98 kun kaldet H3K9me3 toppe med en cutoff FDR på 1% eller højere blev bevaret.

til identifikation af “h3k9me3-bjerge” blev h3k9me3-signalet i antal pr. Vi rangerede derefter h3k9me3-toppe i rækkefølgen af stigende h3k9me3-signal og afbildede h3k9me3− Chip− sek-belægning i ur+/+ og ur – / – hMSCs, som vist i supplerende information, Fig. S4f. disse grunde viste et klart punkt, hvor h3k9me3-belægningssignalet begyndte at stige hurtigt. Derefter blev bøjningspunkterne for disse kurver bestemt. Vi definerede yderligere h3k9me3-toppe over bøjningspunkterne som” H3K9me3-bjerge ” og H3K9me3-toppe Under disse punkter som typiske h3k9me3-toppe.

ATAC-sek

ATAC-sek blev udført som beskrevet tidligere.99 kort sagt blev i alt 50.000 celler vasket to gange med PBS og resuspenderet i 50 liter lysisbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) Nonidet P40 erstatning). Suspension af kerner blev derefter centrifugeres ved 500 x g i 10 minutter ved 4 °C, efterfulgt af tilsætning af 50 µL af gennemførelse reaction mix (10 µL 5 × TTBL buffer, 4 µL TTE mix og 36 µL nuclease-gratis H2O) fra en TruePrep DNA-Bibliotek Prep V2 Kit for Illumina (Vazyme Biotek). Prøver blev derefter inkuberet ved 37 liter C i 30 minutter. Bibliotekerne blev derefter forstærket og oprenset ved hjælp af TruePrep DNA Library Prep Kit V2 til Illumina. Bibliotekets kvalitet blev vurderet ved hjælp af en fragmentanalysator. Endelig blev biblioteker sekventeret på Illumina hisek ti platforme med parret sekventering med 150-bp læselængder.

ATAC-sek databehandling

til behandling af ATAC-sek-data blev rålæsninger trimmet med Trim Galore-program (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmede læsninger blev kortlagt til UCSC human hg19 genom ved hjælp af Butterfly 2 (version 2.2.9) med parameteren “-2000-N 1-L 25 –ikke-blandet –ikke-uoverensstemmende-t”.96 Duplikatlæsninger blev fjernet med Mærketduplikater.jar program i Picard værktøjer. Derefter blev læser sorteret med SAMtools (version 1.6). Derefter blev behandlede læser fra tre replikater for hver prøve fusioneret. For at visualisere ATAC-signalerne udvidede vi hver læst med 250 bp og normaliserede læsetællingerne med rpkm-værdien for hver 10-bp bin. Til ATAC peak-opkald blev MACS2 (version 2.1.1.20160309) brugt med parameteren “–nomodel –shift 0 –udvidelse 250 –call-summits”.100 kun kaldet ATAC-toppe med K-værdier < 0,01 blev bevaret. ATAC-toppe identificeret i ur+/+, men ikke i ur−/− hmsc ‘ er blev defineret som “lukkede” atac− toppe; atac− toppe identificeret i ur – / – men ikke i ur+ / + hmsc ‘ er blev defineret som “åbnede” atac-toppe. Estimering af den genomiske fordeling af anvendte ATAC-toppe annotatePeaks.pl program i homer.101

vurdering af reproducerbarheden af sekventeringsdataene

for at evaluere reproducerbarheden af H3k9me3-ChIP-sekv-og ATAC-sek-data blev den euklidiske afstand mellem replikater beregnet som følger: læser blev talt og normaliseret af RPKM på en 2-kb bin størrelse. Derefter blev den euklidiske afstand beregnet i R (version 3.5.1) for at evaluere reproducerbarheden. Lavere euklidiske afstande betyder højere korrelationer. For at vurdere reproducerbarheden af data blev principal component analysis (PCA) udført i R (version 3.5.1). For at evaluere reproducerbarheden af RNA-sekv-data blev scatter-plots tegnet baseret på den regulerede logaritme (rlog)-normaliseret læsetælling med Desek2, og Pearson-korrelationskoefficienten mellem replikater blev beregnet.

dyreforsøg

til analyse af teratomdannelse, NOD/SCID-mus (6-8 uger gamle, købt fra Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) blev injiceret med 3 liter 106 ur+/ + eller ur− / − hESCs i en Matrigel: mTeSR (1:4) opløsning. Teratomer blev høstet 8-12 uger efter injektion til yderligere analyse.

til hmsc− transplantationsanalyser blev 1 luth 106 CLOCK+/+ eller CLOCK−/ – hmsc ‘ er transduceret med lentivirus, der udtrykte Luc, injiceret i Ta-muskelen hos nøgne mus (6-8 uger gamle). Mus blev derefter behandlet med D-luciferin (LUCK-1g, GoldBio) og afbildet med et iVis-Spektrumbilleddannelsessystem (Ksenogen, Caliper, Valtham, MA, USA). Bioluminescensbilleder blev erhvervet i” auto ” – tilstand. Hver gruppe havde seks biologiske replikater. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

til den aldringsassocierede urniveaudetektion blev mus i forskellige aldre (unge, 1 måned, n = 5 mus; gamle, 15 måneder, n = 10 mus) aflivet, og leddene blev opsamlet til RT-kpcr-analyse. Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

for at evaluere, om lentiviral administration af CLOCK kunne lindre aldringsrelaterede syndromer, blev lentivira, der udtrykte Luc (n = 14 mus) eller CLOCK (n = 13 mus) injiceret i ledhulrummene hos 18 måneder gamle mus (købt fra SPF (Beijing) bioteknologi) og genopfyldes efter 8 ugers injektion. Løbebåndseksperiment blev udført på tidspunktet for 15 uger efter den første injektion af lentivira, der udtrykte Luc eller CLOCK. I detaljer blev mus trænet på en tredemølle (SA101, SANS) med en hældning på 5 liter over 3 dage i 20 minutter hver dag, med hastigheden accelereret fra 0 til 20 m/Min. På testdagen løb musene på løbebåndet med en starthastighed på 0 m/min, og derefter blev hastigheden øget med 2 m/min til 20 m/Min. Hele driftstiden blev sat til 20 min. Hyppigheden af mild elektrisk stødstimulering blev registreret og analyseret (Luc, n = 14 mus; ur, n = 13 mus). Mikro-CT-scanning blev udført på tidspunktet for 16 uger efter den første injektion (Luc, n = 14 mus; ur, n = 13 mus). Mus blev derefter aflivet, og leddene blev opsamlet til histologisk vurdering (Luc, n = 14 mus; ur, n = 13 mus) og mRNA-kvantificering (Luc, n = 12 mus; ur, n = 12 mus). Statistiske signifikanser blev vurderet ved en to-tailed uparret studerendes t-test.

histologi og immunhistokemi

til histologisk analyse blev høstede musefuger fikseret med 4% PFA i 2 dage og indlejret i paraffin efter afkalkning i 14-21 dage. Sektioner (5 liter) blev farvet med hurtig grøn FCF (0,02%) og safranin O (0.1%) i henhold til producentens anvisninger.

immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af DAB-farvningsmetoden som tidligere beskrevet med nogle modifikationer.33,34,102 for det første blev dias deparaffiniseret og rehydreret ved hjælp af kylen og forskellige koncentrationer af alkohol. Antigenudtagningen blev udført under anvendelse af trypsin (SLI-9010, SSGB-BIO) fordøjelse i 20 minutter ved stuetemperatur. Brintoverilte (3%) blev anvendt til at blokere endogen peroksidaseaktivitet ved inkubation i 10 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter blokeret med 10% æselserum i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med et anti-P16-antistof (Ab54210, Abcam, 1:200) ved 4 liter C natten over og med et sekundært antistof (PV-6002, SSGB-BIO) i 1 time ved stuetemperatur før DAB-farvning (SLI-9017, SSGB-BIO).

etiske erklæringer

eksperimenterne involveret i denne undersøgelse fulgte principperne for Ansøgningsformatet for etisk godkendelse til forskning, der involverede dyr, og blev godkendt på forhånd af Institut for dyrepleje og Brugsudvalg (Kinesisk videnskabsakademi). Anæstesi af mus blev udført med isofluran, og eutanisering blev udført med CO2 efterfulgt af cervikal dislokation.

statistisk analyse

statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prismeprogrammet Graph-Pad. Data præsenteres som middel til sem eller SD. Sammenligninger blev udført med to-tailed uparret studerendes t-test. P-værdi (p) < 0,05 blev defineret som statistisk signifikant.